이 연구 프로젝트는 알코올 남용과 알코올 중독에 국립 연구소에서 보너스 번호 R21AA017735 (YS)에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 알코올 남용 및 알코올 중독이나 건강의 국립 연구소에있는 국립 연구소의 공식 견해를 대변하지 않습니다. 저자는 또한이 원고를 편집 Charisse 몽고메리 감사드립니다.

1. 동물 사육 및 영양 펩타이드 치료 <ol><li> 2 시간 동안 남성의 홈 케이지에 암컷 생쥐 (~ 육주 세, 평균 체중 20g)을 배치하여 품종 C57BL/mice. </li><li> 즉시 나중에 정자 플러그 및 / 또는 질 세포진 검사를 확인합니다. </li><li> 긍정적 인 경우, 배아 0 일 (E0)로이 시점을 지정합니다. </li><li> 최근에 설명 된대로 E7에, 제어 및 치료 그룹에 임신 한 암컷 체중 성냥 (3 그룹)가 할당됩니다 4 : 1) 알코올 (에탄올) 액체 다이어트 그룹 (ALC), 2) 쌍 공급 대조군 (PF), 3) 알코올 노출 액체 다이어트 (ALC/ADNF-9)와 함께 ADNF-9 펩타이드의 복강 내 (IP) 주입을 받아야한다 펩타이드 치료 그룹. ALC 및 PF 다이어트의 준비의 세부 사항 및 IP 주사 절차는 우리의 최근 작업 4에서 찾을 수 있습니다. </li><li> 영양의 단독 소스로 무료로 이용하실로 제공 할 수 있습니다 매일 알코올 액체 다이어트를 측정한다. PF 액체 다이어트 개별적 t 멍에O는 ALC 댐뿐만 아니라 매일 측정 할 수 있습니다. </li><li> 이전 24 시간 동안 소비 된 액체 다이어트의 볼륨에서 녹음 할 수 있습니다 30 ML 스크류 캡 튜브를 졸업하고 갓 준비한 다이어트 E7에서 E13까지 (매일)가 제공되어야한다. </li></ol> 2. 태아 및 태아의 두뇌 이외에 Microdissection의 해부 <ol><li> 깊이 자궁 경부 전위 다음 CO 2 절차에 마우스를 euthanizing으로 E13에서 임신 한 쥐를 희생. </li><li> 70 % 에탄올로 절개 복부 사이트를 청소합니다. </li><li> 멸균 가위와 집게를 사용하여 복부 절개를합니다. </li><li> 복부가 열리면, 한 집게로 잡고 멀리 자궁 mesometrium를 찢어 다른 집게를 사용하여 자궁을 해부. 배아를 펑 쳐링 방지하기 위해 천천히이 절차를 수행해야합니다. </li><li> 자궁에서 배아를 제거하고 행크스 &#39;밸런스드 소금 솔루션을 포함 (60mm X 15mm) 세포 배양 접시에 전송할<html> (HBSS) 얼음 냉수합니다. </li><li> microdissection을위한 입체 현미경 하에서 전체 배아에서 태아의 뇌를 해부. </li><li> microdissection을위한 초 미세 집게를 사용하여 두개골을 노출 머리의 상단 부분에있는 태아의 피부를 당겨. </li><li> 일단 두개골 노출 명확하게하고 척수와 뇌간 영역에서 뇌의 뒤쪽 부분에서 시작하여 두개골을 벗겨, microdissection을의 실체 현미경 아래에서 시각. </li><li> 머리의 앞쪽 부분에 후방에서 조각에 의한 두개골 조각을 벗겨주십시오. </li><li> 태아의 뇌가 시각적으로 노출되면, 압축을 해제를 진행합니다. </li><li> primordium 후각 망울의 기지에서 metencephalon의 기초에 태아의 뇌를 해부. </li><li> 접미사는 모두 2 ~ 3 일 4 % 파라 포름 알데히드 태아 뇌를 해부. 당신이 서양 얼룩이나 효소 분석을 위해 그들을 테스트하는 경우에는 각 댐에서 다른 태아의 두뇌를 고정 할 수 있습니다. </li></ol>NT &quot;&gt; 참고 : 동물 사용에 대한 절차는 기관 동물 관리에 의해 승인 기관 동물 관리의 지침에 따라하고 건강의 국립 연구소에서 사용위원회 톨레도 대학의위원회에 대한 가이드를 사용했다 실험실 동물의 관리 및 사용. 3. 단면에 대한 젤라틴 태아 두뇌를 포함 <ol><li> 젤라틴 등급 A의 10 %를 준비 </li><li> 중간 껍질 - 멀리 삽입 형을 입력하고 젤라틴 굳은 때까지 기다립니다. </li><li> 응고 된 젤라틴의 상단에 위치 제어 및 태아 치료 태아의 두뇌 나란히. 이 제어 및 실험 그룹 모두 간 세포 죽음의 면역의 일관된 상태를 유지하는 것입니다. </li><li> (젤라틴이 너무 섹시하지 있는지 확인) 완료 형을 만들기 위하여 태아 두뇌의 상단에 젤라틴 액체를 추가합니다. </li><li> 15 분 동안 태아의 뇌를 보유하고 준비된 젤라틴 형 냉장. </li><li> 벗겨다음 임베딩 금형 플라스틱과는 이틀 동안 4 % 파라 포름 알데히드로 미리 만든 젤라틴을 포함하는 태아의 뇌를 전송합니다. </li><li> 의 장소 섹션은 태아의 뇌를 고정 젤라틴 관상 절편 50 μm의 두께로 vibratome 단면 기계 (라이카 VT 1000S)를 사용. 더 나은 해부학 적 기능을 제공하기 때문에 두께는 우리의 연구에서 테스트됩니다. 또한, 25 ㎛의 두께 이상은 10 % 젤라틴 태아의 두뇌에서 임베디드 관련이 기술을 테스트 할 수 있습니다. 