연구 상 번호 R01CA174385에 따라 국립 보건원 국립 암 연구소에 의해 지원 된이 출판물에보고했다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 전망을 대표하지 않습니다.

1. 시약 준비 <ol><li> 500 ML RPMI-1640 5 ML을 혼합하여 RPMI-PLGH을 준비 페니실린 - 스트렙토 마이신, L-글루타민, 그리고 HEPES 솔루션의 각. </li><li> 10% 태아 소 혈청 (FBS)와 RPMI-PLGH을 혼합하여 R10 솔루션을 준비합니다. FBS는 또한 30 분에 대한 ° C 이전 56에서 열 inactivated입니다. </li><li> 37 번 프리 따뜻한 ° C RPMI-PLGH, 멸균 원추형 튜브의 R10 15 PBS의 ML, 15 ML 50 ML. </li><li> PDMS의 nanowells의 배열의 제조 : 실리콘 마스터는 석판 술 본질적으로 이전 10 설명을 사용하여 제조된다. 철저하게 플라스틱 칼을 사용하여 Sylgard 184 엘라스토머 키트베이스와 일회용 컵에 10시 1분 체중의 비율로 경화 에이전트를 섞는다. 1 시간의 진공 챔버에서 가스를 제거하다의 혼합물. , nanowell 배열에 혼합물을 부어 유리 슬라이드로 밀봉하고 30 분에 앉아 보자. ° C 2 시간 80로 설정 오븐에 어셈블리를 전송하고 1 시간 동안 실온에서 시원한 보자. 엘라스토머는 현재 것이다이 기간과 의지의 유리 슬라이드에 결합시 전자. PDMS nanowell 배열을 포함하는 유리 슬라이드는 신중하게 스카치 테이프로 덮여와 미래의 사용까지 저장, 실리콘 마스터를 해제됩니다. </li></ol> 2. 대상 셀 (T) 라벨링 <ol><li> 5 분에 340 XG에서 원심 분리하여 살균 15 ML 원뿔 튜브에 hemocytometer 및 펠렛 세포를 사용하여 세포 배양에서 5,000,000 대상 셀을 계산합니다. 세포 배양은 5 ML 총 볼륨 (밀도 = 1,000,000 / ML)에 전날 분할 및 T-25 플라스크 (VWR)에서 배양되어 있습니다. hemocytometer를 사용하여 셀 계산을위한 프로토콜은 이전에 11에 자세히 설명되어 </li><li> 미디어의 약 50 μl을 남기지 초과 미디어를 대기음. </li><li> (최종 농도 2.5 μM) 150 μl RPMI-PLGH에 0.5 μl CTR 재고 (1 MM)를 혼합하여 셀 추적 레드 (CTR)의 작업 솔루션을 준비합니다. 대상 셀에 작업 솔루션 150 μl를 추가하고 P200의 피펫을 사용하여 철저하게 섞는다.반면, PKH 26 (2 μm의 최종 농도) 제조업체의 지시에 따라 라벨을 대상 셀을 사용할 수 있습니다. </li><li> 20 분에 37 ° C / 5% CO 2 품다. </li></ol> 3. 효과기 (E) 셀 라벨링 <ol><li> 5 분에 340 XG에서 원심 분리하여 살균 15 ML 원뿔 튜브에 hemacytometer 및 펠렛 세포를 사용하여 세포 배양에서 5,000,000 효과기 세포를 계산합니다. </li><li> 초과 미디어를 대기음 </li><li> R10 미디어 1 ML (5 μm의 최종 농도)에 5 밀리미터 Vybrant 바이올렛 주식 1 μl를 추가하여 Vybrant DyeCycleViolet 얼룩 솔루션의 작동 솔루션을 준비합니다. 셀에 작업 솔루션을 추가하고 P200 피펫을 사용하여 resuspend. 반면, PKH 67 (2 μm의 최종 농도) 제조업체의 지시에 따라 라벨을 대상 셀을 사용할 수 있습니다. PKH 67를 사용하는 경우이 동일한 형광 채널에 있기 때문에 다음 SYTOX 그린은 사용할 수 없습니다. apoptotic 대상의 열거는 독점적를 사용하여 수행됩니다이 경우 nnexinV의 착색. 참고 : 시간 경과가 아닌 엔드 포인트 측정을 수행하는 경우, Vybrant 누나 같은 UV 염료는 피해야한다. </li><li> 20 분에 37 ° C / 5% CO 2 품다. </li></ol> 4. 밀도 기울기를 사용하여 라이브와 죽은 세포의 분리 <ol><li> 각각 대상과 효과기 세포에 6.8 ML 및 RPMI-PLGH의 6.0 ML를 추가하고 부드럽게 등을 아래로 pipetting하여 섞는다. </li><li> FICOLL - Paque 플러스 목표와 효과기 세포를 포함하는 각 원뿔 튜브의 하단까지의 레이어 3.5 ML. 