이 작품은 루퍼스 연구소 (NY, NY), NIH P01-AR49084, NIH R21-DA026956 및 NIH UL1-TR00165 후원됩니다. 우리는 자신의 지속적인 지원을 위해 로버트 P. 킴벌리 감사합니다.

이 연구를 위해 모집 모든 기증자가 서면 동의를 준 연구는 버밍엄 기관 평가위원회에서 알라바마의 대학에 의해 승인되었습니다. 1. HUVEC 초기 문화와 서브 컬쳐 <ol><li> 내피 세포의 기초 배지 구성되어 완전한 성장 배지에서 체외 배양 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)는 내피 세포 성장 인자로 보충 (자재 목록 참조). 참고 :이 연구에 사용 된 성장 요인은 다음을 포함한다 : 5 NG / ML 인간 재조합 표피 성장 인자 (hEGF), 1.0 ㎎ / ㎖의 하이드로 코티손, 50 ㎎ / ㎖ 겐타 마이신 및 50 NG / ML 암포 테리 신-B (GA-1000), 2 % 태아 소 혈청 (FBS), 0.5 NG / ML 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 10 NG / ML 인간 섬유 아세포 성장 헤파린 (hFGF-B)와 인자 - 기본, 20 NG / ML 인간 재조합 인슐린과 같은 성장 인자 ( R 3-IGF-1) / ㎖ 아스코르브 산 1 μg 및 22.5 ㎍ / ml의 헤파린. 완전 배지37 ° C에서 처음에 준비하고 준비 1 개월 이내에 사용하기 위해 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 세포의 플라스크를 준비하려면, 전체 성장 매체는 75 ㎠의 조직 배양 플라스크 (1 ㎖ / 5cm 2)에 다음 플라스크의 배양기에서 37 ° C / 5 % CO 2 평형을 허용 추가 적어도 30 분. 인간은 HUVEC / cm 2 2,500-5,000 세포의 밀도로 평형화이 배양 플라스크에 직접 파종한다. </li><li> 미디어가 평형을하는 동안 신속하게 37 ° C의 물을 욕조에 주식 HUVEC의 cryovial을 해동. 볼 텍싱에 의해 일본어 저장 바이알 세포를 분산하고 / cm 2 2,500-5,000 세포 밀도를 달성하기 위해 미리 평형화 HUVEC 완전 성장 배지를 함유하는 배양 플라스크에 직접 추가. 부드럽게 골고루 세포를 배포 한 후 인큐베이터에 플라스크를 반환하는 플라스크 바위. 이 세포는 현재 1 차 통과를 나타냅니다. </li> &lt;세포를 70 ~ 80 % 년 합류 할 때까지 리&gt; 보통은 이틀마다 변경해야합니다. </li><li> HUVEC를 지금 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 문화 플라스크에서 수확 할 수있다. 배양 배지는 세포에서 남아있는 단백질과 칼슘을 제거하는 PBS 린스 다음에 배양 플라스크에서 흡입됩니다. 0.25 % 트립신-EDTA 용액을 첨가하고, 광학 현미경에 의해 평가로 2-6 분의 세포 분리에서 분명해야한다. </li><li> 세포의 90 %가 플레이트 오프 반올림되는 경우, 2X 트립신 억제제의 동량을 첨가함으로써 트립신을 멈춘다. 세포 수확을 용이하게하기 위해, 완전 성장 배지의 다른 동등한 양을 추가한다. 멸균 15 ML의 원심 분리기 튜브에 분리 된 세포를 전송합니다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 225 XG에서 분리 된 세포를 원심 분리기. 뜨는을 대기음하고 완전한 성장 매체의 2 ~ 3 ㎖의 세포를 재현 탁. hemacytometer와 트리 판 블루를 사용하여 세포 농도 및 생존 능력을 결정합니다. </li><li> 일을 사용하려면전자 연구를위한 세포, 다시 씨앗 추가 75cm / ㎠ 10,000 세포의 밀도로 세포 2 플라스크를 수확하고 2.2 단계로 진행합니다. 또한, 세포는 미래의 연구를 위해이 시점에서 고정 할 수 있습니다. 냉동 세포를 들어, 실온에서 5 분 동안 225 XG에서 원심 분리하여 세포를 펠렛. 상등액 대기음하고 1 × 106 세포 / ml의 농도에서 10 %의 DMSO를 함유 FBS에서 세포 펠렛을 재현 탁. 