전뇌에서 기저핵 예하 수준에서 vibratome를 사용하여 코로나 섹션이 잘린합니다 </li><li> 인산염 완충 식염수 (PBS) 용액에 태아의 뇌 부분을 수집합니다. </li><li> 물에 Superfrost 플러스 슬라이드에있는 태아의 뇌 부분을 마운트합니다. </li><li> 15 분의 장착 부분을 건조. </li><li> TUNEL 반응의 다음날 테스트를 위해 PBS에 슬라이드 (태아 뇌 부분에 장착)를 배치. </li></ol> 4. 드에 대한 TUNEL 반응세포 죽음 또는 세포 사멸의 방호 (TUNEL : TDT-중재 dUTP 닉 엔드 라벨, TDT : 터미널 deoxynucleotidyl 전이). 이 분석은 세포 죽음을 결정하기위한 것입니다. <ol><li> 37 ° C (20 ML PBS에 혼합 단백질 분해 효소 K 300 μL)에서 5 분 단백질 분해 효소 K (20 ㎍ / ㎖)을 Superfrost 플러스 슬라이드에 장착 된 태아의 뇌 부분을 처리합니다. 슬라이드) 5 Plend 열린 애스턴에 조립됩니다. </li><li> 궤도 셰이커에 따라 5 분 PBS 세 번으로 태아의 뇌 섹션 (슬라이드에 장착) 린스. </li><li> 3 % 상온에서 10 분 (3 ML 30 % 27 H 2 O 2 ㎖ 100 % 메탄올) (슬라이드 셰이커에 있으면 안)에 대한 메탄올의 H 2 O 2 섹션을 품어. </li><li> 궤도 셰이커 5 분 동안 PBS 세 번에 섹션을 씻어. </li><li> 얼음에 2 분 (4 ° C) (100 μL TritonX + 0.1 g 나트륨 구연산 + 99.9 ML distille에 대한 permeabilization 솔루션의 섹션 (0.1 % 0.1 % 구연산 나트륨의 TritonX-100)를 품다D 물). </li><li> 궤도 셰이커 5 분 동안 PBS의 섹션을 두 번 헹구십시오. </li><li> 슬라이드의 섹션 주위에 건조한 지역. </li><li> PAP 펜을 사용하여 Superfrost 플러스 슬라이드에 장벽을 그립니다. 이 모든 TUNEL 양성 세포의 검출을위한 섹션을 치료하는 데 사용됩니다 용액의 누출을 방지하기위한 것입니다. </li><li> 37 1 시간에 대한 TUNEL 반응 혼합물 (병 1에서 50 μL 병 2 ~ 450 μL) ° C와 섹션을 품어, 컨트롤이 병 2의 용액에서 배양하여 사용됩니다. </li><li> 궤도 셰이커 아래 PBS 세 번 5 분 씻어. </li><li> 조직의 주위에 건조한 지역. </li><li> 37 30 분 동안 컨버터 POD로 섹션을 품어 ° C. </li><li> 트리스 염산 (산도 7.5, 0.05 M)를 5 분 동안 절을 세 번 씻어. </li><li> 0.05 % 3&#39;-3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) 및 0.003 % H 2 O 2 (25 ML 트리스 염산, pH7.5, 0.05 M + 25 ㎕의 3 % H 2 0 2 + 500의 7 분의 섹션을 품어 μL DAB4)에서 Oribtal 통 아래 ° C (얼음)와 어두운 곳에서 () 새로운 5 Plend 오픈 우편물이 절차를 수행해야합니다. </li><li> 궤도 셰이커 아래 PBS 세 번 5 분으로 섹션을 씻어. </li><li> 다음 섹션 프로토콜에 설명 된대로 Nissl 염색법을 처리 한 후 PBS에서 더 이상 24 이상의 시간 동안 PBS에있는 슬라이드 섹션을 유지합니다. </li></ol> 참고 : DAB는 발암 물질이다. 장갑을 사용하고 모두 한 번 실험을 완료 표백제로 사용되는 모든 요리를 청소합니다. 5. 현미경 관찰을위한 태아 뇌 섹션의 준비를 위해 Nissl 염색 <ol><li> Nissl 염색 과정은 생물 안전 후드에서 수행되어야한다. </li><li> 2 분 동안 탈 이온수로 슬라이드 부분을 씻어. </li><li> 2 분 70 % 에탄올의 섹션을 품어. </li><li> 6 분 95 % 에탄올에 섹션을 품어. </li><li> 2 분 70 % 에탄올의 섹션을 품어. </li><li> 탈 와트의 섹션을 씻어2 분 동안 어. </li><li> 크레 실 바이올렛의 섹션 3 분 얼룩 품어. </li><li> 2 분 동안 탈 이온수의 섹션을 씻어. </li><li> 2 분 70 % 에탄올의 섹션을 품어. </li><li> 3 분 95 % 에탄올 + 3 ML 빙초산을에 섹션을 품어. </li><li> 2 분 95 % 에탄올에 섹션을 품어. </li><li> 2 분 3 회 100 % 에탄올에 섹션을 품어. </li><li> 10 분 3 회 크실렌의 섹션을 품어. </li><li> 태아의 뇌 부분을 잡고 슬라이드 글라스를 덮고 퍼 마운트로 봉입 및 커버 슬립 유리 슬라이드를 사용하여 장착 할 수 있습니다. </li><li> 장착 하룻밤 현미경 관찰과 분석을하기 전에 슬라이드 둡니다. </li><li> 현미경 관찰과 현미경 사진은 라이카 직립 현미경으로 수행 할 수 있습니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Sari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+neuroprotective+protein-derived+peptide,+NAP,+preventing+alcohol-induced+apoptosis+in+fetal+brain+of+C57BL/6+mouse.">Activity-dependent neuroprotective protein-derived peptide, NAP, preventing alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mouse.