레이어 FICOLL 천천히 FICOLL와 미디어 사이의 층을 잘 형성을 보장합니다. </li><li> 30 분에 340 XG에 두 튜브를 원심 분리기. 노 브레이크 및 가속을 갖추고 있습니다. </li><li> 원심 분리하는 동안 4도 판에 사전 예열 PBS 7 ML을 전송하기 만하면됩니다. nanowell 배열 (PDMS에 가공) 준비 : 에탄올과 유리 슬라이드의 깨끗한 바닥을 1 분 동안 플라즈마 산회 제를 사용하여 높은 R​​F 설정에서 PDMS를 산화. 이 단계는 아닌지 것또한 친수성 ​​PDMS를 렌더링하는 동안 nanowell 배열을 rilize. 즉시 PBS를 포함하는 판에 nanowell 배열을 이동합니다. </li><li> 바이오 안전성 캐비닛에 판을 송금 초과 PBS를 대기음. 30-45 초 다음은 10 ML DI 물과 전자 레인지가 그에 100 MG 한천 가루를 추가로 10 ML 1% 고귀한 한천을 만듭니다. 배열을 고정하고 더욱 강화하기 위해 한천 10 분을 기다려야하는 nanowell 배열을 포함하고 유리 슬라이드의 상단과 하단 가장자리에서 1 % 귀족 한천을 따뜻하게 적용합니다. 3 ML PBS 및 기음 초과 한천을 추가합니다. </li><li> nanowell 배열의 상단에 R10의 3 ML을 추가하고 ~ 10 분 동안 평형을 보자. </li><li> 원심 분리를 FICOLL 이후에, 각 튜브의 상단 층에서 5 ML 미디어를 대기음. 세포를 포함하는 레이어를 대기음하지 않도록주의하십시오. </li><li> P1, 000 피펫과 새로운 멸균 원뿔 튜브로 이동이있는 FICOLL과 미디어 사이의 레이어 1-2 ML을 복구하여 세포를 (흰색 레이어) 수확. 그게 당신 맥심 확인하는 동안 세포의 두 세트에 대해이 단계를 반복복구 세포를이지는. </li><li> 전체 가속 및 브레이크를 5 분에 340 XG에서 원심 분리하여 pipetting과 펠릿의 각 튜브, 혼합에 사전 예열 RPMI-PLGH 3 ML을 추가합니다. </li><li> 초과 미디어를 대기음, 각 튜브에 사전 예열 RPMI-PLGH 5 ML을 추가하고 5 분에 340 XG에서 원심 분리를 반복합니다. </li><li> 초과 미디어를 기음과 R10 500 μl의 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> hemacytometer에 Trypan 파랑 제외 방법을 사용하여 라이브 셀을 계산합니다. </li></ol> 5. Nanowell 배열로 셀 로딩 <ol><li> nanowell 배열에서 초과 미디어를 기음과 배열에 걸쳐 신선한 R10의 2 ML를 추가합니다. nanowell 배열의 맨 그것이 세포의 분포에 영향을 미칠 것이기 때문에 너무 무리 / 건조되지 않았는지 확인하는 동안 다시 대기음. </li><li> nanowell 어레이 표면에 R10 200 μl에 보증금 1 개 10 5 효과기 세포 (밀도 = 5 × 10 5 세포 / ML). </li><li> 세포가 5 분에 정착, 실내에 표준 조직 문화 현미경 검사를 사용하자세포의 분포가 바람직하다 있는지 확인합니다. 필요한 경우 더 많은 셀을 추가 할 수 있습니다. </li><li> 보증금 1 개 10 nanowell 어레이 표면에 200 μl R10 5 대상 세포 (밀도 = 5 × 10 5 세포 / ML). </li><li> 세포가 5 분 및 세포의 분포가 바람직하다 수 있도록 표준 조직 문화 현미경 검사를 사용하기위한 해결하자. 필요한 경우 더 많은 셀을 추가 할 수 있습니다. </li><li> 2 ML R10 및 기음 초과 미디어와주의 깊게 nanowell 배열을 씻어. </li><li> 15 ML 원뿔 튜브를 멸균에서 3 ML 미리 예열 R10를 준비합니다. 얼룩 0.5mM SYTOX 그린 핵산 3 μl (최종 농도 0.5 μM) 및 작업 솔루션을 준비하는 Annexin V-알렉사 형석 647의 60 μl를 추가합니다. 세포가 우물에서 변위되지 않도록하는 동안주의 깊게 4도 판로 작업 솔루션을 추가 할 수 있습니다. </li><li> 15 분에 37 ° C / 5% CO 2 품다. </li></ol> 6. 영상 1 <ol><li> 형광 micr를 사용하여 nanowell 배열의 이미지를 취득oscope :이 예제에서, 우리는 동력 무대와 람다-DG4을 갖추고 Z-1 현미경 ZEISS의 옵저버를 사용합니다. </li><li> 소프트웨어 및 현미경을 초기화하고 전송 빛과 다른 형광 채널에 신호 강도를 확인합니다. 