이 작품의 측면에 대한 자금 조달은 미국 농무부 구체적인 협력 계약 58-6408-1-595과 국립 과학 재단 (상 1049911)를 포함하여 다양한 소스에 의해 제공되었다.

토양 및 퇴적물의 세포 외 효소 활성의 비색 분석 1. 효소 활성의 비색 분석 용 기판 및 버퍼 솔루션의 제조 <ol><li> 50 ㎖의 0.1 M 아세트산 (2.87 ㎖를 500 ㎖의 물에 빙초산)를 혼합하여 50 mM의보기 아세테이트 완충액 (pH 5.0-5.5)를 준비하고, 150 ㎖의 0.1 M 아세트산 나트륨 및 200 ㎖의 증류수 H 2 O. 필요한 경우 0.1 M 아세트산으로 5.0-5.5로 산도를 조정합니다. </li><li> 증류 H 2 O. 1 M 수산화 나트륨 (NaOH를)의 용액을 준비 </li><li> 50 mM의 아세테이트 버퍼에 P는 NP-연결된 기판 솔루션을 준비합니다. 인산 가수 분해 효소는 50 mM의 아세테이트 버퍼에 5 밀리미터 P는 NP-인산염을 준비을 검정, β-글루코시다 아제가 5 밀리미터 P는 NP-β-글루 코피 라노를 준비 분석 실험하기 위해, 나가세가 2 ㎜ PNP-β-N-acetylglucosaminide을 준비 분석 실험 할 수 있습니다. 멸균 15 ML 50 ML의 원심 분리기 튜브의 모든 기판 솔루션을 준비합니다. 솔루션 2 ~ 3 주 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 2. P는 NP 농도를 흡광도를 변환하는 표준의 결정 <ol><li> 50 mM의 아세테이트 버퍼에 P-니트로 페놀 표준 용액을 준비합니다. 농도는 MM의 0.025-1 다양합니다. </li><li> 분명 96 - 웰 마이크로 플레이트로 전송 각 농도 100 μL의 세 개의 반복을. 각 웰에 H 2 O를 증류수 10 ㎕의 1 M NaOH를 190 μl를 추가합니다. </li><li> 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 410 nm에서 흡광도를 기록. </li><li> 0.3로 표준 곡선에 곱하기 농도는 300 ㎕의 반응 부피 당 μmoles P는 NP를 얻을 수 있습니다. P는 NP의 μmole 대 흡광도의 곡선을 그린다. 곡선의 기울기는 각 효소 반응에서 P는 NP 건 μmole하는 흡광도 관해서 것이다 변환율 (C)로서 기능한다. </li></ol> 3. 효소 분석을 실시 <ol><li> 토양, concentr에서 멸균 15 ㎖의 원심 분리 관으로 측정 될 각 샘플의 슬러리를 조제대략 1 ㎍ / ㎖ -1 50 mM의 아세테이트 버퍼를 사용 ATION. 퇴적물의 경우, 슬러리 쉽게 pipettable 할 수있을 정도로 충분한 아세테이트 버퍼를 추가합니다. 필요한 슬러리의 정확한 양이 정량 효소의 수에 따라 달라질 수 있지만, 5 ㎖의 최소 권장합니다. 소용돌이 토양 또는 퇴적물의 모든 덩어리가 분산 최종 볼륨을주의 할 때까지 각 슬러리. </li><li> 다시 소용돌이 각 슬러리 즉시 96 웰 deepwell 블록 (그림 1)에 6 각 웰에 150 μl를 피펫. 이 현탁액에 토양 입자를 유지하기 위하여 충분히 자주 와류 중요하다. 기판의 제어 역할을하는 빈 블록 당 적어도 두 개의 우물을 남겨주세요. 참고 : 토양 슬러리는 팁을 방해하는 경향 전에 피펫을 가위로 피펫 팁의 끝을 클립. 정량 할 각 효소에 대해 하나의 96 - 웰 블록을 준비합니다. </li><li> 피펫 저수지로 아세테이트 버퍼의 약 5 ㎖를 붓고 L에 버퍼 150 μl를 추가하는 8 채널 피펫을 사용하여AST 각 샘플의 두 우물 (이 샘플 버퍼 컨트롤 예정) 및 두 기판 제어 우물 (그림 1) </li><li> 피펫 저장조에 적합한 P NP-기질 용액 약 10 ㎖를 넣고 (도 1) 각 시료의 처음 네 개의 우물과 2 개의 기판 대조군 웰에 기질 용액 150 μL를 추가 8 - 채널 피펫을 사용한다. 반응이 빨리 기질 용액을 첨가로 시작으로 시간을 참고. </li><li> 0.5-4 시간 동안 RT (22 ℃)에서 번호판을 품어. 정확한 배양 시간은 활동 샘플 수준과 정량하는 효소에 따라 달라집니다. 