</a> Neuroscience. 158 (4), 1426-1435 (2009).</li><li>Sari, Y., Chiba, T., Yamada, M., Rebec, G. V., Aiso, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+peptide,+colivelin,+prevents+alcohol-induced+apoptosis+in+fetal+brain+of+C57BL/6+mice:+signaling+pathway+investigations.">A novel peptide, colivelin, prevents alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mice: signaling pathway investigations.</a> Neuroscience. 164 (4), 1653-1664 (2009).</li><li>Sari, Y., Hammad, L. A., Saleh, M. M., Rebec, G. V., Mechref, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+selective+neurotransmitters+in+fetal+brains+of+prenatally+alcohol-treated+C57BL/6+mice:+quantitative+analysis+using+liquid+chromatography/tandem+mass+spectrometry.">Alteration of selective neurotransmitters in fetal brains of prenatally alcohol-treated C57BL/6 mice: quantitative analysis using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 28 (3), 263-269 (2010).</li><li>Sari, Y., Weedman, J. M., Ge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+neurotrophic+factor-derived+peptide+prevents+alcohol-induced+apoptosis,+in+part,+through+Bcl2+and+c-Jun+N-terminal+kinase+signaling+pathways+in+fetal+brain+of+C57BL/6+mouse.">Activity-dependent neurotrophic factor-derived peptide prevents alcohol-induced apoptosis, in part, through Bcl2 and c-Jun N-terminal kinase signaling pathways in fetal brain of C57BL/6 mouse.</a> Neuroscience. 202, 465-473 (2012).</li><li>Sari, Y., Zhang, M., Mechref, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+proteins+in+fetal+brains+of+alcohol-treated+prenatally+C57BL/6+mice:+a+proteomic+investigation.">Differential expression of proteins in fetal brains of alcohol-treated prenatally C57BL/6 mice: a proteomic investigation.</a> Electrophoresis. 31, 1-14 (2010).</li><li>Bassan, M., Zamostiano, R., Davidson, A., Pinhasov, A., Giladi, E., Perl, O., Bassan, H., Blat, C., Gibney, G., Glazner, G., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+sequence+of+a+novel+protein+containing+a+femtomolar-activity-dependent+neuroprotective+peptide.">Complete sequence of a novel protein containing a femtomolar-activity-dependent neuroprotective peptide.</a> J. Neurochem. 72 (3), 1283-1293 (1999).