전반적으로,에 대응하는 다섯 채널을있을 것입니다 : 전송 빛, Annexin V-647 (Cy5 필터), CTR (DsRed 필터), SYTOX 녹색 (FITC 필터) 및 Vybrant 바이올렛 (DAPI 필터). 이 채도를 피하는 동안 소음에 최대 신호를 보장하기 위해 설정 현미경 있는지 확인합니다. </li><li> X와 nanowell 배열에 대한 Y 위치를 설정합니다. 제로 위치를 설정하고 nanowell 배열 스탬프의 왼쪽 상단 모서리에 7 X 7 nanowell 배열 블록의 중심에 초점을 초기화하여 과정을 시작합니다. 정확하게 각 블록에 포커스를 반영하기 위해 각 블록의 센터와 Z-값으로 일치 할 수있는 X, Y 위치를 설정합니다. </li><li> 위치 및 초점 준비되면, 선형 모드에서 이미지 획득을 설정하고 이미지를 획득해야합니다. <s&gt; 참고 trong : 현미경의 보육과 CO 2에 필요한 회전 적어도 30 분 실험 전에합니다. </li></ol> 7. 후 영상 6 시간을위한 인큐베이터 (37 ° C / 5퍼센트 CO 2)로 nanowell 배열을 포함하는 4 잘 판을 전송합니다. 8. 영상이 6 단계에서 설명한대로 시간이 지점 두 번째에서 이미지를 획득. 9. 이미지 분석 <ol><li> nanowells 내에서 세포의 수용 인원은 적절한 이미지 분할 프로그램 사용 (예 : ImageJ에 의해 결정됩니다 <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) 기본적으로 이전에 9,12 설명했다. </li><li> 현미경 이미지 (t = 0 시간, t 0)의 초기 집합의 분석은 정확히 하나의 라이브 대상 셀을 (식별이 포함 된 개인 nanowells의 데이터베이스를 생성하는 데 사용됩니다로 레드 CellTracker, 빨간색)없이 죽은 세포 (Annexin V의 착색에 의해 식별, 녹색) [T1t 0 nanowells]. </li><li> 현미경 이미지 (t = 6 시간, t 6)의 두 번째 세트의 분석. 독립적 한 대상 셀 (빨간색) [T1t 6 nanowells]를 포함하는 nanowells의 두 번째 데이터베이스를 결정하는 데 사용됩니다 무결성 검사 (데이터베이스 쿼리)는 t 0의 모든 라이브 타겟이 일치하는 타겟의 최종 세트를 (T1t 0 T1match로 지정 = T1t 6 있습니다 nanowells로 구현) 생산 t 6에서 목표에 일치되는 것을 보장하기 위해 구현됩니다 </li><li> nanowells의 이펙터 세포의 수는 t 0 [E1 nanowells]에 Vybrant 보라 착색을 사용하여 결정됩니다 </li><li> 데이터베이스 쿼리는 (E1T1로 지정된 E1 및 T1 경기를 nanowells으로 정의), 하나의 목표로 공동 incubated 하나 effectors를 포함하는 nanowells를 식별하는 구현 </li><li> 이펙터 유도 apoptosis는 내가이 점수는<html> t 0과 긍정적 인 Annexin V t 4에 (t 6에서 Annexin V 대상 착색과 E1T1)에서 제외 Annexin V 아르 목표를 dentifying. </li></ol> 10. 니콘의 BioStation IM을 사용하여 살인의 선택 시간 경과 영상 <ol><li> coverslip 바닥과 페트리 접시를 타고 정확히 coverslip에 맞게됩니다 nanowell 배열 칩의 작은 조각을 (5 단계에서 작성) 잘라. 깍 칩이 젖었 유지 있는지 확인하십시오. </li><li> 믹스 1 개 10 6 목표 및 100 μl 미디어 1 개 10 6 T 세포, 그리고 coverslip에 그것을 피펫. </li><li> 15-30 분 정도의 세포가 정착하게 할 수 있습니다. </li><li> 신속 작은 nanowell 어레이 칩을 반전하고 coverslip에 배치. </li><li> 칩이 칩의 상단에 이미지, 장소 중에 하나 또는 두 개의 20mm X 20mm coverslips을 이동할 수 없습니다되도록하기 위해. 요리의 맨 아래에있는 칩을 밀어 부드럽게 압력을 적용합니다. </li></ol>십t &quot;&gt; 참고 : nanowell 어레이 칩의 바닥 고해상도 영상에 비해 너무 두꺼운이므로 뒤집어졌다되어야이 동안, 세포의 많은 쓸려있는이 단계 9.2에서 쉽게 제어, 세포 숫자가 될 수 없기 때문에.. 및 단계 9.3에서 부화 시간은 최적화해야합니다.

