CAR T 세포 요법은 특정 병리암 치료에서 전례 없는 성공을 거두었습니다. 이 연구에서는 일시적인 CAR T 세포를 생성하기 위한 비바이러스성 장기 통합 접근법을 소개하고 CAR T 세포 기능을 평가하기 위한 표적 절차를 제공했습니다. 본 연구는 보다 비용 효율적인 접근 방식으로 안전하고 효과적인 CAR T 세포를 생성하는 것을 목표로 합니다.
CAR T 세포는 일반적으로 바이러스 형질도입에 의해 생성됩니다. 레트로바이러스와 안티바이러스는 CAR 유전자 전달을 위한 가장 흔한 바이러스 벡터입니다. 바이러스 벡터를 제조하는 것은 복잡하고 비용이 많이 들며, 바이러스 형질도입은 T 세포 게놈에 무작위적이고 영구적인 CAR 인코딩 DNA 통합을 유도하여 안전성 문제를 일으킬 수 있습니다.
당사의 프로토콜은 CAR을 전이적으로만 발현하는 CAR T 세포를 생성하기 위한 비바이러스 접근 방식을 제공합니다. 이 방법은 CAR 발현을 위해 mRNA를 사용하고 전기천공법을 사용하여 mRNA를 T 세포로 전달합니다. 이것은 T 세포 게놈에 대한 유전자 통합이 없으며 제조 절차가 더 간단하고 비용 효율적입니다.
먼저 제한 효소 BGL2로 CAR 플라스미드 DNA를 선형화하고 페놀 클로로포름 이소아밀 알코올 DNA 추출 절차를 수행합니다. 선형화된 DNA를 정제한 후 아가로스 겔 전기영동으로 템플릿의 크기와 무결성을 확인합니다. in vitro transcription의 경우 반응 성분을 혼합하고 반응 혼합물을 섭씨 37도에서 최소 2시간 동안 배양합니다.
전사 후 2마이크로리터의 리보뉴클레아제 III, DNase I을 반응에 첨가합니다. 부드럽게 혼합하고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양하여 템플릿 DNA를 분해합니다. RNA cleanup kit로 전사된 CAR mRNA를 정제하고 nuclease-free water에 희석합니다.
섭씨 영하 80도에서 보관하기 전에 분광 광도계를 사용하여 mRNA 농도를 측정합니다. in vitro 전사 및 정제된 자동차 mRNA 샘플을 얼음 위에서 해동합니다. 1 밀리리터의 CAR T 배지에 6개의 냉동 보존된 인간 말초 혈액 단핵 세포의 힘으로 10을 1회 현탁합니다.
T 세포를 활성화하려면 사전 세척된 human T activator CD3/CD28 beads를 동일한 수만큼 첨가합니다. 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 5%의 이산화탄소로 며칠 동안 세포를 배양하고 팽창시킵니다. 웰당 1밀리리터의 CAR T 배지를 12웰 플레이트의 웰 2개에 추가하고 평형을 위해 섭씨 37도에서 배양합니다.
이제 6개의 T 세포의 거듭제곱에 5 곱하기 10을 멸균 튜브로 전달합니다. CD3/CD28 비드를 제거하려면 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 세포 현탁액을 새 튜브에 조심스럽게 피펫팅합니다. 튜브를 300G으로 실온에서 5분 동안 원심분리합니다.
상등액을 버린 후 세포 펠릿을 1ml의 멸균 PBS에 재현탁합니다. 튜브를 다시 원심 분리하고 세포 펠릿을 200 마이크로 리터의 네온 버퍼 T.Mix에 5 마이크로 그램의 네온 버퍼 T와 100 마이크로 리터의 세포를 총 125 마이크로 리터의 부피로 재현탁시킵니다. 25마이크로리터의 네온 버퍼 T를 나머지 100마이크로리터의 세포에 추가하면 음성 대조군 역할을 합니다.