</li><li>Brenneman, D. E., Hauser, J., Neale, E., Rubinraut, S., Fridkin, M., Davidson, A., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+neurotrophic+factor:+structure-activity+relationships+of+femtomolar-acting+peptides.">Activity-dependent neurotrophic factor: structure-activity relationships of femtomolar-acting peptides.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 285 (2), 619-627 (1998).</li><li>Spong, C. Y., Abebe, D. T., Gozes, I., Brenneman, D. E., Hill, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+fetal+demise+and+growth+restriction+in+a+mouse+model+of+fetal+alcohol+syndrome.">Prevention of fetal demise and growth restriction in a mouse model of fetal alcohol syndrome.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 297 (2), 774-779 (2001).</li><li>Sari, Y., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+deficits+associated+with+fetal+alcohol+exposure+may+be+protected,+in+part,+by+peptides+derived+from+activity-dependent+neurotrophic+factor+and+activity-dependent+neuroprotective+protein.">Brain deficits associated with fetal alcohol exposure may be protected, in part, by peptides derived from activity-dependent neurotrophic factor and activity-dependent neuroprotective protein.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 52 (1), 107-118 (2006).</li><li>Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+femtomolar-acting+neuroprotective+peptide.">A femtomolar-acting neuroprotective peptide.</a> J. Clin. Invest. 97 (10), 2299-2307 (1996).</li><li>Zamostiano, R., Pinhasov, A., Gelber, E., Steingart, R. A., Seroussi, E., Giladi, E., Bassan, M., Wollman, Y., Eyre, H. J., Mulley, J. C., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+the+human+activity-dependent+neuroprotective+protein.">Cloning and characterization of the human activity-dependent neuroprotective protein.</a> J. Biol. Chem. 276 (1), 708-714 (2001).</li><li>Offen, D., Sherki, Y., Melamed, E., Fridkin, M., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasoactive+intestinal+peptide+(VIP)+prevents+neurotoxicity+in+neuronal+cultures:+relevance+to+neuroprotection+in+Parkinson's+disease.">Vasoactive intestinal peptide (VIP) prevents neurotoxicity in neuronal cultures: relevance to neuroprotection in Parkinson's disease.</a> Brain Res. 854 (1-2), 257-262 (2000).</li><li>Steingart, R. A., Solomon, B., Brenneman, D. E., Fridkin, M., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VIP+and+peptides+related+to+activity-dependent+neurotrophic+factor+protect+PC12+cells+against+oxidative+stress.">VIP and peptides related to activity-dependent neurotrophic factor protect PC12 cells against oxidative stress.</a> J. Mol. Neurosci. 15 (3), 137-145 (2000).</li></ol>