나가세와 다른 효소&gt; 2 시간의 배양 시간을 필요로하는 반면 대부분의 토양과 퇴적물, 인산 및 β-글루코시다는 0.5 ~ 1.5 시간의 배양 시간이 필요합니다. </li><li> 분석 흡광도를 읽을 마이크로 플레이트 분명 96 - 웰을 준비 배양하는 동안. (즉, 각 전자에 대한 각 deepwell 블록에 대해 하나의 마이크로 준비nzyme) 정량. 피펫 10 μL 1 M 수산화 나트륨과 마이크로 플레이트의 각 웰에 증류수 190 μL. 참고 : 수산화 나트륨은 효소 반응을 느리게하고, 반응시 방출되는 P는 NP의 색상을 향상시켜 pH를 발생시킵니다. </li><li> 배양 후, 토양 입자 펠렛 5 분 동안 2,000-5,000 XG에서 96 - 웰 블록을 원심 분리기. </li><li> 펠릿 않도록주의하면서, 각 우물에서 100 μl를 철회하는 멀티 채널 피펫을 사용하여 제조 된 명확한 96 - 웰 마이크로 플레이트에 잘 대응에 전송할 수 있습니다. </li><li> 마이크로 플레이트 리더를 켜고 필요한 소프트웨어를 설정합니다. 410 nm에서 흡광도를 기록. 특정 웰의 흡광도는 플레이트 리더의 선형 검출 한계 이상 물과 재 측정 랑은 잘 1:1로 희석합니다. 흡광도가 여전히 너무 높은 경우, 분석은 짧은 배양 시간에 따라 반복한다. </li></ol> 4. 샘플의 건조 질량의 결정 <ol><li> 각 SAMPL의 피펫 1 ㎖<html> preweighed 알루미늄 냄비에 전자 슬러리. </li><li> 48 시간 동안 75 ° C의 건조 오븐에서 건조하고 무게. 슬러리의 1 ㎖에 흙이나 퇴적물의 건조 질량을 얻기 위해이 값에서 팬의 무게를 뺍니다. 효소 분석에서 각 웰에 첨가 150 μL에 샘플의 건조 질량을 결정하기 위해 0.15의 계수를 곱한다. </li></ol> 5. 건조 토양의 질량 또는 침전물 당 효소 활성의 계산 <ol><li> 샘플 분석 흡광도에서 샘플 제어 흡광도를 뺀 각 샘플의 최종 흡광도를 계산합니다. 기판 컨트롤이 높은 흡광도가있는 경우 (약&gt; 0.060) 다음 또한 사람들을 뺍니다. </li><li> μmoles 인사 -1 들어 건조 질량 -1 방정식에서의 효소 활성을 계산합니다 : </li></ol> 효소 활성 = 최종 흡광도 / (C의 X 배양 시간의 X 샘플 건조 질량) 자연수의 세포 외 효소 활성의 형광 분석 효소 활성의 형광 측정 분석을위한 TLE &quot;&gt; 1. 기판, 표준의 준비, 및 버퍼 솔루션 <ol><li> 멸균에 적합한 기판을 용해하여 MUB 연결된 기판 (예를 들어 4 - MUB-β-글루 코피 라노, 4 MUB - 인산, 4 MUB-N-아세틸-β-D-glucosaminide) 200 μM 솔루션을 준비합니다 (오토 클레이브) 증류수 멸균 15 ML 50 ML의 원심 분리기 튜브의 H 2 O. 빛을 제외하고 사용하기 전에 냉장고에 저장하는 알루미늄 호일에 튜브를 감싸십시오. 이러한 방식에서 저장하는 경우 기판은 적어도 1 주 동안 안정해야한다. </li><li> 멸균 증류수 H 2 O 100 μM 4 - 메틸 움의 원액을 만들어 MUB 표준을 준비 상점은 황색 또는 호 - 병 포장에 냉장. 사용하기 직전에, 효소 분석을위한 10 μM의 작업 솔루션을 만들기 위해 멸균 H 2 O로 1 / 10로 100 μM 원액을 희석. </li><li> 탄산 수소 나트륨 &lt;8.4 g을 용해시켜 100 mM의 중탄산 완충액 원액을 준비서브&gt; 3 1 LH 2 O 및 고압 증기 멸균에. 효소 분석을위한 5 mm의 작업 솔루션을 필요에 따라 멸균 H 2 O로이 원액 1 / 20을 희석. </li></ol> 2. 96 - 웰 블랙 마이크로에 조직 물 샘플 <ol><li> 그림 2의 예를 다음 각 효소를 마이크로 플레이트를 구성합니다. 적절한 복제, 표준 및 제어를 허용,이 절차는 하나 96 - 웰 블랙 마이크로에 최대 9 개의 물 시료에 대해 하나의 효소의 활동을 분석 실험 할 수 있습니다. </li><li> 피펫 저수지에 첫 번째 샘플의 약 5 ㎖를 붓고 마이크로 (들)의 열 1의 우물 모두에 μL pipette200하는 8 채널 피펫을 사용합니다. 사용 피펫 팁을 취소하고 열 1-9을 채우기 위해 각 물 샘플에 대해 필요에 따라 반복합니다. </li></ol> 3. 