우리는 DNA 검사 라이브러리의 준비를 위해 MGH DNA 코어의 존 Darga 감사합니다. 퍼킨 엘머의 크리스토퍼 Chigas 우리 월락 1420 루미 매우 귀중한 지원을 제공했습니다. 스티븐 Ciacco 및 애질런트의 마틴 Thomae은 브라보 로봇에 대한 지원을 제공했다. 우리는 아낌없이 자신의 이중 글로 루시 페라 제 분석 프로토콜을 제공하기위한 NIH에 론 존슨 (Ron Johnson)과 스티브 디도 감사합니다.

실험 개요는 그림 1을 참조하십시오. 1. 알파 synuclein 발기인을 포함하는 리포터 플라스미드를 준비 알파 synuclein 유전자 (그림 2)의 규정 요소는 인트론 2 ~ 3 상류 NACP (아밀로이드 펩티드의 비 베타 구성 요소) 디 뉴클레오티드 반복 서열 1,2에서 대략 10 킬로바이트, 스팬. 우리는이 지역의 일부를 포함 우리 기자의 구조. 우리는 성장이 필요한 특별한 절차 인트론 포함하는 플라스미드는, 아래에 설명 된대로 나타났습니다. 루시퍼 라제 플라스미드, pGL4.10 및 pGL4.75 (도 3), Promega 사에서 시판하고 종래의 분자 생물학 프로토콜을 사용하여 전달 될 ​​수있다. <ol><li> 표 1의 제조법과 표 2의 프라이머를 사용한 PCR을 별도의 알파 synuclein 촉진제의 2 성분을 증폭한다. </li><li> VERI기 PCR의 TE (트리스-EDTA)의 50 μL의 용출, 제품, QIAquick PCR 정제 키트 (Qiagen)를 사용하여 아가 로스 젤 및 청소에 제품. 향후 사용을 위해 -20 ° C에서 용출 0.9 KB 조각을 저장합니다. </li><li> 를 SacI 및 XhoI에, 전체 3.4 킬로바이트 PCR 단편의 양뿐만 아니라 pGL4.10 5 μg 다이제스트. 송아지 소장 알칼리 포스 파타 아제 (로슈)와 벡터를 처리하고 젤 PureLink의 빠른 젤 추출 키트 (Invitrogen 사)를 사용하여 정제. </li><li> T4의 DNA 리가 제 (NEB)을 사용하여 단편 및 벡터를 결찰. 10 ㎕의 TE 버퍼에 용출 PureLink의 PCR 마이크로 키트 (Invitrogen 사)를 사용하여 완성 된 반응을 청소합니다. </li><li> ElectroMAX Stbl4 능력 세포 (Invitrogen 사) 20 ㎕로 청소 연결 반응의 2 μl를 변환하고, 제조업체의 지침에 따라 electroporate. 90 분 동안 225 rpm에서 30 ° C의 배양기에서 흔들어. 100 ㎎ / ㎖의 암피실린을 포함하는 LB 플레이트에 2 볼륨을 확산하고 2 일 동안 30 ° C에서 알을 품다. </li><li> 이쑤시개를 사용하여, TB 2 ㎖ (좋아요 국물)에 접종 4-6 작은 식민지를 선택합니다. 30 ° C의 셰이커 O / N. 이러한 미니 프렙 문화를 성장 </li><li> PureLink의 HiPure 플라스미드 미니 프렙 키트 (Invitrogen 사)를 이용하여 각각의 미니 프렙 배양 1.5 밀리리터부터 플라스미드 DNA를 정제 하였다. </li><li> 을 BamHI과 minipreps을 소화하고 아가 로스 젤에 electrophorese. 