어떤 공개가 이루어지지합니다.

본 연구에서 제시 한 방법론과 기술은 태아 태아 두뇌에 알코올 노출과 이러한 효과의 예방에 영양 펩티드의 역할의 효과를 보여줍니다. 이들은 다른 임신 단계에서 남용 또는 태아 뇌의 다른 독성 화학 물질의 다른 약물을 연구하는 방법에 대한 정보를 제공 할 수 있습니다. 사육 패러다임에 관해서, 어떤 경우에는 정자 플러그의 검출은 관찰되지 않을 수 있습니다. 이 시점...

여기에 설명 된 실험 방법의 목표는 먹이 microdissecting 및 세포 죽음을 감지, 번식과 관련된 여러 가지 기술을 사용하여 태아 알코올 노출 모델에서 영양 펩타이드의 신경 효과를 평가하는 것입니다. 우리 실험실에서 작업 알코올의 양 기간에 인간 마시는 패러다임과 유사 할 수있는 적당한 음주의 모델로 알코올과 혼합 액체 음식을 포함했다하면 1-5 소비. 우리와 다른 태아 알코올 노출의 해로운 영향으로부터 신경 세 가지 펩타이드 유도체를 발견했습니다. 동물 모델을 사용하여 배아 단계에서 알코올 노출을 조사 연구는 신경 보호의 잠재적 인 메커니즘의 신분으로 이어질 중재 절차의 개발을 허용 할 수 있습니다. 이 임신 중 알코올 노출의 해로운 효과의 신경 효과와 감쇠에 대한 충분한 정보를 제공 할 수 있습니다. 태아 알코올 노출의 영향을 가능한 한 방지 체외 6,7와 in vivo 1,2,4,8,9의 신경 보호에 관여하는 것으로 알려져있다 펩타이드와 임신 한 생쥐의 치료를 포함 할 수 있습니다. 이러한 펩타이드 중, ADNF-9 또는 SAL로 알려진 SALLRSIPA은, 활동에 따라 신경 영양성 인자 (ADNF) 7,10에서 파생됩니다. 순서 NAPVSIPQ 펩티드라고 NAP, 또 다른 펩티드 활동에 따라 신경 단백질 (ADNP) 6,11에서 파생 된 알코올 노출 12,13과 관련된 산화 스트레스에 대한 강력한 보호 효과를 보여 주었다. 또한, 우리는 최근 태아 알코올 노출 모델 2에 중요한 신경 역할을 표시하는 새로운 합성 펩티드, colivelin을 발견했습니다. Colivelin는 ADNF-9 AGA-(C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP)으로 구성되어 있습니다. 이 펩티드의 사용의 중요성은 그들이 할 수있는 기능을 가지고있다알코올에 의한 세포 사멸과 뇌의 성장 적자의 영향을 방지하기 위해 뇌 혈액 장벽을 통과. 실험 방법은 알콜에 의한 세포 사멸에 대한 신경 보호 효과를 테스트하기 위해 C57BL / 6 생쥐를 사용 하였다. 우리는 그것이 정자 플러그 및 질 세포진 검사 1-5의 검출에 의해 밝혀 질 수 정확하게, 배아 일 0 (E0)를 추정하기 위해 대신 하룻밤 사육 2 시간 창을 채택했다. 우리는이가 임신 한 쥐에 스트레스를 유발할 수 있습니다 투여 경로를 통해 대신 알코올 배송 무료 액세스로 간주되는, 공급 튜브 액체 다이어트를 사용했습니다. 반면에, microdissection을 조기 배아 단계에서 태아의 뇌를 해부 할 때 발생할 수있는 태아 뇌 조직의 부드러움으로 인해 도전 할 수 있습니다. 여기, 우리는 microdissection을 관련된 모든 문제를 처리하는 시각 기술을 보여줍니다. 또한, 태아의 뇌 절편도 도전 할 수 있기 때문에, 우리는 채택젤라틴 포함 껍질 - 멀리하여 금형 태아 두뇌를 포함 포함하는 기술. 우리는 50 μm의 두께로 무료 부동 섹션에서 태아 뇌를 절단에 성공했다. 이것은 우리가 세포 죽음의 식별을 포함하여, 태아의 뇌 섹션에서 콘텐츠 단백질의 변화를 조사 할 수 있습니다.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent/equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Superfrost Plus Slides</td>
 <td>VWR</td>
 <td>48311-703</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PAP PEN</td>
 <td>Research Products Int. Corp.</td>
 <td>195506</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5-Plend Open Mailer </td>
 <td>Heathrow Scientific, LLC</td>
 <td>HS 15983G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peel away embedding molds</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>70182</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>In situ cell death detection kit, POD</td>
 <td>Roche Diagnostics, Inc</td>
 <td>11684817910</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hanks' Balanced Salt Solution</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>14170-120 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gelatin Type A</td>
 <td>FisherScientific</td>
 <td>G8-500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope</td>
 <td>W. NUHSBAUM, Inc </td>
 <td>Leica M60, KL 200 LED</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro-Vibratome</td>
 <td>Leica, Inc </td>
 <td>Leica VT 1000S</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Moria Ultra Fine Forceps </td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11370-40</td>
 <td>2 pairs</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Graduate 30 ml feeding tubes</td>
 <td>Dyets, Inc </td>
 <td>900012 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vitamin Mix </td>
 <td>Bio-Serv. Inc. </td>
 <td>F8031 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mineral Mix</td>
 <td>Bio-Serv. Inc. </td>
 <td>F8598 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Maltose Dextrin</td>
 <td>Bio-Serv. Inc. </td>
 <td>3650 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethyl alcohol 190 Proof, 5 gallons</td>
 <td>111000190-SS05 </td>
 <td>Pharmco-AAPER</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Upright microscope</td>
 <td>W. NUHSBAUM, Inc</td>
 <td>LEICA DM 4000 </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

experimental methods for testing the effects of neurotrophic peptide, adnf-9, against alcohol-induced apoptosis during pregnancy in c57bl/6 mice