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	<li>Louis, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+activity+and+long-term+fate+of+chimeric+antigen+receptor-positive+T+cells+in+patients+with+neuroblastoma.">Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma.</a> Blood. 118, 6050-6056 (2011).</li><li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD28+costimulation+improves+expansion+and+persistence+of+chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+lymphoma+patients.">CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients.</a> J. Clin. Invest. 121, 1822-1826 (2011).</li><li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+with+chimeric+antigen+receptors+have+potent+antitumor+effects+and+can+establish+memory+in+patients+with+advanced+leukemia.">T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia.</a> Sci. Transl. Med. 3, 95ra73 (2011).</li><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor-Modified+T+Cells+in+Chronic+Lymphoid+Leukemia.">Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia.</a> N. Engl. J. Med. , (2011).</li><li>Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. 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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

우리는 nanowells의 배열 (그림 1) effectors 및 대상의 공동 배양을 통해 활성화 높은 처리량 단일 셀 cytolytic 분석을위한 프로토콜을 설명하고 있습니다. 처리량뿐만 아니라 기술의 주요 장점은 결과적으로 대상 셀과 autologous 또는 기본 / 검색 종양 세포의 사용을 허용 대상 세포 공학 필요없이 원하는 대상 세포에 대한 이펙터로 인한 세포 독성을 모니터링 할 수있는 기능입니다. 공간 제?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> RPMI-1천6백40와트 / O L-글루타민 </td><td> Cellgro </td><td> 15-040 - CV </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 </td><td> Cellgro </td><td> 30-002 - CI </td><td> 10,000 IU 페니실린 10,000 μg / ML 스트렙토 마이신 </td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> Cellgro </td><td> 25-005 - CI </td><td> 200 MM 솔루션 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> H3537 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 (FBS) </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S11150 </td><td> 롯 테스트 </td></tr><tr><td> 셀 추적기 레드 청바지 </td><td> Invitrogen </td><td> C34552 </td><td> 50 μg </td></tr><tr><td> Vybrant DyeCycle이 있었던 청바지 </td><td> Invitrogen </td><td> V35003 </td><td> 5 MM </td></tr><tr><td> SYTOX 녹색 핵산의 산 얼룩 </td><td> Invitrogen </td><td> S7020 </td><td> 5 MM </td></tr><tr><td> Annexin V-알렉사 형석 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A23204 </td><td> 500 μl </td></tr><tr><td> Dulbecco의 PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031 - CV </td><td> 500 ML </td></tr><tr><td> 귀족 한천 </td><td> DIFCO </td><td> 2M220 </td><td> 100g </td></tr><tr><td> Trypan 블루 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> T8154 </td><td> 0.4 % 액체, 무균 여과 </td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> Hausser Scientifics </td><td> 1492 </td><td> 밝은 라인 </td></tr><tr><td> 4 잘 판 </td><td> 온도 피셔 </td><td> 167603 </td><td></td></tr><tr><td> Harrick 플라즈마 클리너 </td><td> Harrick 플라즈마 </td><td> PDC-32G </td><td> 기본 플라즈마 청소기 </td></tr><tr><td> Observer.Z1 </td><td> ZEISS </td><tD&gt; </td><td> 형광 현미경 (아래의 세 부분으로 작동) </td></tr><tr><td> 람다 10-3 </td><td> 셔터 악기 </td><td></td><td> 필터 컨트롤러 </td></tr><tr><td> 람다 DG-4 </td><td> 셔터 악기 </td><td></td><td> 초 고속 파장 스위처 </td></tr><tr><td> 하마 마츠 EM-CCD 카메라 </td><td> 하마 마츠 </td><td> C9100-13 </td><td> CCD - 현미경 카메라 </td></tr><tr><td> 15 ML 원뿔 관 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ML 원뿔 관 </td><td> VWR </td><td> 3282-345-300 </td><td></td></tr><tr><td> 니콘 Biostation </td><td> 니콘 인스트루먼트 주식회사 </td><td> Biostation IM </td><td></td></tr><tr><td> 유리 바닥 문화 요리 </td><td> MatTek 공사 </td><td> P35G-0 </td><td> 35mm 페트리 접시, 10mm microwell </td></tr></tbody></table>

