우리는 토론과 의견 Skok 실험실, 특히 수잔나 휴잇의 회원 감사드립니다. 이 작품은 건강 교부금의 국립 연구소 R01GM086852, RC1CA145746 (JAS)에 의해 지원됩니다. JAS는 백혈병과 림프종 사회 학자이다. JC는 암 연구소의 Irvington 연구소 연구원입니다. MM은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 기금 통합 대학원 교육과 연구 Traineeship (NSF IGERT 0,333,389)에 의해 지원됩니다.

1. Fluorophores있는 DNA 프로브 레이블 : 닉 번역 (~ 6 시​​간) <ol><li> 클린 BAC DNA (맥시 사립으로 작성) 또는 plasmids 또는 PCR 제품, H 2 O에 resuspended 모두, 라벨에 사용할 수 있습니다. 참고 강력한 생선 신호, 프로브 적어도 10킬로바이트에 걸쳐해야. </li><li> RNase에서 DNA를 배양 37 번 30 분에 대한 ° C (모든 시약은 표 1에 나열되어 있습니다). </li><li> 16에서 2 시간의 대화명 번역 반응을 길러 ° C (표 2, 3 참조). 직접 라벨의 다른 방법은 (: 생선 태그, Invitrogen 예) 사용할 수 있습니다. </li><li> -80에 하나의 시간에 대한 반응을 비활성화 -20 ° C.에서 ° C 또는 특급 </li><li> 2 % 아가로 오스 겔에서 프로브의 크기를 결정합니다. 얼룩은 약 300-500 BP (Cy5-프로브의 비방이 표시되지합니다)에서 대부분의과 100 1,000 BP 사이 여야합니다. DNA가 충분히 소화되지 않은 경우, 더 많은 DNA 폴 I 및DNase I은 반응에 추가 및 16 ° C.에서 두 시간에 incubated 수 있습니다 </li><li> 어둠의 두 시간에 H와 2 0을 채워 이리터 비커에서 0.025 mm 필터에 프로브를 정화. </li><li> 다음과 같이 프로브에 차단 요소를 추가 침대-1 DNA 10 μg, Hybloc의 DNA 10 μg과 DNA 프로브의 10 μg을위한 연어 정자의 100 μg. -20 ° C.에 저장 DNA 프로브 </li></ol> 2. 프로브 강수량 / 변성 / 사전 어닐링 (3-4 시간) <ol><li> 0.3 μg과 DNA 프로브의 1 μg 사이는 coverslip 당 사용됩니다. 3M NaAc (산도 5.2)와 100 % 에탄올 2.5 볼륨의 0.1 볼륨 믹스 탐사선이 -80에 하나의 시간에 품다 ° C 또는 야간 -20 ° C에서와 4에서 13,000 rpm으로 스핀 다운 ° C를 30 분에. DNA 프로브의 양이 DNA의 품질과 하이브리드의 핵 지역에 따라 조정 될 수 있습니다. 직접 라벨의 대체 방법의 감소 금액의 사용을 허용 할 수 있습니다프로브. 하나의 슬라이드에 여러 개의 DNA 생선 신호 감지를 들어, 다른 프로브는 (반복 시퀀스처럼, 사전 annealed이 아니어야 프로브 제외) 함께 유발 될 수 있습니다. 같은 시간에 수행 여러 가지 실험에 대한 프로브도 함께 유발 될 수 있습니다. 펠렛은 가볍게 (프로브의 작은 금액이 유발되는 경우, 펠릿이 표시되지 않을 수 있습니다)를 사용 fluorophores에 따라 색상이되어야합니다. </li><li> 드라이 알약과 37-45에서 어둠 속에서 (Eppendorf thermomixer를 사용하여) 진동과 coverslip 당 (표 4 참조) 15 μl 하이브 리다이 제이션 버퍼에서 그들을 resuspend ° C (약 20 분) 등이 있습니다. </li><li> 75-95에서 5 분에 변성 프로브 ° C. </li><li> 30-60 분에 대한 ° C 37 프로브를 사전 어닐링. 사전 어닐링의 길이는 프로브의 복잡성과 품질에 따라 조정될 수 있습니다. </li><li> 밤새 하이브리드에 대한 coverslips (제 3 항 참조)에 탐사선을 적용합니다. </li></ol> 3. 3차원 DNA 물고기 - 첫 번째 날 (~ 3 시간) <ol><li> 비 점착성의 세포는 1X PBS (coverslip 당 5-10 μl 1X PBS에서 ~ 2x10 5 세포)의 작은 볼륨에 집중하고 폴리-L-라이신 코팅 coverslip의 중심에 놓을 수 있습니다. 자기편 세포는 최소 24 시간 (~ 70 % 합류) (coverslips는 0.1 % 젤라틴으로 코팅 할 수 있습니다)에 coverslips에 배양해야합니다. 