올바른 클론 2.8 KB 4.9 KB의 조각을 생성한다. </li><li> 신선한 LB (루리아 국물) 판의 정확한 복제에 남아있는 미니 프렙 문화를 Restreak 2 일 동안 30 ° C에서 성장한다. </li><li> 작은 식민지를 선택하고 1.5 ML의 TB 스타터 문화를 접종. 30 ° C에서 O / N을 흔들어 스타터 문화가 포화 성장하게하지 마십시오. </li><li> 데워진 TB 150 ㎖로 전체 스타터 문화를 희석하고 2 일 동안 30 ° C에서 흔들. 다음 단계로 진행하기 전에 복제가 replicati 중에 변형되지 않았 음을 확인하기 위해 추가로 미니 프렙 소화이 문화의 1.5 ML를 사용<html> 에. </li><li> PureLink의 HiPure 플라스미드 Maxiprep 키트 (Invitrogen 사)를 이용하여 나머지 배양 물로부터 플라스미드 DNA를 정제 하였다. 이 중간 플라스미드의 예상 수익률은 문화 150 ㎖ 당 50 ~ 150 μg이다. </li><li> 단계 1.2에 얼어 0.9 KB 조각을 해동. 1.3 1.12에이를 KpnI 및 SacI로와 대신 소화, 중간 플라스미드에 0.9 KB 조각을 복제하는 단계를 반복합니다. 결찰, 선택, 변환, 상기와 같이 maxipreps에 성장. 을 BamHI로 소화 5.8 킬로바이트 및 2.8 킬로바이트의 조각을 얻을 수 있어야합니다. 이는 화면에 사용될 플라스미드이다. </li></ol> 2. 심사 293T 세포, 리포터 플라스미드 및 라이브러리 DNA를 준비 293T 세포는 처음 96 - 웰 플레이트에 접종하고 다음 날 형질 전환됩니다. 리포터 플라스미드 및 라이브러리 DNA를 96 - 웰 플레이트에 희석된다. 우리는 매사추세츠 종합 병원 (Massachusetts General Hospital에서 DNA 코어에서 형질 급 라이브러리 DNA의 판을 얻​​을= &quot;_blank&quot;를 얻을&gt; dnacore.mgh.harvard.edu). 이 프로토콜은 293T 세포의 동일한 2 판 (그림 1)에 하나의 라이브러리 판을 transfects, 세포 따라서 2 판을 상영하는 각 라이브러리 플레이트에 접종해야한다. 참고 :이 루시 페라 제 분석에 방해가 각각 형질 동안 독성을 증가로, 빨간색 또는 항생제 페놀없이 미디어의 세포를 성장. <ol><li> 각 라이브러리 플레이트를 14 % FBS를 함유하는 DMEM에 1.5 × 105 세포 / ml의 농도로 재현 탁 트립신 293T 세포를 상영하는. 멸균 저수지 (Axygen)에 붓는다. </li><li> 로봇 갑판에 저장, 2 명확한 바닥, 96 - 웰 플레이트 (코닝), 및 필터 피펫 팁의 상자 (애질런트)를 놓습니다. 물론 당 1.5 × 10 4 세포의 밀도, 두 플레이트의 각 웰에 세포를 100 μl를 분배. </li><li> 동등한 있도록 낮은 램프 속도를 사용하여, 2 분간 50 XG에서 셀 플레이트를 원심 분리기각 웰에 걸쳐 세포 밀도. 37 품어 ° C와 10 %의 CO 2 O / N. </li><li> 혈청이없는 배지에서 5 NG / μL로 개똥 벌레와 레 닐라 기자 플라스미드를 희석. 15 ML 원뿔 튜브 (부피 기준) 반딧불 레 닐라 플라스미드에 5:3 비율로 희석을 결합합니다. </li><li> 각 웰에, 도서관 접시 당 17 μL, 플러스 2-10 μL 과잉 분배 96 - 웰 플레이트의 각 웰에 피펫은 결합 플라스미드. </li><li> 위와 같이 형질 등급 DNA 라이브러리 판을 확보하고 독소가없는 물 33.9 NG / μL로 희석. 