태아의 뇌 성장의 초기 배아 단계에서 태아 알코올 노출의 영향을 조사하는 실험 디자인에 도전하고 있습니다. 이 대부분은 태아의 뇌와 알코올 태아 노출로 인한 세포 사멸 세포의 결정에 대한 자신의 절편의 microdissection을의 어려움 때문이다. 실험은 태아의 뇌 조직에있는 세포 죽음의 식별 사육 쥐에서 시각화 기술을 제공합니다 여기에 설명. 본 연구에서는 C57BL 사용 / 알코올에 의한 세포 사멸에 대한 태아 알코올 노출과 영양 펩타이드의 역할을 연구 동물 모델로 6 마우스. 사육 배아 시대의 정확한 단계를 결정하기 위해 2 시간 매트 창으로 구성되어 있습니다. 설립 태아 알코올 노출 모델은 태아의 뇌에있는 태아 알코올 노출의 효과를 결정하기 위해 본 연구에서 사용되었다. 이것은 임신 한 쥐에 대한 영양소의 유일한 소스로 알코올이나 쌍 공급 액체 다이어트에 무료로 액세스를 포함합니다. <p clasS = &quot;jove_content&quot;&gt; 후자는 도전 할 수 있기 때문에 태아 및 태아의 두뇌 microdissection을의 해부와 관련된 기술은주의 깊게 설명되어 있습니다. microdissection을이 입체 현미경과 초 미세 집게를 필요로합니다. 태아의 뇌를 해부하기위한 단계별 절차를 시각적으로 제공됩니다. 태아의 뇌는 primordium 후각 망울의 기지에서 metencephalon의 기본을 해부한다. apoptosis를 조사를 위해, 태아의 두뇌가 먼저 vibratome 기기와 함께 자신의 절편을 촉진하기 위하여 필 - 멀리 금형을 사용하여 젤라틴에 포함됩니다. 파라 포름 알데히드에 포함 된 고정 태아의 뇌는 쉽게 단면이며, 무료 부동 섹션은 세포 사멸 또는 세포 죽음의 결정에 superfrost 플러스 슬라이드에 장착 할 수 있습니다. TUNEL (TDT-중재 dUTP 닉 엔드 라벨, TDT : 전이 터미널 deoxynucleotidyl) 분석은 세포 사멸 또는 사멸 세포를 식별하는 데 사용되었습니다. 그것은 주목할만한 그 APoptosis 및 세포 매개 세포 독성은 DNA 파편을 특징으로하고 있습니다. 따라서, 시각 TUNEL 양성 세포는 세포 사멸 또는 세포 사멸 세포의 지표입니다. 여기에 실험 디자인은 태아 두뇌에 임신 중에 알코올의 영향을 연구 설립 액체 다이어트의 사용에 대한 정보와 신경성 펩티드의 역할을 제공합니다. 이 번식 임신 한 쥐를 먹이 태아의 두뇌를 microdissecting 및 세포 사멸을 결정을 포함한다. 함께, 이러한 시각 및 텍스트 기술은 태아 두뇌에 유해한 에이전트의 태아 노출 조사를위한 소스가 될 수 있습니다.

실험 방법은 2 시간 사육 창 정확한 임신 단계를 추정하는 것이 필수적입니다 것을 보여 여기에 설명. 우리는 E13의 나이에 배아의 절개를 증명하고있다. 우리는 또한 E13에 태아 뇌의 microdissection을을 보여 주었다. 절차는 그림 1에서 설명한 여러 단계 (AC), 포함한다. 태아의 뇌는 primordium 후각 망울의 기지에서 metencephalon의 기초 (그림 1)을 해부한다. 태아의 뇌는 그 면역 탐?...

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Experimental Methods for Testing the Effects of Neurotrophic Peptide, ADNF-9, Against Alcohol-induced Apoptosis during Pregnancy in C57BL/6 Mice

실험 디자인은 태아의 뇌 임신 중 세포 사멸 및 신경성 펩타이드의 응용 프로그램에서 알코올 노출의 효과를 공부에 여기에 초점을 제안했다. 사육에서 태아 뇌의 컬렉션에 대한 자세한 설명이 설명되어 있습니다. 세포 사멸의 결정을위한 기법도 자세히 설명되어 있습니다.

알코올에 의한 C57BL 임신 중 세포 자멸사 / 6 마​​우스에 대하여, 신경 친 화성 펩타이드, ADNF-9의 효과를 테스트하기위한 실험 방법

Experimental designs for investigating the effects of prenatal alcohol exposure during early embryonic stages in fetal brain growth are challenging. This ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.7K 조회수.  University of Toledo. 실험 디자인은 태아의 뇌 임신 중 세포 사멸 및 신경성 펩타이드의 응용 프로그램에서 알코올 노출의 효과를 공부에 여기에 초점을 제안했다. 사육에서 태아 뇌의 컬렉션에 대한 자세한 설명이 설명되어 있습니다. 세포 사멸의 결정을위한 기법도 자세히 설명되어 있습니다.

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Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

포유류의 CNS에서 시신경의 절개 후 실험에 대한 노는 방법

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

연구

신경과학

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

Organotypic 소뇌 문화 : Apoptotic 도전과 감지

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Measuring Motor Coordination in Mice

Mice are increasingly being used in behavioral neuroscience, largely replacing rats as the behaviorist's animal of choice. Before aspects of behavior such as emotionality or cognition can be assessed, however, it is vital to determine whether the motor capabilities of e.g. a mutant or lesioned mouse allow such an assessment. Performance on a maze task requiring strength and coordination, such as the Morris water maze, might well be impaired in a mouse by motor, rather than cognitive, impairments, so it is essential to selectively dissect the latter from the former. For example, sensorimotor impairments caused by NMDA antagonists have been shown to impair water maze performance2. 
Motor coordination has traditionally been assessed in mice and rats by the rotarod test, in which the animal is placed on a horizontal rod that rotates about its long axis; the animal must walk forwards to remain upright and not fall off. Both set speed and accelerating versions of the rotarod are available.
The other three tests described in this article (horizontal bar, static rods and parallel bars) all measure coordination on static apparatus. The horizontal bar also requires strength for adequate performance, particularly of the forelimbs as the mouse initially grips the bar just with the front paws. 
Adult rats do not perform well on tests such as the static rods and parallel bars (personal observations); they appear less well coordinated than mice. I have only tested male rats, however, and male mice seem generally less well coordinated than females. Mice appear to have a higher strength:weight ratio than rats; the Latin name, Mus musculus, seems entirely appropriate. The rotarod, the variations of the foot fault test12 or the Catwalk (Noldus)15 apparatus are generally used to assess motor coordination in rats.