세포 현탁액을 세포 냉동 컨테이너에 세포를 고정한 후 cryovials에 옮기고 -80 ° C에 저장된다. </li></ol> 2. HUVEC 계층 준비 <ol><li> 냉동 2 차 통과 된 HUVEC의 사용 : 부흥과 문화. 적극적으로 성장하는 세포를 사용하는 경우, 2.2 단계로 진행합니다. <ol><li> 37 ° C의 물을 욕조에 신속하게 단계를 1.8에서 2 차 통과 된 HUVEC을 포함하는 cryovial을 해동. 15 ㎖의 멸균 원심 분리 관에 cryovial 세포를 전송하고 10 ㎖ 성장 메디 추가음. </li><li> 상온에서 5 분 200 XG에서 세포를 원심 분리기 및 잔류 DMSO를 제거 뜨는을 대기음. </li><li> 완전 성장 배지로 세포 펠렛을 재현 탁하고 75cm 2 플라스크에 세포를 옮긴다. 전체 볼륨에 대한 20 ~ 25 ml로 성장 매체를 추가하고 37 ° C / 5 % CO 2에서 품어. </li></ol></li><li> 시각 매체의 변화 이틀에 하루에 합류하기위한 세포 배양을 검사합니다. 보통 2 ~ 4 일 이내에, 세포들은 흐름 챔버 분석에 사용하기위한 준비가 될 것입니다 어떤 시간에 80~90% 합류에 도달 할 것입니다. </li><li> 유량 용기에 사용되는 배양 접시를 준비하려면 (5 장 참조), 수 있도록 10 ㎍ / ml의 피브로넥틴 1 ㎖와 0.05 % 35mm 조직 문화 요리와 피펫 (w / v)의 젤라틴을 여러 번 추가 확인 전체 플레이트 표면은 코팅되어있다. 단백질 매트릭스 형성을 최적화하기 위해 최소 30 분 동안 접시를 건조 과도한 피브로넥틴과 젤라틴 용액과 공기를 제거합니다. Fibronectin 젤라틴 용액을 10 배까지 재사용 할 수있다. </li><li> 단계 1.5-1.7의 설명에 따라 트립신-EDTA를 이용하여 단계 2.2에서 HUVEC 세포를 수확. 각 코팅 조직 배양 접시에 50 만 셀을 시드. 각 접시에 2 ㎖ 성장 매체를 추가하고 37 ° C / 5 % CO 2에서 품어. </li><li> 세포 단계 2.2에서와 같이 합류로 성장할 수 있습니다. 세포는 시각 매체의 변화 이틀 매일 점검해야한다. 이전 유량 용기의 분석에, 접착 분자 발현을 상향 조절하고 자극하는 4 ~ 6 시​​간 동안 20 NG / ML 인간 TNF-α와 HUVEC 총리. </li></ol> 3. 정화 리간드 코팅 <ol><li> 35mm 조직 배양 접시의 중앙에 마커 또는 펜으로 0.5 cm 직경의 원을 그립니다. </li><li> 표시된 지역에서 20 ㎍ / ㎖의 단백질의 판 (20) μL. 단백질에게 0.5 cm 직경의 원 안에 전체 영역을 커버하는 솔루션을 확산 피펫 팁을 사용합니다. 그것은 D의 표면을 만지거나 긁지하는 것이 중요하다ISH. 1 시간 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 1 ㎖의 PBS (산도 8.0)와 단백질 코팅 된 플레이트의 3 배를 씻으십시오. </li><li> 비 특정 판에 바인딩을 차단하기 위해 표시된 부분의 판 (50) ㎕의 1 % BSA. 4 ℃에서 2 시간 동안 배양 </li><li> 단계 3.3에서와 같이 1 ㎖의 PBS 차단 판의 3 배를 씻으십시오. </li><li> 코팅 구단 유착 수용체 리간드 키메라 단백질 솔루션을 준비합니다. 이 실험에서, 25 ㎍ / ml로 ICAM-1/Fc 키메라 PBS 용액 및 0.5 ㎍ / ml로 P-Selectin/Fc 키메라는 (산도 8.0)을 사용 하였다. </li><li> 코트 기판의 50 μL로 표시된 부분. 4 ℃에서 하룻밤 배양한다 접시 2 일 이내에 사용되어야하며, 코팅 된 지역은 건조하도록 허용 할 수 없습니다. 접시에 50 μL 솔루션을 유지하기 위해 필요한 경우 PBS를 추가합니다. </li></ol> 4. 호중구 분리 (실내 온도에서 수행되는 모든 단계) <ol><li> 동의를 얻은 후, 정맥 절개에 의해 참가자의 혈액을 수집N 항 응고 혈관 또는 vacutainer (EDTA 또는 헤파린). 채혈 후 분리하기 전에 PBS와 혈액 1:1 희석. </li><li> 50 ㎖ 원심 분리기 튜브에 PBMC 및 호중구를 분리하는 2 개의 층 피콜를 준비합니다. 