물론 당 최소 부피는 28 ㎕를해야한다. </li></ol> 3. 형질을 수행 화면의 2 일에서 기자 플라스미드 및 라이브러리 DNA를 293T 세포에 형질 전환됩니다. <ol><li> 각 라이브러리 플레이트를 들어, 폴리스티렌 튜브에 4.3 ㎖의 혈청이없는 미디어 (1시 40분 희석)와 RT Optifect (인비 트 로젠)의 107.5 μl를 섞는다. 5 RT에서 분, 그리고 알을 품다N 96 - 웰, 폴리스티렌 V-바닥 플레이트 (그레이 너)의 각 웰에 (라이브러리 판 기준) 44 μl를 분배. </li><li> 희석 Optifect의 플레이트, 기자 플라스미드 (단계 2.5), 라이브러리의 DNA (단계 2.6), 로봇 갑판에 피펫 팁 상자를 놓습니다. </li><li> 각각의 열망 사이의 5 μL의 에어 갭을 삽입 기자 플라스미드, 희석 Optifect 43 μL, 도서관 DNA의 26 μL의 17 μL를 대기음. 라이브러리 DNA 교차 오염을 방지하기 위해 마지막으로 발음해야한다. 새로운 폴리스티렌 V 바닥 판에 팁의 내용을 분배, 커버를 혼합, 지질 / DNA 복합체를 형성 할 수 있도록 20 분 동안 방치. 여러 라이브러리 판을 형질 경우, 피펫 팁 및 라이브러리 판을 교체하고 반복합니다. </li><li> Optifect / DNA 혼합물 판을 발견하고 293T 세포의 2 판에 로봇 갑판에 놓습니다. 피펫 팁의 하나의 상자, 대기음 Optifect의 80 μl를 사용 : DNA 혼합물을 천천히 세포의 각 판에 40 μl를 분배. 트랜스 경우여러 라이브러리 판을 fecting, 모든 Optifect를 반복 : DNA 플레이트. 세포를 커버. </li><li> 30 분 동안 1,200 XG에서 셀 플레이트를 원심 분리기. 커버 및 인큐베이터로 돌아갑니다. </li><li> 4-6 시간 동안 세포를 품어. 이 부화하는 동안, 각 형질 라이브러리 판에 10 % FBS 및 10 ㎍ / ㎖의 시프로플록사신 (CellGro)를 포함하는 12 ML의 DMEM을 혼합하여 새로운 미디어를 준비합니다. 멸균 저수지에 신선한 미디어를 붓는다. </li><li> 로봇 팁이 상자를 놓고 세포의 단판, 로봇 데크로 신선한 미디어, 폐기물 저장조를 포함하는 저장조. 대기음 100 세포에서 미디어 μL와 부분적으로 70 % 에탄올로 가득 폐기물 저장소에 분배. 신선한 팁, 새로운 미디어의 대기음 100 μl를 사용하여 천천히 세포에 분배. 세포의 모든 판에 대해 반복합니다. </li><li> 48 시간 동안 인큐베이터에 번호판을 반환합니다. </li></ol> 4. 듀얼 루시 페라 제 분석 실험을 수행 화면의 4 일에,개똥 벌레와 레 닐라 루시퍼 라제 분석이 수행된다. 주 :. 