샘플을 설정, 표준, 끄다, 기판 제어 <ol><li> 표준 샘플에 대한 계정 컨트롤을 설정의, 기판과 샘플과 동일한 블랙 마이크로 (그림 2)에서 담금질. </li><li> 샘플 컨트롤 샘플 물, 중탄산 버퍼를 포함하고, 액티비티 계산에 사용되지 않지만 실험 과정에 걸쳐 일관성을 읽고 설명 할 것이다. 급랭 컨트롤 샘플 물, 형광 태그의 기본 량으로 구성하고 샘플 물 형광의 회절을 측정하는 데 사용된다. 기판 및 표준 컨트롤 기판 연결 또는 표준 형광 태그, 각각 중탄산염 하나의 버퍼로 구성되어 있습니다. </li><li> 깨끗한 피펫 저수지에 5 mM의 중탄산염 버퍼의 약 5 ㎖를 붓는다. 피펫 마이크로 우물에 버퍼 50 μl의 1 행에서 9까지의 D와 E는 두 개의 샘플 당 샘플 컨트롤의 우물을 복제 형성한다. 변경 피펫 팁은 행의 (10 ~ 12) 우물에 수소 나트륨 완충액 200 μl를 전송 및 H. </li><li> 리를 흐리게하거나 해제하여 주변 조명을 감소형광 표준으로 ghts은 빛에 민감합니다. </li><li> 깨끗한 피펫 저수지에 10 μM 4 - 메틸 움의 약 5 ㎖를 붓는다. 피펫 마이크로 웰에 50 ㎕의 행 H 1부터 12까지, 그리고 우물에 행 G와 F에 1-9 샘플 당 급냉 컨트롤과 전체 표준 컨트롤의 세 개의 반복을 형성한다. 어둠 속에서 마이크로 플레이트를 배치하거나 MUB의 빛 저하를 줄이기 위해 불투명 뚜껑 커버 하나. </li><li> 형광 분석기의 전원을 켜고 설정 업 기판을 추가하기 전에 읽을 준비가되어 필요한 소프트웨어를. 참고 : 일부 형광 전구가 3 분 이상 예열 시간을 필요로 할 수있다. </li><li> 깨끗한 피펫 저수지에 해당 MUB 연결된 기판 (예를 들어, 4 - MUB - 포스페이트)의 약 5 ㎖를 붓는다. 각 샘플에 대한 세 가지 복제 분석 및 세 개의 기판 컨트롤을 형성하기 위해 1 행 B와 C에서 9까지의 1 행에 12를 통해 마이크로 우물에 50 μl를 피펫, 우물로하는 12 채널 피펫을 사용합니다. 이 immediatelY는 4.1, 기록 형광 단계로 진행합니다. </li></ol> 4. 기록 형광 <ol><li> 바로 마이크로에 기판을 첨가 한 후, 초기 형광을 읽어보십시오. 형광을 읽은 후에 하나 RT (22 ° C)에서 마이크로 플레이트를 품어 어둡거나 MUB의 빛 저하를 줄일 수있는 불투명 한 뚜껑으로 덮여있다.에게 </li><li> 물 샘플에서 최대 전위 효소 활성을 측정하는 데 필요한 배양 시간은 샘플 내의 효소 농도에 의존 할 것이다. 분석이 완료되기 전에이 불명하기 때문에, 마이크로 플레이트는 다수의 시간 단계에서 판독되어야 할 것이다. 특정 효소에 대한 매우 높은 활성을 가진 샘플을 10 분 전에 피크 수 있지만 일반적으로 1 시간에 걸쳐 10 ~ 15 분 간격으로 읽는 많은 효소 허용됩니다. </li><li> 적어도 1 시간에 지정된 간격으로 마이크로 형광 계속 읽기. 마이크로 덮여 유지해야하거나 독서의 어둠 속에서 수의. </li></ol> 5. 물 부피당 효소 활성의 산출 <ol><li> 초기 샘플의 형광 (웰 D 및 E)를 의미하는, 평균 최종 샘플 형광 (웰 AC), 평균 표준 형광 (웰 H10-11), 평균 제어 형광 급냉 (웰 : 각각의 시간 간격으로 각각의 샘플을 계산할 FG). </li><li> 각각의 시간 간격, 나노 몰의 시간의 효소 활성을 계산 -1 ML -1 방정식에서 : </li></ol> 효소 활성 = (샘플의 형광을 의미 - 초기 샘플의 형광을 의미) / (() 시간 시간 (X) 0.2 ㎖ (표준 형광) X를 의미 / 제어 형광을 해소 평균 (표준 형광 / 0.5 몰) X 평균) <ol start="3"><li> 각 시간 단계에서 계산 된 활동 값을 검사합니다. 가장 높은 활성 시간 단계에서 최종 잠재적 인 활동을 결정합니다. 활동 값이 계속 증가 할 경우, 나중에 단계가 필요할 수 있습니다 활동을 통해서 값이 떨어질 경우호우 실행의 과정은 다음 짧은 시간의 단계를 다시 실행합니다. 최종 활동은 기판 소비 시간 -1 -1 ML의 나노 몰에 있지만 시간 -1 L -1 μmoles로 표현하도록 확장 할 수 있습니다. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