광장 18x18에 24~24mm의 coverslips는 6 잘 접시에 배치되며, 프로토콜에 걸쳐, 각 솔루션의 두 ML은 (또는 원형 1.5 mm의 coverslips는 12/24-well 판에 배치 할 수 있습니다) 잘 당 사용됩니다. </li><li> RT (4 % PFA 주식은 -20 ° C에서 저장 aliquoted 할 수 있습니다)에서 10 분 동안 2 % paraformaldehyde / 1X PBS, pH를 7-7.4에서 셀을 수정합니다. Paraformaldehyde가 (16 %) 용액에 구입할 수 있습니다, 또는 4 %의 주식 솔루션은 분말 / prills에서 준비하실 수 있습니다. Paraformaldehyde 가루는&gt; 60 ° 얼음에 C (산도가 해산을 촉진하기 8-9으로 증가 될 수있다), 냉각 다운이 조정에 1X PBS에 용해되어에드 산도 7-7.4까지, 필터링, 매에 aliquoted 및 -20 ° C.에 주 저장 </li><li> 1X PBS에 세 린스 후, 얼음에 5 분을 위해 아이스처럼 차가운 0.4 % 트리톤 - X-100 / 1X PBS로 세포를 permeabilize. permeabilization의 길이는 세포 종류에 따라 조정될 수 있습니다 NB는 :. DNA 물고기가 immunofluorescence와 결합되어있는 경우, immunostaining는 (제 4 참조)이 단계에서 수행해야합니다. </li><li> 37 한 시간에 0.1 μg / 1X PBS에서 μl RNase ° C.와 1X PBS, 배양 세포에서 세 린스 후 Coverslips는 parafilm의 솔루션이나 습기 챔버에서 슬라이드의 100 μl의 드롭에 셀 측을 배치하고 있습니다. Coverslips 그런 다음 조심스럽게 집게로 제거됩니다. 어떠한 저항도가 발생하는 경우 coverslips는 세포 손상을 방지하기 위해 1X PBS로 넘쳐해야합니다. </li><li> 1X PBS에 세 린스 후, 얼음에 10 분 동안 아이스처럼 차가운 0.7 % 트리톤 - X-100 / 0.1 M HCL에 셀을 permeabilize. </li><li> 세 린스 후N 1X PBS, RT 30 분에 1.9 M HCL에 변성 세포. 반면, 세포는 적어도 30 분 동안 75-80 ° C 50 % 포름 아미드 / 2 배 SSC에 변성 될 수 있습니다. 하이브리드 길이 (및 온도) 세포 유형에 따라 최적화 될 수 있습니다. </li><li> 얼음처럼 차가운 1X PBS에 세 린스 후, ° C 어둡고 습한 챔버 37에서 잠을 자면 프로브와 세포 잡종을 만들다. Coverslips는 슬라이드 프로브의 15 μl의 드롭에 셀 측을 배치하고, 고무 시멘트로 밀봉되어 있습니다. </li></ol> 4. 3 차원 Immuno - 물고기 - 1 일 (~ 6-7 시간) <ol><li> 결합 immunofluorescence / DNA 생선, immuno-얼룩은 0.4 % 트리톤 - X-100 (단계 3.3)의 permeabilization 한 후 수행해야합니다. </li><li> RT 30 분 (2.5 % 소 혈청 알부민 (BSA), 10 % 정상 염소 혈청, 0.1 % 십대 초반 - 2​​0)에 대한 솔루션을 차단에 세포를 배양. 차단 솔루션, 필터링 1.5 ML의 Eppendorfs에 aliquoted과 m에 저장-20 ° C.에 onths </li><li> 습기 챔버에서 RT 한 시간 동안 단백질 또는 차단 솔루션에 희석 관심 히스톤 수정에 대해 제기 된 주요 항체와 세포를 배양. 여기 H2AX (; 자세한 내용은 표 5를 참조 γ-H2AX, Millipore)의 phosphorylated 세린-139에 대한 항체의 예를 보여줍니다. Coverslips는 parafilm의 솔루션이나 습기 챔버에서 슬라이드의 100 μl의 드롭에 셀 측을 배치하고 있습니다. Coverslips 그 다음 신중하게 포셉 (1X PBS 필요한 경우와 홍수)로 제거됩니다. 참고 희석과 부화 길이는 항체 및 세포 유형의 품질에 따라 조정 될 수있다. </li><li> 0.2 %에 BSA / 0.1 % 십대 초반 - 2​​0 / 1X PBS, 흔들림과 RT의 세 배 5 분 거리에 있습니다. 세포를 씻으십시오 </li><li> 어두운 습윤 챔버에 RT 한 시간에 대한 솔루션을 차단에 희석 적절한 형광 - 복합 차 항체와 세포를 배양. 여기로 검출의 예를 보여보조 염소 항 마우스 항체 (알렉사 형석 488 또는 555, Invitrogen, 자세한 내용은 표 5 참조). Hapten - 복합 이차 항체는 (비오틴, digoxigenin 등)도 사용할 수 있습니다. 