표 3에 설명 된 것처럼 이중 루시퍼 라제 분석은 개똥 벌레 및 레 닐라 luciferases은 따라서 세포가 이전에 루시페라아제 활성을 측정에 용해되어야 분비되지 않으며,이 분석 완충제, 3X 반디 분석 완충액 및 3X 레 닐라 분석 완충액의 순차 첨가를 필요 . 반딧불 분석 버퍼 세포를 lyses과 반딧불 루시 페라 제를위한 기판을 제공 레 닐라 분석 버퍼는 반딧불 신호를 꺼 버리는와 레 닐라 루시퍼를위한 기판을 제공한다. <ol><li> 표 3에 설명 된대로 각 라이브러리 판의 경우, 원액의 3 배 개똥 벌레 분석 버퍼 8 ㎖를 준비하고, 96 - 웰 V-바닥 플레이트의 각 웰에 82 μl를 분배. </li><li> 각 라이브러리 판의 경우에도 3 배 레 닐라 분석 버퍼의 12 ML을 준비하고 96 - 웰 V-바닥 플레이트의 각 웰에 122 μl를 분배. 양 옆으로 설정개똥 벌레와 레 닐라 분석 버퍼. </li><li> 로봇 갑판에 (같은 라이브러리 판에서 형질) 피펫 팁 상자, 폐기물 저장 및 셀의 2 판을 놓습니다. </li><li> 대기음 60 각 판의 용지 μL와 부분적으로 70 % 에탄올로 가득 폐기물 저장소에 버린다. 옆 커버 플레이트 및 설정합니다. 여러 라이브러리 판을 형질 경우, 플레이트의 모든 세트를 반복합니다. </li><li> 2 피펫 팁 상자, 배 개똥 벌레 분석 버퍼의 판, 로봇 갑판에 셀 플레이트 세트를 놓습니다. </li><li> 대기음 40 배 개똥 벌레 분석 버퍼의 μL하고 철저하게 혼합, 세포의 제 1 판에 추가합니다. 새로운 피펫 팁으로 전환, 두 번째 셀 플레이트를 반복합니다. 용해를 완료하는 데 10 분 동안 실온에서 세포를 놓습니다. 여러 라이브러리 판을 형질 경우, 팁, 세포 판의 상자를 교체하고 반복합니다. </li><li> 각 셀의 1 초 동안 기록 루미 접시, 당 우물의 각 우물에서 기록 발광. 로봇에 번호판을 반환갑판. </li><li> 2 피펫 팁 상자, 배 레 닐라 분석 버퍼의 판, 로봇 갑판에 셀 플레이트 세트를 놓습니다. </li><li> 대기음 60 3X 레 닐라 분석 완충액의 μL, 철저히 혼합, 세포의 제 1 플레이트에 추가한다. 피펫 팁의 새로운 상자로 전환, 두 번째 셀 플레이트를 반복합니다. 여러 라이브러리 판을 형질 경우, 전지 판의 모든 세트를 반복합니다. </li><li> 위와 같이 1 초 동안 각 웰을 기록 루미의 모든 플레이트에서 기록 발광. 번호판을 폐기하십시오. </li></ol> 5. 데이터 분석 <ol><li> 개똥 벌레를 계산 레 닐라 발광 비율 ( &quot;F : R 비율&quot;) 레 닐라 신호의 개수에 의해 반딧불 신호의 수를 분할하여 각 웰에 대한. </li><li> F 나누어 유도 값을 계산 : 잘 평균 F로 각각의 R 비율 : 판의 R 비율, 우물의 최고 및 최저 25 %를 제외합니다. </li><li> 반복 실험을 통해 유도 값을 평균하나의 형질 라이브러리 플레이트. 세 겹 이상의 알파 synuclein 더 유도하거나 억압 유전자는이 화면에서 &quot;히트&quot;으로 간주하고, 검증 및 보조 화면에 근거합니다. </li></ol>