토양과 퇴적물에있는 미생물의 세포 외 다양한 효소의 활동을 결정하는 것은 영양 광물 및 유기물 처리 17의 속도로 유용한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 그러나 토양은 수분 수준이 다를 수 있으므로 토양 건조 중량으로 활동을 표준화하는 것이 중요합니다. 이것은 단순히 효소 활성을 측정 넘어 (전형적 이틀) 추가로 건조 공정을 필요로한다. 따라서, 즉각적인 결과를 제공하는 근처에...

박테리아 및 곰팡이 등의 미생물 세포 효소의 생산을 통해 복잡한 유기 화합물의 영양분과 탄소를 얻을 수 있습니다. 이러한 효소는 전형적 셀로 취할 수 작은 소단위로 중합체를 가수 분해한다. 따라서, 생태 학적 수준에서, 이러한 미생물의 세포 외 효소는 영양 광물 및 자연 환경에서 발생하는 유기물 분해의 대부분에 대한 책임이 있습니다. 이러한 cellobiohydrolase (CBH) 및 β-글루코시다 제 등의 효소는 미생물의 흡수와 동화에 대한 utilizable 탄소 기판을 제공 1,2 포도당 셀룰로오스의 가수 분해를 촉진하기 위해 한마음으로 셀룰로오스 분해 작업을 위해 중요하다. 효소 포스는 유기 인계에서 수용성 무기 인산염 그룹, 기본적으로 인산염 광물 화하고 대부분의 생물 3에서 사용할 수있게 만들을 출시. 이러한 N-acetylglucosaminidase (나가세)와 같은 다른 효소는 importan 아르키틴 분해에 t, 탄소 및 미생물 인수 4에 해당하는 질소의 양을 만들 수 있습니다. 자연 환경에서 미생물의 세포 외 효소 활성의 분석을위한 절차 중 하나는 인공 P-니트로 페닐 (p의 NP) 연결된 기판 원래 토양 오 포스 파타 아제 활성을 검출하기 위해 개발 된 방법의 사용이다. 이 방법은 인공 기판이 해당 효소에 의해 가수 분해 될 때 방출되는 컬러 최종 제품, P-니트로 페놀의 검출에 의존한다. P-니트로 페놀은 이후 약 400 ~ 410 nm에서 흡광도를 측정하여 색도계로 정량화 할 수있다. 이 방법은 시간과 같은 나가세 6와 같은 다른 효소를 검출하도록 적용되고 있으며, 토양 및 퇴적물 7-9 미생물 세포 외 효소 활성을 찾고 다양한 연구에 사용되었다. originall의 있었다 다른 방법Y는 10,11 4 - 메틸 움 (MUB) 연결된 기판을 이용한다 수중 환경에서 세포 글루코시다 제 활성을 평가하기 위해 개발 하였다. (4 - 메틸 움) 릴리스 최종 생성물은 높은 형광이며 460분의 360 nm의 주변의 여진 / 배출 설정으로 형광 분석기를 사용하여 검출 될 수있다. MUB 연결된 인공 기판의 다양한 P는 NP-기판 비색 절차를 사용하여 정량 할 수있는 이상으로 많은 효소 (예 : β-글루코시다 아제, cellobiohydrolase, 나가세, 인산 가수 분해 효소)의 활동의 형광 측정을 허용, 사용할 수 있습니다. 이러한 단백질 분해 로이신 아미노 펩 티다 제와 같은 기타 미생물 세포 외 효소, 7 - 아미노 -4 - 메틸 쿠마린 (COU) 연결된 기판을 사용 fluorometrically 정량 할 수있다. MUB과 커플 연결 기판은 모두 다양한 육상 및 수생 샘플 (12, 13)의 효소 활성을 결정하는 데 사용되었다. 이전의 연구는 descr가있는 반면IBED 형광 또는 비색 마이크로 플레이트는 세포 외 효소 활성 (14)을 결정하기 위하여 접근 등의 분석을 수행하는 방법에 대한 명확한 프리젠 테이션에 대한 필요성이있다. 여기서 우리는 비색 P의 NP-결합 기판 방식을 사용하여 토양과 퇴적물 및 형광 MUB 연결된 기판 기술을 사용하여 자연수의 세포 외 효소 활성의 분석을위한 높은 처리량의 마이크로 기술을 수행하기위한 절차를 보여준다. 이 효소는 각각 탄소, 질소 및 인 순환에 연결 될 수있는 우리는 β-글루코시다 아제, 나가세, 및 포스 파타 아제의 활동의 측정에 초점을 맞 춥니 다. 그러나, 여기에 기재된 절차는 서로 다른 인공 기질을 사용하는 다른 세포 외 효소의 측정에 적용 할 수있다.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS AND MATERIALS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>p-Nitrophenol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP612-1</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3234</td>
			<td>pNP-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>pNP-&beta;-glucopyranoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7006</td>
			<td>pNP-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>pNP-&beta;-N-acetylglucosaminide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N9376</td>
			<td>pNP-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Clear 96-well microplates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-563-301</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>96-well deep well blocks</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3958</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Aluminum weigh pans</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile 15 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile 50 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-Methylumbelliferone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1381</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8883</td>
			<td>MUB-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-MUB-glucopyranoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3633</td>
			<td>MUB-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-MUB-N-acetylglucosaminide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2133</td>
			<td>MUB-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black 96-well microplate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3792</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipette reservoir</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-81</td>
			<td>For microplates/deep-well blocks</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microplate fluorometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>FLx 800</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>8-channel pipettor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