Protocols are presented for two established motor coordination tasks, the accelerating rotarod and horizontal bar, also two tests developed in Oxford recently, the static rods and parallel bars. These tests can detect motor impairments potentially of interest in their own right, as well as being possible variables in tests of other areas of behavior.

마우스에 모터 조정을 측정

Mice are increasingly being used in behavioral neuroscience, largely replacing rats as the behaviorist's animal of choice. Before aspects of behavior such ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

코어 텍스, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, 횡 중격 Nucleus-과 줄무늬 별<em&gt; 자궁 내</em&gt; C57BL / 6 마​​우스에서 Electroporation에

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for neuroprotection, postconditioning treatments have proven to be promising therapies against cerebral ischemia. However, complicated procedures and potential safety issues limit their clinical application. To overcome these disadvantages, we have developed acidic postconditioning (APC) as a therapy for experimental focal cerebral ischemia. APC refers to the mild acidosis treatment by inhaling CO2 during reperfusion following ischemia. Here we present two models to execute APC in vitro and in vivo, respectively. The oxygen-glucose deprivation (OGD) treatment of mice and the corticostriatal occlusion and middle cerebral artery occlusion (MCAO) of mice were employed to mimic cerebral ischemia. APC can be simply achieved by transferring brain slices to acidic buffer bubbled with 20% CO2, or by mice inhaling 20% CO2. APC showed significant protective effects against cerebral ischemia, as reflected by tissue viability and brain infarct volume.

Acidic postconditioning protects against cerebral ischemia. Here we present two models to execute APC. They are achieved respectively by transferring corticostriatal slices to acidic buffer after oxygen-glucose deprivation in vitro and by inhaling 20% CO2 after middle cerebral artery occlusion in vivo.

대뇌 허혈에 대한 산성 후행 조절의 신경 보호를 연구하기위한 실험 모델

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for ...

Sagittal Plane Kinematic Gait Analysis in C57BL/6 Mice Subjected to MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Kinematic gait analysis in the sagittal plane has frequently been used to characterize motor deficits in multiple sclerosis (MS). We describe the application of these techniques to identify gait deficits in a mouse model of MS, known as experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Paralysis and motor deficits in mice subjected to EAE are typically assessed using a clinical scoring scale. However, this scale yields only ordinal data that provides little information about the precise nature of the motor deficits. EAE disease severity has also been assessed by rotarod performance, which provides a measure of general motor coordination. By contrast, kinematic gait analysis of the hind limb in the sagittal plane generates highly precise information about how movement is impaired. To perform this procedure, reflective markers are placed on a hind limb to detect joint movement while a mouse is walking on a treadmill. Motion analysis software is used to measure movement of the markers during walking. Kinematic gait parameters are then derived from the resultant data. We show how these gait parameters can be used to quantify impaired movements of the hip, knee, and ankle joints in EAE. These techniques may be used to better understand disease mechanisms and identify potential treatments for MS and other neurodegenerative disorders that impair mobility.

Kinematic gait analysis in the sagittal plane yields highly precise information about how movement is executed. We describe the application of these techniques to identify gait deficits for mice subjected to autoimmune-mediated demyelination. These methods may also be used to characterize gait deficits for other mouse models featuring impaired locomotion.

MOG35-55를 받게 하는 C57BL/6 쥐에 화살 평면 운동학 걸음 걸이 분석 실험적인 자기 면역 뇌 유발

Kinematic gait analysis in the sagittal plane has frequently been used to characterize motor deficits in multiple sclerosis (MS). We describe the ...

A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by immunizing mice with neurogenic peptides to direct an inflammatory attack toward components of the peripheral nervous system (PNS). Recent advances have enabled the induction of EAN in the relatively resistant C57BL/6 mouse line using myelin protein zero (P0)106-125 or P0180-199 peptides delivered in adjuvant combined with the injection of pertussis toxin. The ability to induce EAN in the C57BL/6 strain allows for the use of the numerous genetic tools that exist on this mouse background, and thus allows the sophisticated study of disease pathogenesis and interrogation of the mechanistic action of novel therapeutics in combination with transgenic approaches. In this study, we demonstrate a simple approach to successfully induce EAN using the P0180-199 peptide in C57BL/6 mice. We also outline a protocol for the assessment of functional deficits that occur in this model, accompanied by an array of neuropathological features. Thus, this model is a powerful experimental model to study the pathogenesis of human peripheral demyelinating neuropathies, and to determine the efficacy of potential therapies that aim to promote myelin repair and protect against nerve damage in autoimmune neuritis.