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이 작품은 라이선스 BacMamreagents (미국 특허 5,731,182)에 의해 얻어진 로열티에 의해 지원되었다.

알파 - 시누 클레인은 루이 기관 4, 질병에 대한 pathognomonic 고려 세포 흠의 구성 요소로 파킨슨 병 (PD)에 연루되어있다. 수많은 게놈 넓은 협회 연구는 산발적 PD 5,6,7에 대한 위험 증가와 알파 synuclein의 단일 염기 다형성을 연결했다. 산발적 PD보다 일반적인 있지만, 가족 PD는 또한뿐만 아니라 복제 및 α-synuclein의 궤적 9,10,11의 삼배로, 알파 synuclein 8 돌연변이에 의해...

키 유전자 규제 요소와 그들에 작용하는 요소를 식별 할 수있는 능력은 다양한 생물학적 과정의 탐사를 위해 필수적입니다. 그러나, 특정 신경 세포의 집단으로 희귀 한 종류의 세포에서 유전자의 발현을 조절 요소를 식별, 도전하실 수 있습니다. 여기서, 우리는 α-시누 클레인 (SNCA)의 신규 한 전사 레귤레이터를 식별하기위한 프로토콜을 제시, 파킨슨 질환과 연관 substantianigra에서 도파민 뉴런에서 발현 유전자의 중뇌 compacta 영역 모양체. 우리는 293T 세포에서 α-시누 클레인의 발현을 재조하기 위해 높은 처리량, 이중 - 루시퍼 라제, 시험 관내 리포터 스크린을 사용하여이를 달성. 알파 synuclein 촉진제 우선 개똥 벌레 루시퍼 라제 유전자를 포함하는 리포터 플라스미드로 클로닝된다. 구성 적으로 활성화 된 프로모터의 조절하에 레 닐라 루시퍼 라제를 함유하는 시판되는 플라스미드는 내부 제어로서 기능한다. 살전E 기자의 구조는 각이 잘 단일 라이브러리 플라스미드로 형질되도록, DNA 발현 라이브러리에서 플라스미드와 마이크로 플레이트에 293T 세포에 공동 형질 전환됩니다. 48 시간, 각 리포터 대해 루시퍼 라제 활성을 듀얼 글로우 분석을 사용하여 순차적으로 측정 한 결과. 플레이트 기반 정상화 : (R 비율 F) 각 잘 레 닐라 루시퍼 활동 : 각 라이브러리 유전자에 대한 응답으로 알파 synuclein의 상대적 발현 반딧불의 비율로 유추됩니다. 이 프로토콜은 최소한의 인력 (1-2 명) 및 최소 비용 (마이크로 분석 당 약 3달러 시약 비용)를 사용하여 리포터 유전자를 전사 할 수있는 능력에 대한 유전자의 다수 (~ 주당 2,500)를 선별하는 기능을 제공한다. 유전자 조작에 불응 배양 신경 세포에서 공부하기 어려운 신경 세포의 유전자의 전사 규제 (예를 들어, 알파 - 시누 클레인)은,이 직접 기능 분석에서 나란히 비교 될 수있다. 우리는 우리에 포함프로토콜 우리가 통상적 인 방법 (토론 참조) 재배 할 때이 영역을 포함하는 플라스미드가 불안정한 것을 발견 이후 복제 및 α-synuclein의 프로모터를 포함하는 플라스미드의 성장을위한 자세한 방법. 우리는 또한 높은 처리량 분석을위한 상용 듀얼 루시퍼 라제 시약에 대한 저렴한 대안이 (가) 있습니다. 이 프로토콜은 쉽게 관심의 다른 규정 요소를, 또는 높은 처리량 과도 형질을 필요로하는 프로세스에 대상으로 적용 할 수 있습니다.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAQuick PCR Purification Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLink Quick Gel Extraction Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K2100-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLink PCR Micro Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K310250</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K2100-03</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>K2100-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bravo Robot</td>
 <td>Agilent</td>
 <td>-</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Robot Pipet Tips with Filter</td>
 <td>Agilent</td>
 <td>19477-022</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Robot Pipet Tips without Filter</td>
 <td>Agilent</td>
 <td>19477-002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clear-bottomed 96-well Plates</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3610</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Reservoirs</td>
 <td>Axygen</td>
 <td>RES-SW96-HP-SI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polystyrene V-bottomed 96-well Plate</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>651101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polypropylene V-bottomed 96-well Plate</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>651201</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Adhesive Plate Covers</td>
 <td>CryoStuff</td>
 <td>#FS100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phusion DNA Polymerase</td>
 <td>New England Biolabs</td>
 <td>M0530L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BAC 2002-D6</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>2002-D6</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calf Intestine Alkaline Phosphatase</td>
 <td>Roche</td>
 <td>10713023001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>T4 DNA Ligase</td>
 <td>New England Biolabs</td>
 <td>M0202L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pGL4.10</td>
 <td>Promega</td>
 <td>E6651</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pGL4.74</td>
 <td>Promega</td>
 <td>E6931</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ElectroMAX Stbl4 Competent Cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>11635-018</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Subcloning Efficiency DH5&alpha; Competent Cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>18265-017</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM without Phenol Red</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>31053-028</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optifect</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>12579017</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ciprofloxacin</td>
 <td>CellGro</td>
 <td>61-277-RF</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris-Hydrochloride Powder</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>93287</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris-Base Powder </td>
 <td>Sigma</td>
 <td>93286</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Triton X-100 Pure Liquid</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP151-100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15508-013</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coenzyme A</td>
 <td>Nanolight</td>
 <td>309</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ATP</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A6419</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luciferin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>L2912</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>h-CTZ</td>
 <td>Nanolight</td>
 <td>301</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PTC124</td>
 <td>SelleckBiochemicals</td>
 <td>S6003</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