determination of microbial extracellular enzyme activity in waters, soils, and sediments using high throughput microplate assays

자연 환​​경의 영양 순환과 탄소 처리의 대부분은 미생물에 의해 발표 세포 효소의 활동을 통해 발생합니다. 따라서, 이러한 세포 외 효소의 활성 측정은 유기물 분해 또는 질소와 인 광물 등의 생태계 수준의 프로세스의 속도에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 환경 시료에서 세포 외 효소 활성의 분석은 일반적으로 인공 측색 또는 형광 기질에 샘플을 노출하고, 기판의 가수 분해 속도를 추적 포함한다. 여기에서 우리는 짧은 기간 내에 다수의 샘플의 분석을 할 수있는 절차를 마이크로 기반의 방법을 설명한다. 샘플은 마이크로 블록 마이크로 플레이트 또는 디프 웰 96 - 웰 내에 인공 기질과 반응 할 수 있으며, 효소 활성이어서 전형적인 마이크로 플레이트를 사용 Reade에 얻어진 최종 생성물의 흡수 또는 형광에 의해 결정된다R 또는 형광 분석기. 이러한 높은 처리 절차는 공간적으로 분리 된 사이트 또는 생태계 간의 비교를 용이하게, 또한 실질적으로 샘플 당 필요한 시약 전체적인 부피를 감소시킴으로써 그러한 분석법의 비용을 줄일뿐만 아니라.

토양과 수생 퇴적물 일반적 부착 미생물 군집 (생물막) 입자의 표면에 성장의 결과로 세포 외 효소 활성의 상당한 수준을 가지고.이 액티비티는 제 3 표면 침전물로부터 얻어지는 입자의 크기에 따라 변경하는 방법도 3 도표 북부 미시시피, 미국에서 주문 스트림. 이전의 연구는이 스트림에서 퇴적물 입자의 세균성 지역 사회가 사회 구조의 분자 분석을 기반으로 세 가지 그룹으로 분?...

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Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

마이크로 플레이트 기반 절차는 세포 외 효소 활성의 형광 또는 비색 분석을 위해 설명된다. 이러한 절차는 관리 기간 내에 환경 시료 다수 이러한 활동의​​ 신속한 분석을 허용한다.

높은 처리량 마이크로 분석 실험을 사용하여 워터스, 토양 및 퇴적물에있는 미생물 세포 외 효소 활성의 결정

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

determination-microbial-extracellular-enzyme-activity-waters-soils

Research

JoVE Journal

Environment

38.4K 조회수.  The University of Mississippi.  마이크로 플레이트 기반 절차는 세포 외 효소 활성의 형광 또는 비색 분석을 위해 설명된다. 이러한 절차는 관리 기간 내에 환경 시료 다수 이러한 활동의​​ 신속한 분석을 허용한다. 