This report outlines a simple approach to successfully induce experimental autoimmune neuritis (EAN) using the myelin protein zero (P0)180-199 peptide in combination with Freund&#39;s complete adjuvant and pertussis toxin. We present a sophisticated paradigm capable of accurately assessing the extent of functional deficits and neuropathology that occur in this EAN.

기능과 Neuropathological 평가 대 한 C57BL/6 쥐에 실험 자가 면역 신경 염을 유발 하는 간단한 방법

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by ...

Cochlear Implant Surgery and Electrically-evoked Auditory Brainstem Response Recordings in C57BL/6 Mice

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of hearing. Improvement of the implant technology is needed if CI users are to perceive music and perform in more natural environments, such as hearing out a voice with competing talkers, reflections, and other sounds. Such improvement requires experimental animals to better understand the mechanisms of electric stimulation in the cochlea and its responses in the whole auditory system. The mouse is an increasingly attractive model due to the many genetic models available. However, the limited use of this species as a CI model is mainly due to the difficulty of implanting small electrode arrays. More details about the surgical procedure are therefore of great interest to expand the use of mice in CI research.
In this report, we describe in detail the protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in the C57BL/6 mouse strain. We demonstrate the functional efficacy of this procedure with electrically-evoked auditory brainstem response (eABR) and show examples of facial nerve stimulation. Finally, we also discuss the importance of including a deafening procedure when using a normally hearing animal. This mouse model provides a powerful opportunity to study genetic and neurobiological mechanisms that would be of relevance for CI users.

Animal models of cochlear implants can advance knowledge of the technological bases of treating permanent sensorineural hearing loss with electrical stimulation. This study presents a surgical protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in mice as well as the functional assessment with auditory brainstem response.

인공 와우 수술 및 C57BL/6 마우스에 전기 evoked 청각 Brainstem 응답 기록

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of ...

Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 (ChR2), is expressed by a virus vector in a particular type of neuronal cells in various Cre-driver mice. Activation of these opsins is triggered by application of light pulses which are delivered by laser or LED through optic cables, and the effect of activation is observed with very high time resolution. Experimenters are able to acutely stimulate neurons while monitoring behavior or another physiological outcome in mice. Optogenetics can enable useful strategies to evaluate function of neuronal circuits in the regulation of sleep/wakefulness states in mice. Here we describe a technique for examining the effect of optogenetic manipulation of neurons with a specific chemical identity during electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) monitoring to evaluate the sleep stage of mice. As an example, we describe manipulation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis (BNST). Acute optogenetic excitation of these neurons triggers a rapid transition to wakefulness when applied during NREM sleep. Optogenetic manipulation along with EEG/EMG recording can be applied to decipher the neuronal circuits that regulate sleep/wakefulness states.

Here, we describe methods of optogenetic manipulation of particular types of neurons during monitoring of sleep/wakefulness states in mice, presenting our recent work on the bed nucleus of the stria terminalis as an example.

마우스에서 수면/각성 상태를 모니터링하는 동안 신경 회로의 광유전학 적 조작

In recent years, optogenetics has been widely used in many fields of neuroscientific research. In many cases, an opsin, such as channel rhodopsin 2 ...

Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the CSF protein composition delivers crucial information in basic neuroscience research as well as neurological diseases. One caveat is that proteins measured in CSF may derive from both intrathecal synthesis and transudation from serum, and protein analysis of CSF can only determine the sum of these two components. To discriminate between protein transudation from the blood and intrathecally produced proteins in animal models as well as in humans, CSF protein profiling measurements using conventional protein analysis tools must include the calculation of the albumin CSF/serum quotient (Qalbumin), a marker of the integrity of the blood-brain interface (BBI), and the protein index (Qprotein/Qalbumin), an estimate of intrathecal protein synthesis. This protocol illustrates the entire procedure, from CSF and blood collection to quotients and indices calculations, for the quantitative measurement of intrathecal protein synthesis and BBI impairment in mouse models of neurological disorders.

Elevated spinal fluid protein levels can either be the result of diffusion of plasma protein across an altered blood-brain barrier or intrathecal synthesis. An optimized testing protocol is presented in this article that helps to discriminate both cases and provides quantitative measurements of intrathecally synthesized proteins.

쥐의 경내 합성 단백질의 정량적 측정

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the ...

알코올에 의한 C57BL 임신 중 세포 자멸사 / 6 마​​우스에 대하여, 신경 친 화성 펩타이드, ADNF-9의 효과를 테스트하기위한 실험 방법

알코올에 의한 C57BL 임신 중 세포 자멸사 / 6 마우스에 대하여, 신경 친 화성 펩타이드, ADNF-9의 효과를 테스트하기위한 실험 방법