근육 줄기 세포는 그들의 내인성 틈새 와 연관된 남아 있고 siRNA transfection를 통해, 예를 들면, 쉽게 조작될 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 틈새 시장을 보존하여 표준 2D 배양 모델보다 생체 내 상황과 유사한 환경에서 배양에서 근육 줄기 세포를 분석할 수 있습니다. 먼저 멸균 파스퇴기 파이펫을 다이아몬드 펜으로 절단합니다.
각 마우스에 대해, 약 0.3센티미터의 개구부와 약 10~12cm의 길이와 약 0.1센티미터의 작은 개구부와 약 22cm길이의 두 번째 유리 파이펫을 사용하는 큰 보어 파이펫 을 사용한다. 부드러운 움직임으로 5~10초 동안 분젠 버너의 불꽃에 파이펫 팁을 들고 두 파이펫의 가장자리를 부드럽게 합니다. 사용하기 직전에 두 파이펫을 멸균 말 세럼으로 코팅한 후 5분 동안 말 세럼 2밀리리터로 전체 파이펫을 채운 다음 말 세럼을 주입하고 피펫이 실온에서 5분 동안 건조하도록 합니다.
70%에탄올로 마우스의 모든 장비와 뒷다리를 스프레이합니다. 경화 미세 곡선 가위와 미세 한 집게를 사용하여 피부를 제거하고 기본 근육을 노출하십시오. 기본 근육을 손상시키지 않고 미세 곡선 포셉으로 주변 근막을 제거하십시오.
티비알리스 전방 또는 TA를 제거하려면 단면 TA 힘줄을 집게로 잡고 미세 가위로 자른다. 힘줄에 TA를 들고있는 동안, 무릎쪽으로 당겨 EDL 근육을 노출 무릎에 가까운 근육을 잘라. 구부러진 집게로 단정한 EDL 힘줄을 들어 올리고 고급 바나스프링 가위로 자른다.
조심스럽게 무릎쪽으로 EDL을 당겨 근위 EDL 힘줄을 노출. 그런 다음 가위로 근위 힘줄을 자른다. 순환 하는 수조에 37 섭씨에서 반응 관에 EDL 근육을 배양.
근육이 느슨해지고 단일 마일 섬유가 보이면 소화를 중지하십시오. 가열 판이 장착 된 멸균 쌍안경 현미경으로 작업하면 큰 보어 파이펫을 사용하여 따뜻한 절연 매체로 근육을 플러시했습니다. 원하는 수의 근섬유제가 용액에 자유롭게 떠오를 때까지 큰 보어 파이펫으로 근육을 분리합니다.
이물질을 세척하려면 작은 보어 유리 파이펫을 사용하여 수축되지 않은 심섬유를 격리 매체로 잘 채워진 두 번째로 이송합니다. 그런 다음 50~100개의 비계약근섬유를 근섬유 배양 배지로 채워진 24개의 웰 플레이트 중 1개웰로 옮는다. 근섬유를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%를 72~96시간 동안 배양합니다.
Transfect 근섬유 관련 근육 줄기 세포 4 시간 근섬유 격리 후. 옵티-MEM 의 마이크로리터 25개와 각각의 시RNA 부피와 25마이크로리터 옵티-MEM을 결합하여 1.5 마이크로리터의 경질 시약을 함유하고 있습니다. 반응 혼합물을 5분 동안 배양하고 24웰 플레이트의 세포에 첨가한다.
그런 다음 시간의 존경을 위해 섭씨 37도에서 접시를 배양합니다. 면역형광 염색 프로토콜의 중요한 단계만이 여기에서 입증됩니다. 신중하게, 양섬유 배양 배지를 버리고 일부 용액을 우물에 둡시.
인접한 근육 줄기 세포로 근섬유를 고치기 위해 2%의 파라포름알데히드500마이크로리터를 추가합니다. 상온에서 5분간 접시를 배양합니다. 상체를 조심스럽게 제거하고 PBS로 근섬유를 세 번 씻으시면 됩니다.
이차 항체로 배양 후 인큐베이션 단계 동안 tinfoil로 플레이트를 덮습니다. 소수성 펜을 사용하여 현미경 유리 슬라이드에 원을 그립니다. 그런 다음 가능한 가장 작은 부피로 근섬유를 슬라이드로 옮기고 분산시합니다.
작은 지퍼 파스퇴르 파이펫 또는 200 마이크로 리터 파이펫으로 잔류 액체를 제거합니다. 수성 장착 매체 2방울을 사용하고 근섬유를 커버 슬립으로 덮습니다. 그런 다음 슬라이드가 건조하고 어둠 속에서 섭씨 4도에서 저장한 다음 현미경 분석을 허용합니다.
이 프로토콜은 뮤린 EDL 근육에서 단일 근섬유의 파생 및 문화를 보여줍니다. Pax7용 면역형성 염색은 근육 줄기 세포의 핵을 식별하는 데 사용되었습니다. 확대 된 영역은 인접한 근육 줄기 세포로 근섬유를 노출시키고 근육 줄기 세포의 핵에 있는 PAX7 면역 형광 신호를 보여줍니다.
근육 줄기 세포 근생 성 진행마커 발현에 의해 분석 될 수있다. Pax7의 존재와 MyoD 발현의 부재는 새로 분리된 근섬유의 정지근육 줄기 세포와 관련이 있다. MyoD 발현은 증식 근육 줄기 세포에서 관찰될 수 있다.
72 시간 후에, 근육 줄기 세포는 다른 근생 마커의 표현에 의해 평행되는 다른 근생 국가를 가진 자손의 클러스터를 형성합니다. Pax7 만 세포는 자가 갱신 줄기 세포입니다. Pax7 및 MyoD 이중 양성 세포가 확산되고 있습니다.
myo D 전용 세포는 세포를 분화하는 반면. 근육 줄기 세포의 siRNA 변환은 효율적인 섭취를 나타내는 세분화 된 방식으로 세포질 siRNA의 축적을 보여 주었다. 근섬유화당 전균 감염된 Pax7 양성 세포의 정량화는 근육 줄기 세포 수에 악영향을 미치지 않고 30시간 후에 전형세포의 수가 최대 74%까지 증가한 것으로 나타났습니다.
이 프로토콜을 시도할 때 손상을 일으키지 않고 EDL을 신중하게 해부하는 것이 가장 중요합니다. siRNA 트랜스페션 이외에, 접점 된 심섬유에 근육 줄기 세포의 추가 기능 분석을 위해 재조합 단백질을 가진 형질 전환 동물 또는 인큐베이션의 분석이 가능하다.