quantitative high-throughput single-cell cytotoxicity assay for t cells

암 immunotherapy는 종양을 타겟팅하고 제거하는 면역 반응의 특이성을 활용 할 수 있습니다. 유전자 키메라 항원 수용체 (자동차)을 표현하도록 수정 T 세포의 입양 전송을 기반으로 입양 세포 치료 (ACT)는 임상 실험 1-4에서 상당한 약속을 보여 주었다. 이 자동차를 사용하여 + T 세포 비 MHC 제한 항원을 타겟팅하고 호스트에서 추적 및 지속성 최적의 생존을위한 T 세포를 functionalize 할 수있는 능력을 포함 암의 치료를 위해 다음과 같은 여러 장점이 있습니다, 그리고 마지막으로 자동차의 apoptosis를 유도하기 + 호스트 독성 (5)의 경우에 T 세포. 자동차의 최적의 기능을 Delineating + 임상 이익과 관련된 T 세포가 임상 시험의 다음 세대를 디자인하는 것이 필수적입니다. multiphoton 현미경 같은 라이브 동물 이미징의 최근 발전 면역 세포 기능의 연구를 혁신 한 전N 생체 6,7. 이 연구 생체, 임상 실험에서 T-세포 기반 ACT에서 T-세포 기능의 우리의 이해를 전진했지만에 활용하여, 사전에 주입 임상 효능 후 주입와 T-세포 준비의 분자 및 기능 기능을 연결 할 필요가 필요합니다 세포 독성 및 시토 킨 분비, 같은 T-세포 기능을 모니터링 체외 assays. 표준 흐름 세포 계측법 기반 assays은 단일 셀 수준의 T 세포 인구의 전반적인 기능을 결정하지만, 이러한 공액 형성과 수명 또는 여러 대상에게 8 죽일 같은 세포의 기능을 모니터링에 적합하지 않다고 개발되었습니다. polydimethylsiloxane (PDMS) 등의 biocompatible 폴리머로 설계 Microfabricated 배열 spatially effectors 작은 볼륨 9 대상을 한정 할 수있는 특히 매력적인 방법입니다. 자동 시간 경과 형광 현미경, tho와 함께효과기 - 대상의 상호 작용 usands은 nanowell 배열의 이미징 개인 우물에서 동시에 모니터링 할 수 있습니다. 우리는 여기서 크게 T 세포의 cytolytic 기능을 공부에 적용 할 수있는 단일 셀 레벨에서 T-세포 매개의 세포 독성을 모니터링하기위한 높은 처리량 방법론을 제시한다.