처음 15 ㎖의 헤비 피콜 (재료의 목록, ρ = 1.118-1.120 참조)에 추가 한 다음 조심스럽게 10 ㎖ 무거운 피콜 위에 (재료의 목록, ρ = 1.077-1.080 참조) 피콜 빛 층. 빛 피콜 무거운 피콜 층 사이에 날카로운 경계가 있어야합니다. 마지막으로,주의 깊게 피콜 층을 방해하지 않고 빛 피콜 위에 희석 된 혈액 샘플 25 ㎖ 레이어. </li><li> 실온에서 30 분 동안 250 XG에서 튜브를 원심 분리기. 주의 : 이러한 스핀은 원심의 끝에서 로터 감속시의 세포 분리의 잠재적 인 방해를 최소화하기 위해 원심 로터 브레이크가 해제되어야한다. 원심 분리 후, (위에서 아래로) 다음의 층 존재 : 상부 층은 플라즈마 FOLLO이며광 피콜 층 위에 PBMC 층에 의해 물, 약간의 적혈구 (RBC)와 호중구 층은 튜브의 바닥에서 무거운 피콜 층과 적혈구이어서 가볍고 무거운 피콜 사이​​이다. </li><li> 수확하고, 전송 피펫으로 새로운 50 ㎖ 튜브에 호중구 계층 전송을 실온에서 10 분 동안 225 XG에 50 ㎖ 원심 분리기의 최종 부피 PBS를 추가. <ol><li> 원심 분리 후, 여전히 호중구와 혼합 적혈구가있을 수 있습니다. 아래로 10 ㎖ 마크 뜨는을 대기음. 튜브 (또는 간단한 저속 소용돌이로 교반)의 부드러운 교반 호중구 RBC 펠렛을 재현 탁하고 PBS 50 ㎖로 다시 세척한다. </li></ol></li><li> 두 번째 세척 후, 뜨는을 대기음. , 오염 적혈구를 제거 교반 (또는 짧은 소용돌이로 교반)에 의해 잔류 PBS의 펠렛 세포를 재현 탁하려면 25 ML의 H 2 O 및 RBC를 용해하는 10 초 동안 부드럽게 소용돌이를 추가합니다. <ol><li> 1.8 % 염화나트륨 25 mL를 넣고 즉시 혼합실온에서 10 분 동안 225 XG에서 원심 분리함에 따라. 오염 RBC는 이제 흰색 호중구 세포 펠렛을 떠나 용해되어야한다. </li></ol></li><li> PBS와 호중구 세포 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 10 % FBS와 RPMI 배지에서 격리 된 호중구를 재현 탁하고 혈구와 광학 현미경으로 세포 농도를 결정한다. </li><li> 완전 RPMI-10 % FBS 배지로 500,000 세포 / ml의 세포 밀도를 조정한다. </li></ol> 5. 유량 용기 접착 분석 <ol><li> 유량 용기를 조립합니다. 현미경 테이블에 합류 HUVEC를 또는 정제 부착 수용체 리간드를 포함하는 35mm 접시를 놓습니다. 주사기 펌프, 진공 시스템과 병렬 플레이트 흐름 챔버를 연결하고 호중구 입력 오픈 한 줄을 둡니다. 접시 위에 유량 용기를 삽입하고 유량 용기 조립체 (13)를 고정합니다. (그림 1 참조) </li><li> 컴퓨터 연결된 t에 녹화 프로그램을 시작현미경 오. 완전히 성장 HUVEC 세포와 명확한 필드 또는 리간드 코팅 영역을 볼 수 있습니다 내에서 필드까지 현미경의 필드와 초점을 조절합니다. </li><li> 주사기 펌프를 사용하여, RPMI 배지로 유동 챔버를 헹군다. 챔버 내의 기포 또는 호중구 입력 라인이 없는지 확인합니다. </li><li> 원하는 경우, 호중구는 10 분 동안 낮은 복용량 (10 -8 M) fMLP으로 뇌관을 할 수있다. 이것은 다른 기증자 (14) 사이의 호중구 활성화의 기초 수준의 일치를 허용합니다. </li><li> 정의 속도 유량 용기에 (이 연구에서 사용되는 / ㎠ 1.5 다인의 전단 응력과 동일 350 μL / 분의 속도) 호중구를 주입하는 주사기 펌프를 사용합니다. 영상을 기록합니다. 호중구 밀착성이 빠르게 일어날 수 있으므로, 4-5 분의 길이는 비디오 분석을 위해 점착 이벤트를 정량하는 것이 충분하다. </li><li> 부착 성 세포는 이하 기포 직경을 이동 셀로서 정의된다HUVEC 또는 리간드 코팅 된 표면 (15, 16)에 5 초 이내. 이 규칙을 사용하여 기록 된 영상 내에 존재하는 필드에 부착 세포의 총 수를 센다. 다른 기증자 호중구와 비슷한 길이의 동영상을 기록하여, 하나는 다른 기증자 사이의 접착 특성을 비교하기 위해 부착 세포 / 분을 계산할 수 있습니다. </li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