high-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay

우리는 α-시누 클레인 파킨슨 질환과 관련된 유전자의 전사 레귤레이터를 식별하기 위해 신속하고 저렴하게 높은 처리량 선별 프로토콜을 제시한다. 293T 세포는 일시적으로 한 유전자 당 잘 마이크로 포맷, 함께 루시퍼 라제 리포터 플라스미드로, 배열 ORF 식 라이브러리에서 플라스미드로 형질됩니다. 반딧불 루시 페라 제 활동은 내부 통제 구조 (레 닐라 루시퍼를 연출 HCMV 프로모터)의 표현에 표준화 된 알파 synuclein의 전사,시 각 라이브러리 유전자의 효과를 결정하기 위해 48 시간 후 정량된다. 이 프로토콜은 96 - 웰 형식으로 무균 액체 처리를 수행하는 생물 안전 캐비닛에 동봉 된 벤치 탑 로봇에 의해 촉진된다. 우리의 자동화 된 형질 전환 프로토콜은 높은 처리량 렌티 바이러스 라이브러리 생산 conju 고유 라이브러리 플라스미드 많은 수의 트리플 형질을 필요로하는 다른 기능 검사 프로토콜에 쉽게 적응할 수있다도우미 플라스미드의 일반적인 세​​트 nction. 우리는 또한 저렴하고 검증 된 대안을 제시 PTC124, EDTA, 사전 레 닐라 루시퍼의 측정에 반딧불 루시 페라 제의 활동을 억제하는 피로 인산을 사용 시판, 이중 루시퍼 라제 시약을합니다. 이러한 방법을 사용하여, 우리는 7,670 인간의 유전자를 검사 및 알파 synuclein의 68 레귤레이터을 확인했다. 이 프로토콜은 관심의 다른 유전자를 대상으로 쉽게 변경 가능합니다.

일반 루시퍼 값, F : R의 비율과 하나의 하프 플레이트 유도 값을 그림 4에 나타내었다 아니라 H2, 32 배 유도에 타격을합니다.. 과도한 독성 (예를 들어, 잘 E3), 또는 가난하게 형질 전환 된 우물을 일으키는 유전자는 모두 개똥 벌레와 레 닐라 luciferases 낮은 값을 생성하지만, 평균 유도 값이됩니다. pGL4 백본과의 상호 작용을 통해, 아마도 루시퍼 라제 활성의 비특이적 유도?...

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High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

우리는 높은 처리량 로봇 형질과 집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석을 사용하여 전사 규제를 식별하기위한 신속하고 저렴한 검사 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 빠른 속도로 유전자의 수천을 위해 직접 나란히 기능 데이터를 생성하고, 관심의 유전자를 대상으로 쉽게 변경 가능합니다.

집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

high-throughput-functional-screening-using-homemade-dual-glow

Research

JoVE Journal

Biology

23.3K 조회수.  Massachusetts General Hospital.  우리는 높은 처리량 로봇 형질과 집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석을 사용하여 전사 규제를 식별하기위한 신속하고 저렴한 검사 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 빠른 속도로 유전자의 수천을 위해 직접 나란히 기능 데이터를 생성하고, 관심의 유전자를 대상으로 쉽게 변경 가능합니다. 

비디오: High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

형광등과 높은 처리량 검사 및 Biosensing C. 엘레간스 레인스

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

연구

생물학

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

에서 곰팡이 Endoglucanase 활동의 높은 처리량 검사 대장균</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

리그노셀룰로오스성 자료에 대한 높은 처리량 당화 분석

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 높은 처리량을 결정하기위한 로봇의 사용

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

루시 페라 제 발현 재조합 바이러스의 높은 처리량의 적정

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

Zebrafish의 배아를 사용하여 높은 처리량 접근 수동 작은 분자 화면

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

3&#39;LIFE의 분석을 사용하여 높은 처리량 miRNA의 표적의 탐지

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag 분석 - 높은 처리량, Sc2.0 유전형에 대한 실시간 PCR 분석

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...