높은 처리량 cytolytic 분석의 응용의 예는 그림 2에 보여 있습니다. 간단히, CD19 별 CAR 표시 + T 세포는 nanowell 배열의 각 우물 (제 1-5)에 표시된 마우스 EL4 대상 세포와 공동 incubated되었습니다. 초기 이미지는 배열 (제 6 항)에 하나 하나 nanowell의 수용 인원을 (effectors 및 / 또는 타겟) 식별하기 위해 자동 형광 현미경에 기록되었습니다. 이미지 처리는 정확히 하나의 대상과 하나의 ?...

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Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

우리는 종양 대상 세포와 incubated 때 T 세포의 세포 독성을 측정 할 수있는 단일 셀 높은 처리량 분석을 설명합니다. 이 방법은 spatially 정의 비율에서 T 세포와 대상 세포를 한정하는 하위 nanoliter 우물 (~ 100,000 우물 / 배열)의 조밀 한, 탄성 배열을 사용하고 이펙터 - 대상 활용 및 후속 apoptosis를 모니터링하는 형광 현미경에 연결된다.

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

quantitative-high-throughput-single-cell-cytotoxicity-assay-for-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.9K 조회수.  University of Houston. 우리는 종양 대상 세포와 incubated 때 T 세포의 세포 독성을 측정 할 수있는 단일 셀 높은 처리량 분석을 설명합니다. 이 방법은 spatially 정의 비율에서 T 세포와 대상 세포를 한정하는 하위 nanoliter 우물 (~ 100,000 우물 / 배열)의 조밀 한, 탄성 배열을 사용하고 이펙터 - 대상 활용 및 후속 apoptosis를 모니터링하는 형광 현미경에 연결된다.

비디오: Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

연구

면역학 및 감염병학

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular organisms towards a source of nutrients or away from unsuitable conditions, as well as in multicellular organisms for tissue development, immune surveillance and wound healing, just to mention a few roles1,2,3. Deregulation of this process can lead to serious neurological, cardiovascular and immunological diseases, as well as exacerbated tumor formation and spread4,5. Molecularly, actin polymerization and receptor recycling have been shown to play important roles in creating cellular extensions (lamellipodia), that drive the forward movement of the cell6,7,8. However, many biological questions about cell migration remain unanswered.
The central role for cellular motility in human health and disease underlines the importance of understanding the specific mechanisms involved in this process and makes accurate methods for evaluating cell motility particularly important. Microscopes are usually used to visualize the movement of cells. However, cells move rather slowly, making the quantitative measurement of cell migration a resource-consuming process requiring expensive cameras and software to create quantitative time-lapsed movies of motile cells. Therefore, the ability to perform a quantitative measurement of cell migration that is cost-effective, non-laborious, and that utilizes common laboratory equipment is a great need for many researchers.
The phagokinetic track motility assay utilizes the ability of a moving cell to clear gold particles from its path to create a measurable track on a colloidal gold-coated glass coverslip9,10. With the use of freely available software, multiple tracks can be evaluated for each treatment to accomplish statistical requirements. The assay can be utilized to assess motility of many cell types, such as cancer cells11,12, fibroblasts9, neutrophils13, skeletal muscle cells14, keratinocytes15, trophoblasts16, endothelial cells17, and monocytes10,18-22. The protocol involves the creation of slides coated with gold nanoparticles (Au&deg;) that are generated by a reduction of chloroauric acid (Au3+) by sodium citrate. This method was developed by Turkevich et al. in 195123 and then improved in the 1970s by Frens et al.24,25. As a result of this chemical reduction step, gold particles (10-20 nm in diameter) precipitate from the reaction mixture and can be applied to glass coverslips, which are then ready for use in cellular migration analyses9,26,27.
In general, the phagokinetic track motility assay is a quick, quantitative and easy measure of cellular motility. In addition, it can be utilized as a simple high-throughput assay, for use with cell types that are not amenable to time-lapsed imaging, as well as other uses depending on the needs of the researcher. Together, the ability to quantitatively measure cellular motility of multiple cell types without the need for expensive microscopes and software, along with the use of common laboratory equipment and chemicals, make the phagokinetic track motility assay a solid choice for scientists with an interest in understanding cellular motility.