이 경우, 적절한 감지 (streptavidin, 안티 - 파 등)에 대한 추가 단계가 넘는 박 DNA - 생선 하이브리드 전이나 후에 수행 할 수 있습니다. </li><li> 0.1 %에서 세포를 씻어 십대 초반 - 2​​0 / 1X PBS, 어둠 속에서 떨고있는 RT 세 번 5 분 거리에 있습니다. </li><li> 어둠 속에서 RT 10 분에 2 % paraformaldehyde / 1X PBS의 사후 수정 세포. </li><li> 위의 RNase A (단계 3.4)의 부화에서 DNA 생선을 계속합니다. </li></ol> 5. 3 차원 DNA 물고기 / Immuno - 물고기 - 두 번째 날 (~ 2 시간) <ol><li> 조심스럽게 조심스럽게 집게로 제거하고 세척 솔루션을 포함 우물에 넣고, 배 SSC과 함께 홍수 coverslips을 고무 시멘트를 제거합니다. </li><li> 37 번 30 분 ° 흔들림과 어둠 속에서 C에 2 배 SSC에 세포를 씻으십시오.</li><li> 흔들림과 어둠 속에서 RT 30 분 동안 2 배 SSC에 세포를 씻으십시오. </li><li> 흔들림과 어둠 속에서 RT 30 분 동안 1X SSC에 세포를 씻어 포름 아미드와 변성의 경우, 세차는 다음으로 대체되어야합니다 :. 3 세차를 배 SSC, 5 50 % 포름 아미드 / 2 배 SSC와 3 세차의 37 각을 분 ° C. </li><li> 총 DNA의 counterstaining에 대해 1.5 μg / ML DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)를 포함하는 골드 장착 매체 연장에 세포를 탑재합니다. Coverslips은 슬라이드에 미디어를 마운트의 10-15 μl의 드롭에 셀 측을 배치하고 매니큐어로 봉인되어 있습니다. 슬라이드는 -20 ° C.에 몇 달 동안 보관됩니다 </li></ol> 6. 3D 현미경 및 분석 <ol><li> 3D 이미지는 다른 현미경 시스템과 획득 할 수 있습니다. 우리의 실험에서, 0.3 μm로 구분하여 광학 섹션은 Leica SP5 AOBS 공 촛점 시스템 (음향 광학 빔 스플리터)를 수집합니다. 참고 그 optica 사이의 분리난 비행기가 분석의 유형에 따라 조정될 수 있습니다. </li><li> 3D 이미지 스택은 다른 소프트웨어와 도구를 사용하여 분석 할 수 있습니다. 우리는 관심 loci 사이의 거리 측정을 평가하고 하위 핵 구획 또는 단백질과 관심 loci의 협회의 다른 유형을 분석 할 이미지 J 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> 다른 셀 유형 또는 단계 사이의 비교, 관심의 다른 loci 사이의 비교 : 모든 통계 분석은 중요한 pairwise 평가 (들)과 (또는 이상) 다른 생물 조건을 두 비교 수행됩니다. 모든 통계 테스트에서 P-값 ≤ 5.00E-2 (= 0.05)이 (1.00E-2 중요 할로 이동합니다 ≤ P ≤ 5.00E-2 * 중요한, 1.00E-3 ≤ P ≤ 1.00E-2 * * 매우 중요한, P &lt;1.00E-3 *** 매우 중요). </li></ol> 두 대립 유전자 사이의 거리의 전체 분포의 통계적 분석. 우리가 처음 C우리가 nonparametric 두 샘플 Kolmogorov-스 미르 노프 (KS) 테스트 13,14을 사용하여 경험적 간 allelic 거리의 배포판의 차이의 중요성을 평가 두 alleles.To 사이의 측정 거리의 전체 범위에 걸쳐 누적 분포 주파수 곡선을 onstruct. 최적의 거리 컷 - 오프를 사용하여 두 개의 대립 유전자의 가까운 연결 (예 : 페어링)의 통계 분석. 2 개의 대립 유전자 또는 loci 사이의 거리에서 가장 강력한 차이의 범위를 확인하려면, 우리는 두 꼬리 피셔 정확한 테스트 15 s의 시리즈를 사용합니다. 즉, 각 측정 거리 조건이 하나이 크게 두 샘플 사이의 짧은 거리에서 오버 표시되어 있는지 여부를 우리가 시험에서. P-값의 분포에서 최소 두 대립 유전자의 가까운 연결 (예 : 페어링)의 컷 - 오프로 간주되어야 거리의 범위를 나타냅니다. 이후 두 꼬리 피셔 정확한 테스트는 t를 사용확인 된 컷 - 오프 값이 15에서 두 대립 유전자의 페어링의 중요성을 평가 Ø. 여러 테스트 수정 16을 수행 피셔 테스트의 총 수에 계정에 적용됩니다. 하위 핵 구획 또는 단백질과 관심 궤적의 협회의 통계 분석. 두 꼬리 피셔 - 정확한 ​​테스트는 서로 다른 구획 또는 단백질 15 관심 궤적의 협회의 중요성을 분석하는 데 사용됩니다.