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High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be assimilated for energy and nutrients. Measuring soil microbial enzyme activity is crucial in understanding soil ecosystem functional dynamics. The general concept of the fluorescence enzyme assay is that synthetic C-, N-, or P-rich substrates bound with a fluorescent dye are added to soil samples. When intact, the labeled substrates do not fluoresce. Enzyme activity is measured as the increase in fluorescence as the fluorescent dyes are cleaved from their substrates, which allows them to fluoresce. Enzyme measurements can be expressed in units of molarity or activity. To perform this assay, soil slurries are prepared by combining soil with a pH buffer. The pH buffer (typically a 50 mM sodium acetate or 50 mM Tris buffer), is chosen for the buffer&#39;s particular acid dissociation constant (pKa) to best match the soil sample pH. The soil slurries are inoculated with a nonlimiting amount of fluorescently labeled (i.e. C-, N-, or P-rich) substrate. Using soil slurries in the assay serves to minimize limitations on enzyme and substrate diffusion. Therefore, this assay controls for differences in substrate limitation, diffusion rates, and soil pH conditions; thus detecting potential enzyme activity rates as a function of the difference in enzyme concentrations (per sample).
Fluorescence enzyme assays are typically more sensitive than spectrophotometric (i.e. colorimetric) assays,&#160;but can suffer from interference caused by impurities and the instability of many fluorescent compounds when exposed to light; so caution is required when handling fluorescent substrates. Likewise, this method only assesses potential enzyme activities under laboratory conditions when substrates are not limiting. Caution should be used when interpreting the data representing cross-site comparisons with differing temperatures or soil types, as in situ soil type and temperature can influence enzyme kinetics.

To measure potential rates of soil extracellular enzyme activities, synthetic substrates that are bound to a fluorescent dye are added to soil samples. Enzyme activity is measured as the fluorescent dye is released from the substrate by an enzyme-catalyzed reaction, where higher fluorescence indicates more substrate degradation.

잠재적 인 토양 세포 외 효소 활동의 높은 처리량 형광 측정 측정

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

연구

환경과학

Measurement of Greenhouse Gas Flux from Agricultural Soils Using Static Chambers

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the biogeochemical drivers of climate change and to the development and evaluation of GHG mitigation strategies based on modulation of landscape management practices. The static chamber-based method described here is based on trapping gases emitted from the soil surface within a chamber and collecting samples from the chamber headspace at regular intervals for analysis by gas chromatography. Change in gas concentration over time is used to calculate flux. This method can be utilized to measure landscape-based flux of carbon dioxide, nitrous oxide, and methane, and to estimate differences between treatments or explore system dynamics over seasons or years. Infrastructure requirements are modest, but a comprehensive experimental design is essential. This method is easily deployed in the field, conforms to established guidelines, and produces data suitable to large-scale GHG emissions studies.

This article showcases the static chamber-based method for measurement of greenhouse gas flux from soil systems. With relatively modest infrastructure investments, measurements may be obtained from multiple treatments/locations and over timeframes ranging from hours to years.

정적 챔버를 사용하여 농업 토양에서 온실 가스 유출 측정

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the ...

Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate reduction is used in industrial wastewater treatment to remove large concentrations of sulfate along with the chemical oxygen demand (COD) and heavy metals. The most common approach to the process is with anaerobic bioreactors in which sulfidogenic sludge is obtained through adaptation of predominantly methanogenic granular sludge to sulfidogenesis. This process may take a long time and does not always eliminate the competition for substrate due to the presence of methanogens in the sludge. In this work, we propose a novel approach to obtain sulfidogenic sludge in which hydrothermal vents sediments are the original source of microorganisms. The microbial community developed in the presence of sulfate and volatile fatty acids is wide enough to sustain sulfate reduction over a long period of time without exhibiting inhibition due to sulfide. 
This protocol describes the procedure to generate the sludge from the sediments in an upflow anaerobic sludge blanket (UASB) type of reactor. Furthermore, the protocol presents the procedure to demonstrate the capability of the sludge to remove by reductive dechlorination a model of a highly toxic organic pollutant such as trichloroethylene (TCE). The protocol is divided in three stages: (1) the formation of the sludge and the determination of its sulfate reducing activity in the UASB, (2) the experiment to remove the TCE by the sludge, and (3) the identification of microorganisms in the sludge after the TCE reduction. Although in this case the sediments were taken from a site located in Mexico, the generation of a sulfidogenic sludge by using this procedure may work if a different source of sediments is taken since marine sediments are a natural pool of microorganisms that may be enriched in sulfate reducing bacteria.

Microbial sulfate reduction is a process of great importance in environmental biotechnology. The success of the sulfidogenic reactors depends among other factors on the microbial composition of the sludge. Here, we present a protocol to develop sulfidogenic sludge from hydrothermal vents sediments in a UASB reactor for reductive dechlorination purposes.