The phagokinetic motility track assay is a method used to assess the movement of cells. Specifically, the assay measures chemokinesis (random cell motility) over time in a quantitative manner. The assay takes advantage of the ability of cells to create a measurable track of their movement on colloidal gold-coated coverslips.

Phagokinetic 트랙 운동성 분석에 의한 세포 마이그레이션의 수량 평가

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

높은 처리량 정량 실시간 RT-PCR 분석 유형 I과 III 인터페론 하위 유형의 발현 양상을 결정하는

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation. 
Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

세포 외 DNA 릴리스의 높은 처리량 측정 및 인간 호중구의 양적 NET 형성<em&gt; 체외</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. NETs have been demonstrated to serve as an important host defense mechanism that traps and kills microorganisms. On the other hand, they have been implicated in diverse systemic autoimmune diseases. NETs are immunogenic and toxic structures that contain a pool of relevant autoantigens including anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA)-associated vasculitis (AAV) and systemic lupus erythematosus (SLE). Different forms of NETs can be induced depending on the stimulus. The amount of NETs can be quantified using different techniques including measuring DNA release in supernatants, measuring DNA-complexed with NET-molecules like myeloperoxidase (MPO) or neutrophil elastase (NE), measuring the presence of citrullinated histones by fluorescence microscopy, or flow cytometric detection of NET-components which all have different features regarding their specificity, sensitivity, objectivity, and quantity. Here is a protocol to quantify ex vivo NET formation in a highly-sensitive, high-throughput manner by using three-dimensional immunofluorescence confocal microscopy. This protocol can be applied to address various research questions about NET formation and degradation in health and disease.

This protocol describes a highly sensitive and high throughput neutrophil extracellular trap (NET) assay for the semi-automated quantification of ex vivo NET formation by immunofluorescence three-dimensional confocal microscopy. This protocol can be used to evaluate NET formation and degradation after different stimuli and can be used to study potential NET-targeted therapies.

평가 하 고 호 중구 Extracellular 함정 대형 계량 높은 처리량 분석 결과

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

높은 처리량 Shigella-특정 살 균 시험

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This technique allows for probing interaction strengths and dynamics on a live cell membrane, including those between cells, receptor and ligands, and alongside many other variations. It also works as a mechanism to deliver a physical or biochemical stimulus on single cells in a spatiotemporally controlled manner, thus allowing specific cell activation and subsequent cellular events to be monitored in real-time when combined with live-cell fluorescence imaging. The key step in those AFM-SCFS measurements is AFM-cantilever functionalization, or in other words, attaching a subject of interest to the cantilever. Here, we present methods to modify AFM cantilevers with a single T cell and a single polystyrene bead respectively for immunological studies. The former involves a biocompatible glue that couples single T cells to the tip of a flat cantilever in a solution, while the latter relies on an epoxy glue for single bead adhesion in the air environment. Two immunological applications associated with each cantilever modification are provided as well. The methods described here can be easily adapted to different cell types and solid particles.

We present a protocol to functionalize atomic force microscope (AFM) cantilevers with a single T cell and bead particle for immunological studies. Procedures to probe single-pair T cell-dendritic cell binding by AFM and to monitor the real-time cellular response of macrophages to a single solid particle by AFM with fluorescence imaging are shown.

단일 T 세포또는 면역 학적 단세포 힘 분광학을 위한 단입자를 가진 원자력 현미경 캔틸레버의 기능화

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...