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	<li>Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome+inactivation+in+mouse+embryonic+stem+cells:+analysis+of+histone+modifications+and+transcriptional+activity+using+immunofluorescence+and+FISH.">X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH.</a> Methods in enzymology. , 376-405 (2004).</li><li>Cremer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+3D+fluorescence+in+situ+hybridization+for+imaging+interphase+chromosomes.">Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes.</a> Methods Mol. Biol. 463, 205-239 (2008).</li><li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunofluorescence,+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization,+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes,+transcriptional+activity,+nuclear+organization,+and+X-chromosome+inactivation.">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).</li><li>Solovei, I., Cremer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-FISH+on+cultured+cells+combined+with+immunostaining.">3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining.</a> Methods Mol. Biol. 659, 117-126 (2010).</li><li>Markaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+3D-FISH+and+super-resolution+structured+illumination+microscopy+for+studies+of+3D+nuclear+architecture:+3D+structured+illumination+microscopy+of+defined+chromosomal+structures+visualized+by+3D+(immuno)-FISH+opens+new+perspectives+for+studies+of+nuclear+architecture.">The potential of 3D-FISH and super-resolution structured illumination microscopy for studies of 3D nuclear architecture: 3D structured illumination microscopy of defined chromosomal structures visualized by 3D (immuno)-FISH opens new perspectives for studies of nuclear architecture.</a> BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 34, 412-426 (2012).</li><li>Heard, E., Bickmore, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+gene+regulation+and+chromosome+territory+organisation.">The ins and outs of gene regulation and chromosome territory organisation.</a> Current opinion in cell biology. 19, 311-316 (2007).</li><li>Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+sequence:+cellular+organization+of+genome+function.">Beyond the sequence: cellular organization of genome function.</a> Cell. 128, 787-800 (1016).</li><li>Fraser, P., Bickmore, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+organization+of+the+genome+and+the+potential+for+gene+regulation.">Nuclear organization of the genome and the potential for gene regulation.</a> Nature. 447, 413-417 (2007).</li><li>Cremer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+territories--a+functional+nuclear+landscape.">Chromosome territories--a functional nuclear landscape.</a> Current opinion in cell biology. 18, 307-316 (2006).</li><li>Mao, Y. S., Zhang, B., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+function+of+nuclear+bodies.">Biogenesis and function of nuclear bodies.</a> Trends in genetics : TIG. 27, 295-306 (2011).</li><li>Dostie, J., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+organization+in+the+nucleus+-+charting+new+territory+across+the+Hi-Cs.">Chromosome organization in the nucleus - charting new territory across the Hi-Cs.</a> Current opinion in genetics &amp; development. 22, 125-131 (2012).</li><li>van Steensel, B., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+tools+for+unraveling+chromosome+architecture.">Genomics tools for unraveling chromosome architecture.</a> Nature. 28, 1089-1095 (2010).</li><li>Massey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kolmogorov-Smirnov+Test+for+Goodness+of+Fit.">The Kolmogorov-Smirnov Test for Goodness of Fit.</a> Journal of the American Statistical Association. 253, 1951 (1951).</li><li>Collins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RUNX+transcription+factor-mediated+association+of+Cd4+and+Cd8+enables+coordinate+gene+regulation.">RUNX transcription factor-mediated association of Cd4 and Cd8 enables coordinate gene regulation.</a> Immunity. 34, 303-314 (2011).</li><li>Fisher, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+interpretation+of+&#967;2+from+contingency+tables,+and+the+calculation+of+P.">On the interpretation of &#967;2 from contingency tables, and the calculation of P.</a> Journal of the Royal Statistical Society. 85, 87-94 (1922).</li><li>Benjamini, Y. H., Yosef, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+false+discovery+rate:+a+practical+and+powerful+approach+to+multiple+testing.">Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society, Series B (Methodological). 57, 125-133 (1995).</li><li>Fitzsimmons, S. P., Bernstein, R. M., Max, E. E., Skok, J. A., Shapiro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+accessibility,+nuclear+positioning,+recombination,+and+transcription+at+the+Igkappa+locus.">Dynamic changes in accessibility, nuclear positioning, recombination, and transcription at the Igkappa locus.</a> J. Immunol. 179, 5264-5273 (2007).</li><li>Fuxa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax5+induces+V-to-DJ+rearrangements+and+locus+contraction+of+the+immunoglobulin+heavy-chain+gene.">Pax5 induces V-to-DJ rearrangements and locus contraction of the immunoglobulin heavy-chain gene.</a> Genes Dev. 18, 411-422 (2004).</li><li>Goldmit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+ontogeny+of+the+Igk+locus+during+B+cell+development.">Epigenetic ontogeny of the Igk locus during B cell development.