Neon electroporation 시스템을 1, 800볼트, 10밀리초 및 단일 펄스로 설정합니다. Neon 피펫을 사용하여 T 세포 CAR mRNA 혼합물을 Neon 100 마이크로리터 팁으로 흡인하고 세포를 전기천공합니다. 즉시 전기천공된 세포를 12-well 플레이트의 평형 배양 배지로 옮기고 플레이트를 인큐베이터로 되돌려 사용할 준비가 될 때까지 세포를 확장합니다.
전기천공법 후 6시간 이내에 유세포 분석을 위해 CAR mRNA로 transfection된 T 세포를 회수합니다. CAR T 세포를 피펫과 여러 번 혼합하고 5개의 세포의 거듭제곱의 10배를 5ml 형광 활성화 세포 분류(FACS) 튜브로 최소 1회 이동합니다. 튜브에 3ml의 냉수 세척 버퍼를 추가하고 실온에서 500G의 튜브를 5분 동안 원심분리합니다.
상등액을 버린 후 세포 펠릿을 100마이크로리터의 세척 버퍼에 재현탁합니다. 2마이크로리터의 형광 표지 검출 항체와 7개의 AAD 생존도 염료를 부유 세포에 추가합니다. 샘플을 혼합하고 빛 노출을 피하면서 30분 동안 얼음 위에서 배양한 다음 3ml의 차가운 세척 버퍼로 세포를 세척하고 실온에서 500G로 튜브를 다시 원심분리합니다.
상등액을 버린 후 100마이크로리터의 세척 완충액에 세포를 재현탁하고 즉시 유세포분석기를 사용하여 세포를 분석합니다. 세포 표면에서 CAR 항원을 발현하는 종양 세포에서 배지를 제거합니다. PBS로 세포를 세척한 후 섭씨 37도에서 1분 동안 0.05%트립신 EDTA 용액 1밀리리터로 배양한 다음 1-5배 10의 밀도로 밀리리터당 5개의 세포 전력으로 적절한 배양 배지에 단일 세포 현탁액을 준비합니다.
다음으로, 예열된 종양 세포 배양 배지 50마이크로리터를 E-플레이트에 추가하고 실시간 세포 분석 또는 RTCA 기기에 넣어 배경 임피던스를 측정한 다음 각 웰에 100마이크로리터의 종양 세포 현탁액을 추가하고 플레이트를 실온에서 30분 동안 평형화합니다. E-플레이트를 RTCA 기기에 다시 넣고 5-15분마다 측정하여 24시간 동안 셀 인덱스를 모니터링합니다. 다음 날, CAR T 세포 현탁액을 준비합니다.
세포 인덱스 기록을 일시 중지하고 RTCA 기기에서 E-플레이트를 제거합니다. 플레이트를 약간 기울이고 종양 세포를 방해하지 않고 각 웰에서 50마이크로리터의 배양 배지를 조심스럽게 제거한 다음 각 웰에 100마이크로리터의 CAR T 세포 또는 대조군 T 세포를 추가합니다. E-plate를 RTCA 기기로 되돌리고 5분에서 15분마다 스윕을 수행하여 최소 24시간 동안 세포 인덱스 모니터링을 재개합니다.
세포 지수 모니터링을 중지하고 세포 독성 결과를 분석합니다. 사이토카인 분비 분석을 위해 각 웰의 상층액을 둥근 바닥 또는 V자형 96웰 플레이트로 옮깁니다. 96웰 플레이트를 300G의 실온에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 새 96웰 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다.
마지막으로, 상용 ELISA 키트를 사용하여 상등액의 사이토카인 수치를 측정합니다. CAR mRNA 염기서열은 겔 전기영동에 의해 크기가 약 2km염기인 것으로 검증되었습니다. 활성화된 T 세포의 50% 이상이 전기천공 후 1일째에 CAR을 발현했으며, 2일째에는 70% 이상으로 증가했다가 5일째에는 약 10%로 감소했습니다.
CAR T 세포는 HER2 양성 SK-OV-3 종양 세포에 대해 상당한 세포 독성을 보였는데, 이는 종양 임피던스의 급격한 감소로 나타난 반면, 대조군 T 세포는 최소한의 효과를 보였다. 높은 수준의 인터페론 감마 분비는 CAR T 세포 배양 배지에서 검출되었지만 대조군에서는 검출되지 않았습니다.