상향 류 혐기성 슬러지 블랭킷 반응기에서 해양 퇴적물과 트리클로로 에틸렌 감소에서 Sulfidogenic 슬러지의 개발

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate ...

High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the use of non-renewable energy sources. In order to identify which plants, out of a diverse pool, have the desired chemical traits for downstream applications, attributes, such as cellulose and lignin content, or monomeric sugar release following an enzymatic saccharification, must be compared. The experimental and data analysis protocols of the standard methods of analysis can be time-consuming, thereby limiting the number of samples that can be measured. High-throughput (HTP) methods alleviate the shortcomings of the standard methods, and permit the rapid screening of available samples to isolate those possessing the desired traits. This study illustrates the HTP sugar release and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry pipelines employed at the National Renewable Energy Lab. These pipelines have enabled the efficient assessment of thousands of plants while decreasing experimental time and costs through reductions in labor and consumables.

Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.

총 리그닌, 리그닌 단량체, 및 효소 설탕 자료 : 리그 노 셀룰로오스 바이오 매스의 반항의 변화의 높은 처리량 검열

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

Sediment Core Sectioning and Extraction of Pore Waters under Anoxic Conditions

We demonstrate a method for sectioning sediment cores and extracting pore waters while maintaining oxygen-free conditions. A simple, inexpensive system is built and can be transported to a temporary work space close to field sampling site(s) to facilitate rapid analysis. Cores are extruded into a portable glove bag, where they are sectioned and each 1-3 cm thick section (depending on core diameter) is sealed into 50 ml centrifuge tubes. Pore waters are separated with centrifugation outside of the glove bag and then returned to the glove bag for separation from the sediment. These extracted pore water samples can be analyzed immediately. Immediate analyses of redox sensitive species, such as sulfide, iron speciation, and arsenic speciation indicate that oxidation of pore waters is minimal; some samples show approximately 100% of the reduced species, e.g. 100% Fe(II) with no detectable Fe(III). Both sediment and pore water samples can be preserved to maintain chemical species for further analysis upon return to the laboratory.

A protocol for sectioning sediment cores and extracting pore waters under anoxic conditions in order to permit analysis of redox sensitive species in both solids and fluids is presented.

무산소 조건에서 퇴적물 코어 단면과 기공 워터스의 추출

We demonstrate a method for sectioning sediment cores and extracting pore waters while maintaining oxygen-free conditions. A simple, inexpensive system is ...

Clean Sampling and Analysis of River and Estuarine Waters for Trace Metal Studies

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination control. Developments of some techniques aiming to reduce trace metal contamination in the last couple of decades have resulted in concentrations reported now being orders of magnitude lower than those in the past. These low concentrations often necessitate preconcentration of water samples prior to instrumental analysis of samples. Since contamination can appear in all phases of trace metal analyses, including sample collection (and during preparation of sampling containers), storage and handling, pretreatments, and instrumental analysis, specific care needs to be taken in order to reduce contamination levels at all steps. The effort to develop and utilize "clean techniques" in trace metal studies allows scientists to investigate trace metal distributions and chemical and biological behavior in greater details. This advancement also provides the required accuracy and precision of trace metal data allowing for environmental conditions to be related to trace metal concentrations in aquatic environments.
This protocol that is presented here details needed materials for sample preparation, sample collection, sample pretreatment including preconcentration, and instrumental analysis. By reducing contamination throughout all phases mentioned above for trace metal analysis, much lower detection limits and thus accuracy can be achieved. The effectiveness of "clean techniques" is further demonstrated using low field blanks and good recoveries for standard reference material. The data quality that can be obtained thus enables the assessment of trace metal distributions and their relationships to environmental parameters.

Special care using "clean techniques" is required to properly collect and process water samples for trace metal studies in aquatic environments. A protocol for sampling, processing, and analytical procedures with the aim of obtaining reliable environmental monitoring data and results with high sensitivity for detailed trace metal studies is presented.

클린 샘플링 및 추적 금속 연구 강 하구 바다의 분석

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination ...

A Bending Test for Determining the Atterberg Plastic Limit in Soils

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a considerable subjective judgment from the operator that carries out the test is involved during its performance, which may affect the final result significantly. Different alternative methods have been put forward, but they cannot compete with the standard rolling test in speed, simplicity and cost.
In an earlier study by the authors, a simple method with a simple device to determine the PL was presented (the &#34;thread bending test&#34; or simply &#34;bending test&#34;); this method allowed the PL to be obtained with minimal operator interference. In the present paper a version of the original bending test is shown. The experimental basis is the same as the original bending test: soil threads which are 3 mm in diameter and 52 mm long are bent until they start to crack, so that both the bending produced and its related moisture content are determined. However, this new version enables the calculation of PL from an equation, so it is not necessary to plot any curve or straight line to obtain this parameter and, in fact, the PL can be achieved with only one experimental point (but two experimental points are recommended).
The PL results obtained with this new version are very similar to those obtained through the original bending test and the standard rolling test by a highly experienced operator. Only in particular cases of high plasticity cohesive soils, there is a greater difference in the result. Despite this, the bending test works very well for all types of soil, both cohesive and very low plasticity soils, where the latter are the most difficult to test via the standard thread rolling method.