</a> Nature. 6, 198-203 (2005).</li><li>Hewitt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+the+Igk+and+Igh+immunoglobulin+loci+mediated+by+the+3'+Igk+enhancer+induces+'decontraction'+of+the+Igh+locus+in+pre-B+cells.">Association between the Igk and Igh immunoglobulin loci mediated by the 3' Igk enhancer induces 'decontraction' of the Igh locus in pre-B cells.</a> Nature. 9, 396-404 (2008).</li><li>Johnson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7+Functionally+Segregates+the+Pro-B+Cell+Stage+by+Regulating+Transcription+of+Recombination+Mediators+across+Cell+Cycle.">IL-7 Functionally Segregates the Pro-B Cell Stage by Regulating Transcription of Recombination Mediators across Cell Cycle.</a> Journal of Immunology. , (2012).</li><li>Karnowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+and+nuclear+repositioning+of+the+lambda5+gene+locus+at+the+pre-b+cell+stage+requires+Aiolos+and+OBF-1.">Silencing and nuclear repositioning of the lambda5 gene locus at the pre-b cell stage requires Aiolos and OBF-1.</a> PLoS ONE. 3, e3568 (2008).</li><li>Kosak, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subnuclear+compartmentalization+of+immunoglobulin+loci+during+lymphocyte+development.">Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphocyte development.</a> Science. 296, 158-162 (2002).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yin+Yang+1+is+a+critical+regulator+of+B-cell+development.">Yin Yang 1 is a critical regulator of B-cell development.</a> Genes Dev. 21, 1179-1189 (2007).</li><li>Parker, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pre-B-cell+receptor+induces+silencing+of+VpreB+and+lambda5+transcription.">The pre-B-cell receptor induces silencing of VpreB and lambda5 transcription.</a> Embo J. 24, 3895-3905 (2005).</li><li>Roldan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locus+'decontraction'+and+centromeric+recruitment+contribute+to+allelic+exclusion+of+the+immunoglobulin+heavy-chain+gene.">Locus 'decontraction' and centromeric recruitment contribute to allelic exclusion of the immunoglobulin heavy-chain gene.</a> Nature immunology. 6, 31-41 (2005).</li><li>Skok, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonequivalent+nuclear+location+of+immunoglobulin+alleles+in+B+lymphocytes.">Nonequivalent nuclear location of immunoglobulin alleles in B lymphocytes.</a> Nature. 2, 848-854 (2001).</li><li>Skok, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+contraction+by+looping+of+the+Tcra+and+Tcrb+loci+in+rearranging+thymocytes.">Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes.</a> Nature immunology. 8, 378-387 (2007).</li><li>Xiang, Y., Zhou, X., Hewitt, S. L., Skok, J. A., Garrard, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+element+in+the+mouse+Igkappa+locus+that+specifies+repertoire+and+Ig+loci+subnuclear+location.">A multifunctional element in the mouse Igkappa locus that specifies repertoire and Ig loci subnuclear location.</a> Journal of Immunology. 186, 5356-5366 (2011).</li><li>Hewitt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAG-1+and+ATM+coordinate+monoallelic+recombination+and+nuclear+positioning+of+immunoglobulin+loci.">RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci.</a> Nature immunology. 10, 655-664 (2009).</li><li>Deriano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RAG2+C+terminus+suppresses+genomic+instability+and+lymphomagenesis.">The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis.</a> Nature. 471, 119-123 (2011).</li><li>Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+repositioning+of+genes+in+the+nucleus+of+lymphocytes+preparing+for+cell+division.">Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division.</a> Molecular cell. 3, 207-217 (1999).</li><li>Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX:+the+histone+guardian+of+the+genome.">H2AX: the histone guardian of the genome.</a> DNA repair. 3, 959-967 (2004).</li><li>Croft, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+localization+and+morphology+of+chromosomes+in+the+human+nucleus.">Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus.</a> The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).</li><li>Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Xist+RNA+in+the+formation+of+a+repressive+nuclear+compartment+into+which+genes+are+recruited+when+silenced.">A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced.</a> Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).</li><li>Walter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+many+colors+in+FISH+on+3D-preserved+interphase+nuclei.">Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei.</a> Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).</li><li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+wave+of+cellular+imaging.">A new wave of cellular imaging.</a> Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).</li><li>Dobbie, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMX:+a+new+platform+for+multimodal,+multichannel+wide-field+imaging.">OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).</li><li>Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+with+high-complexity+repeat-free+oligonucleotide+probes+generated+by+massively+parallel+synthesis.">Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis.</a> Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).</li></ol>

제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

위에 설명 된 기술은 림프구에게 30,31 개발에 면역 글로불린 및 Tcra / D loci의 V (D) J 재조합의 규정을 분석하기 위해 실험실에서 사용되었습니다. 우리는이 기술이 다른 세포 유형의 다양한 핵 단백질, 핵 구획과 loci의 감지,에 적응 될 수 있다는 확신합니다. 프로토콜의 수정이 필요할 수 있습니다,이 경우에 초점을 주요 단계는 다음과 같습니다. 첫째, permeabilization의 길이는 ?...

Epigenetic 메커니즘을 트리거 설치 및 발달 및 세포 유형의 특정 전사의 프로필 상속. 한 수준에서이 활성 또는 자동 게놈 영역을 정의 염색질 포장 변조를 포함합니다. 큰 규모에서 게놈과 핵 건축의 글로벌 3D 조직은 전사 패턴의 제어 역할을한다. 따라서, 이러한 epigenomic 기능의 해부는 유전자 6-11을 규제하는 방법의 전체 이해 필수적입니다. 결합 immunofluorescence 및 3D DNA의 물고기는 특정 상호 작용 / 핵 내에서 DNA 시퀀스 및 / 또는 단백질의 연결을 평가하여 분자 및 생화학 분석을 보완 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 동안 또한, 같은 염색질 immunoprecipitation (칩 seq) 또는 깊은 시퀀싱와 결합 염색체 캡쳐 형태로 게놈 전체의 높은 처리량 기술 (4C-seq, 5C는, 하이-C) 글로벌 DAT를 제공합니다세포 인구 12, immunofluorescence / DNA 물고기 기술은 단일 세포 수준에서 분석 할 수 있습니다. 여기 3D 현미경 및 분석 (3D immuno - 물고기) 다음 DNA 생선의 immunofluorescence와 DNA 시퀀스에 의한 히스톤 수정의 동시 검출을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜의 장점은 DNA와 단백질 구조의 보존을 결합 시각화입니다. 이 분야에 경험은 기존 프로토콜을 개선하고 단순화 할 수있게되었습니다. 우리가 재조합를 겪고 림프구에 DNA 이중 좌초 휴식을 감지하는이 프로토콜을 사용했지만,이 방법은 다른 단백질과 다른 세포 유형에 적용 할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 어부 </td><td> # BP2470 </td><td></td></tr><tr><td> RNase </td><td> 시그마 </td><td> # R4642 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td> 시그마 </td><td> # DNTP100 </td><td></td></tr><tr><td> 알렉사 dUTP </td><td> Invitrogen </td><td> # C11397에 대한 C-11401 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3 또는 Cy5 dUTP </td><td> 어부 </td><td> # 45-001-XXX </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> 로슈 </td><td> # 04536282001 </td><td></td></tr><tr><td> DNA 폴 I </td><td> Biolabs </td><td> # M0209 </td><td></td></tr><tr><td> 0.025 μm 필터 </td><td> Millipor전자 </td><td> # VSWP02500 </td><td></td></tr><tr><td> 침대-1 DNA 1 MG / ML </td><td> Invitrogen </td><td> # 18440 </td><td></td></tr><tr><td> Hybloc DNA 1 MG / ML </td><td> 응용 유전학 </td><td> # MHB </td><td></td></tr><tr><td> 연어 정자 </td><td> 시그마 </td><td> # D1626 </td><td> 분말은 H 2 O에 10 밀리그램 / ML에 resuspended 할 </td></tr><tr><td> NaAc (나트륨 아세테이트, 산도 5.2 완충 용액) </td><td> 시그마 </td><td> # S7899 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 400 (몰 Biol 학년) </td><td> 어부 </td><td> # 525 </td><td></td></tr><tr><td> Polyvinylpyrrolidone (몰 Biol 학년) </td><td> 어부 </td><td> # BP431 </td><td></td></tr><tr><td> Dextran 황산 분말 </td><td> 시그마 </td><td> # D8906 </td><td></td></tr><tr><td> SSPE (식염 - 나트륨 인산-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 20x 솔루션 </td&gt; <td> 어부 </td><td> # BP1328 </td><td></td></tr><tr><td> 포름 아미드 </td><td> 어부 </td><td> # BP227 </td><td></td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> 어부 </td><td> # 12-548-B </td><td></td></tr><tr><td> 슬라이드 </td><td> 어부 </td><td> # 12-550 </td><td></td></tr><tr><td> 6 - 잘 접시 </td><td> 어부 </td><td> # 0720080 </td><td></td></tr><tr><td> 10X PBS, </td><td> 어부 </td><td> # MT-46-013-CM </td><td></td></tr><tr><td> 폴리-L-라이신 솔루션 </td><td> 시그마 </td><td> # P8920 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde, prills, 95 % </td><td> 시그마 </td><td> # 441244 </td><td></td></tr><tr><td> 트리톤-X-100, 몰 Biol 학년 </td><td> 시그마 </td><td> # T8787 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (소 혈청 알부민) 분수 V </td><td> 어부 </td><td> # BP 1600 </td><td></td></tr><tr><td> 일반 염소 혈청 </td><td> 벡터 연구소 </td><td> # S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> 십대 초반 - 2​​0 몰 Biol 학년 </td><td> 시그마 </td><td> # P9416 </td><td></td></tr><tr><td> SSC (식염 나트륨 시트르산) 20x 솔루션 </td><td> 어부 </td><td> # BP1325 </td><td></td></tr><tr><td> 골드 antifade 시약을 연장 </td><td> Invitrogen </td><td> # P36930 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI (4 &#39;, 6 diamidino-2-phenylindole) </td><td> 시그마 </td><td> # D9542 </td><td></td></tr><tr><td> 최고의 시험 한 코트 고무 시멘트 </td><td> 예술 또는 사무실 공급 상점 </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 1. 특정 시약 및 소형 장비. </td></tr></tbody></table>