The traditional standardized test for determining the plastic limit in soils is performed by hand, and the result varies depending on the operator. An alternative method based on bending measurements is presented in this study. This allows the plastic limit to be obtained with a clear and objective criterion.

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about the overall structure of terrestrial microbial communities. PLFA profiling has been extensively used in a range of ecosystems as a biological index of overall soil quality, and as a quantitative indicator of soil response to land management and other environmental stressors.
The standard method presented here outlines four key steps: 1. lipid extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, 2. fractionation using solid phase extraction columns to isolate phospholipids from other extracted lipids, 3. methanolysis of phospholipids to produce fatty acid methyl esters (FAMEs), and 4. FAME analysis by capillary gas chromatography using a flame ionization detector (GC-FID). Two standards are used, including 1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC(19:0/19:0)) to assess the overall recovery of the extraction method, and methyl decanoate (MeC10:0) as an internal standard (ISTD) for the GC analysis.

Phospholipid fatty acids provide information about the structure of soil microbial communities. We present methods for extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, fractionation of extracted lipids using solid phase extraction columns, and methanolysis to produce fatty acid methyl esters, which are analyzed by capillary gas chromatography.

추출 및 토양의 미생물 인지질 지방산의 분석

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Methods of Soil Resampling to Monitor Changes in the Chemical Concentrations of Forest Soils

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental changes. Repeated sampling to monitor these changes in forest soils is a relatively new practice that is not well documented in the literature and has only recently been broadly embraced by the scientific community. The objective of this protocol is therefore to synthesize the latest information on methods of soil resampling in a format that can be used to design and implement a soil monitoring program. Successful monitoring of forest soils requires that a study unit be defined within an area of forested land that can be characterized with replicate sampling locations. A resampling interval of 5 years is recommended, but if monitoring is done to evaluate a specific environmental driver, the rate of change expected in that driver should be taken into consideration. Here, we show that the sampling of the profile can be done by horizon where boundaries can be clearly identified and horizons are sufficiently thick to remove soil without contamination from horizons above or below. Otherwise, sampling can be done by depth interval. Archiving of sample for future reanalysis is a key step in avoiding analytical bias and providing the opportunity for additional analyses as new questions arise.

Repeated soil sampling has recently been shown to be an effective way to monitor forest soil change over years and decades. To support its use, a protocol is presented that synthesizes the latest information on soil resampling methods to aid in the design and implementation of successful soil monitoring programs.

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental ...

Preparation of Authigenic Pyrite from Methane-bearing Sediments for In Situ Sulfur Isotope Analysis Using SIMS

Different sulfur isotope compositions of authigenic pyrite typically result from the sulfate-driven anaerobic oxidation of methane (SO4-AOM) and organiclastic sulfate reduction (OSR) in marine sediments. However, unravelling the complex pyritization sequence is a challenge because of the coexistence of different sequentially formed pyrite phases. This manuscript describes a sample preparation procedure that enables the use of secondary ion mass spectroscopy (SIMS) to obtain in situ &#948;34S values of various pyrite generations. This allows researchers to constrain how SO4-AOM affects pyritization in methane-bearing sediments. SIMS analysis revealed an extreme range in &#948;34S values, spanning from -41.6 to +114.8&#8240;, which is much wider than the range of &#948;34S values obtained by the traditional bulk sulfur isotope analysis of the same samples. Pyrite in the shallow sediment mainly consists of 34S-depleted framboids, suggesting early diagenetic formation by OSR. Deeper in the sediment, more pyrite occurs as overgrowths and euhedral crystals, which display much higher SIMS &#948;34S values than the framboids. Such 34S-enriched pyrite is related to enhanced SO4-AOM at the sulfate-methane transition zone, postdating OSR. High-resolution in situ SIMS sulfur isotope analyses allow for the reconstruction of the pyritization processes, which cannot be resolved by bulk sulfur isotope analysis.

Preparation of Authigenic Pyrite from Methane-bearing Sediments for In Situ Sulfur Isotope Analysis Using SIMS

Analyses of the sulfur isotopic composition (&#948;34S) of pyrite from methane-bearing sediments have typically focused on bulk samples. Here, we applied secondary ion mass spectroscopy to analyze the &#948;34S values of various pyrite generations to understand the diagenetic history of pyritization.