combined immunofluorescence and dna fish on 3d-preserved interphase nuclei to study changes in 3d nuclear organization

3D 공 촛점 현미경에 이어 3 치수 보존 핵에 DNA 프로브를 사용하여 원위치 하이브리드 화에 형광은 (3 차원 DNA 물고기) 각 셀의 하위 지역 염색체 유전자 loci의 위치, 또는 전체 지역을 시각화 할 수있는 가장 직접적인 방법을 나타냅니다. 분석이 유형의 핵의 글로벌 아키텍처뿐만 아니라 핵 공간 내의 특정 게놈의 loci와 지역의 행동에 대한 통찰력을 제공합니다. Immunofluorescence는 반면에, 핵 단백질의 검출을 (수정 histones, 히스톤 변형과 수식, 전사 기계 요소, 핵 하위 구획 등) 할 수 있습니다. immunofluorescence 및 3D DNA 물고기를 결합의 주요 과제는 핵의 3D 아키텍처뿐만 아니라 항체에 의해 검출 된 에피토프를 유지하기 위해 한 손에 있으며, 반면에, DNA 프로브의 침투가 감지 할 수 있도록 유전자 loci 또는 염색체 지역 1-5. 여기 3D 보존 핵의 게놈 loci과 염색질 수정 시각화를 결합한 프로토콜을 제공합니다.

DNA와 immuno-생선은 B와 T 림프구 개발하는 동안 항원 수용체 loci의 V (D) J 재조합의 과정과 관련된 핵 조직의 변화를 연구하기 위해 Skok 실험실에 사용됩니다. 위에 설명 된 기법은) 우리는 전 현장의 두 끝 (수축) 사이) 측정 거리에 ii) 대립 유전자 또는 loci (페어링) 사이를 측정 거리, III)가, loci에서 IV를 발생하는 DNA 손상을 분석 가능하게 대립 유전자의 위치를​​ 평가 및 하위 구획 (우리의 연구에...

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Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

여기 3D 현미경 및 분석 (3D immuno-DNA의 물고기)에 의해 다음 DNA 생선의 immunofluorescence와 DNA 시퀀스에 의한 히스톤 수정의 동시 검출을위한 프로토콜을 설명합니다.

3D 원자력기구의 변화를 공부하기 위해 3D 보존 된 계면 핵에 결합 Immunofluorescence와 DNA의 물고기

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

combined-immunofluorescence-dna-fish-on-3d-preserved-interphase

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K 조회수.  New York University School of Medicine. 여기 3D 현미경 및 분석 (3D immuno-DNA의 물고기)에 의해 다음 DNA 생선의 immunofluorescence와 DNA 시퀀스에 의한 히스톤 수정의 동시 검출을위한 프로토콜을 설명합니다.

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Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

도마뱀의 운동의 속도와 방향에 시각 민감도 테스트

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

연구

생물학

DNA-based Fish Species Identification Protocol

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. This versatile method employs PCR amplification of genomic DNA extracted from fish samples, followed by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis to generate fragment patterns that can be resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer and matched to the correct species using RFLP pattern matching software.
The fish identification method uses a simple, reliable, spin column- based protocol to isolate DNA from fish samples. The samples are treated with proteinase K to release the nucleic acids into solution. DNA is then isolated by suspending the sample in binding buffer and loading onto a micro- spin cup containing a silica- based fiber matrix. The nucleic acids in the sample bind to the fiber matrix. The immobilized nucleic acids are washed to remove contaminants, and total DNA is recovered in a final volume of 100 &mu;l. The isolated DNA is ready for PCR amplification with the provided primers that bind to sequences found in all fish genomes. The PCR products are then digested with three different restriction enzymes and resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer. The fragment lengths produced in the digestion reactions can be used to determine the species of fish from which the DNA sample was prepared, using the RFLP pattern matching software containing a database of experimentally- derived RFLP patterns from commercially relevant fish species.

This publication describes how to use the Agilent Fish Species Identification System to identify the species of a fish by extracting DNA and performing PCR and RFLP analysis.

DNA 기반의 어종 식별 프로토콜

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

직접 레이블이 프로브를 사용하여 강력한 3D DNA 물고기

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to the histological and morphological development of vertebrate embryos. In particular, the use of chimeric embryos has established the importance of neural crest in directing the species-specific morphology of the craniofacial complex. The method described herein utilizes two avian species, duck and quail, with remarkably different craniofacial morphology. This method greatly facilitates the investigation of molecular and cellular regulation of species-specific pattern in the craniofacial complex.&#160;Experiments in quail and duck chimeric embryos have already revealed neural crest-mediated tissue interactions and cell-autonomous behaviors that regulate species-specific pattern in the craniofacial skeleton, musculature, and integument. The great diversity of neural crest derivatives suggests significant potential for future applications of the quail-duck chimeric system to understanding vertebrate development, disease, and evolution.

This article describes a method to generate chimeric embryos that are&#160;designed to test the species-specific contributions of neural crest and/or other tissues to craniofacial development.

메추라기 오리 키메라를 사용하여 두개 안면 개발에 종 - 특정 포스트 평가

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

결합 된 DNA-RNA 형광<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 화 (물고기) 차별화 된 여성 마우스 배아 줄기 세포에서 X 염색체의 불 활성화를 연구하는

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

만성 후 마우스 비장 세포에서 DNA 손상 및 복구를 측정<em&gt; 생체</em&gt; 베타와 감마 방사선의 매우 낮은 복용량에 노출

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

특정 게놈 지역과 enChIP으로 관련 분자의 식별의 분리

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

꼬마 선 충 나이 연구 변화 내재 단백질 집계에 방법

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Sequential Immunofluorescence and Immunohistochemistry on Cryosectioned Zebrafish Embryos

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish embryo is an excellent tool for examining such interactions with an in vivo model. Whole-mount immunohistochemical and immunofluorescence assays are frequently applied in zebrafish embryos to assess protein expression. However, it can be difficult to achieve accurate mapping of co-localized proteins in three-dimensional space. In addition, some studies may require the use of two antibodies that are not compatible with the same technique (e.g., antibody 1 is only suitable for immunohistochemistry and antibody 2 is only suitable for immunofluorescence). The purpose of the method described herein is to perform sequential immunofluorescence and/or immunohistochemistry on individual cryosections derived from early-stage zebrafish embryos. Here we describe the use of sequential rounds of immunofluorescence, imaging, immunohistochemistry, imaging for a single cryosection in order to achieve precise identification of protein expression at the single-cell level. This methodology is suitable for any study in early-stage zebrafish embryos that requires accurate identification of multiple protein targets in individual cells.

This protocol demonstrates sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosections from early-stage zebrafish embryos enabling precise colocalization analyses in specific cell populations.

냉동 제브라피시 배아의 순차적 면역형광 및 면역성화학

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.