이 프로토콜은 깎아 지른듯한 스트레스 조건에서 호중구의 부착주의 정량화를위한​​ 최소한의 활성화 된 호중구의 분리 및 격리를 안내합니다. 호중구 부착 염증에서 중요한 과정이다. 이 과정에서 여러 분자의 유전자 변종은자가 면역 질환 1,2의 발전에 걸리기 입증 되었기 때문에, 정량적으로 인간 호중구 회사의 접착력을 평가 할 수있는 분석 시스템이 필요합니다. 이 프로토콜에서 설명하는 방법은 깎아 지른듯한 스트레스 조절 체외 환경에서 호중구의 회사 접착제 전위의 신중하고 정량 할 수 있습니다. 이 방법은 따라서 유전자형 개인 간의 양적 호중구 부착 직접 비교가 부착 분자 (14)의 유전 적 변이의 중요도를 결정한다. 이 방법의 몇 가지 단계에 achiev을 충분히 고려 공로전자 고도의 양적 및 재현 가능한 결과. HUVEC 제제에서, 유동 챔버 내에 사용하기 전에 100 % 세포의 합류를 달성하는 것이 중요하다. 정제 리간드로 코팅 된 표면을 사용하기 위해, 기판 코팅 영역은 리간드 변성 방지하기 위해 건조하도록 허용해서는 안됩니다. 또, 인간의 호중구의 제제는 실험의 성공에 중요하다. 혈액에서 호중구를 분리의 주요 이슈 조심스럽게 분리하고 실험을, 활성화를 피하기 위해 소용돌이로 교반을 최소화 (혈액은 실온에서 수행되어야 얼음과 원심 분리 단계에 저장할 수 없습니다 즉) 실온에서 세포를 유지하고 완료하여 처리 포함 가능한 한 최소의 시간에. 또한 이러한 분석법 17,18 위해 세포를 준비하는 데에 이용 될 수있는 추가 호중구의 분리 방법이있다. 갓 고립 된 인간의 호중구를 사용하여 실용적인 관점, 접착 분석에서<html> 참가자 정맥 절개 후 3-6 시간 이내에 시작되어야한다. 호중구 처리에 매우 민감으로, 채혈 및 사용 사이의 오랜 시간 분석 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 종래 유동 챔버 분석에 호중구 세포 농도의 신중한 판단이 정확하고 재현성있는 결과를 달성하기 위해 필요하다. 흐름 챔버 분석 동안, 흐름 속도가 일치하고 실험의 길이에 걸쳐 제공된 난류이 없도록 신중 비디오 기록을 감시하는 것이 중요하다. 유동 속도 변화 나 난류의 존재는 실험을 반복 할 것을 필요로한다. 실험 한 결과, 호중구가 응집되지 않도록 미세 잔존 호중구를 평가하는 것이 중요하다. 이 시점에서 응집하면 호중구가 크게 실험 기간 동안 호중구 밀도를 변경할 수있는 활성화 될 것을 나타냅니다. 내용 &quot;&gt; 흐름 챔버는 Q가 = 유량 챔버 내 주변의 균일 한 얇은 응력 (τ = 6Qμ / (WH 2), μ = 동점도 및 유량 용기의 W = 폭의 H = 높이를 생성 ) 챔버 (15)를 흐른다. 우리의 연구에서, 우리는 / cm 2 1.5 다인의 깎아 지른 스트레스를 생성 호중구 접착에 350 μL / 분의 유속을 사용 (= w 0.25 cm, H = 인치 0.01, 물의 점성 37 ° C에서 (0.007 포이즈가)) RMPI 매체의 점도의 근사치로 사용 하였다. 특정 유동 챔버를 들어, 하나의 다른 생리적 조건을 모방하도록 투명 응력의 상이한 레벨을 달성하기 위해 유량을 변경할 수있다. 일반적인 생리적 전단 응력보기 인간 혈관 0.5-5.0 다인 / cm 13,16 사이의 범위. 다른 혈관에서 전단 응력 수 및 다른 동물은 표 1 113,16,19 20에 열거 하였다. 우리의 방법은 인간의 neutrophi의 접착의 연구에 초점을 맞추고있는 동안LS,이 방법은 호중구에 한정되지 않고, 용이하게 부착 또는 간단한 변형을 가진 다른 세포 유형의 압연 연구에 적용될 수있다. 또한,이 방법에서는 기판은 다른 목적을 위해 변경 될 수있다. 이 프로토콜은 서로 다른 연구에 쉽게 적응할 수 있지만, 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 여기에 구현 된 프로토콜 분석을 위해 일차 전지의 많은 수를 필요로한다. 이 작은 동물에서 일차 전지의 분석을 방해 할 수 있습니다. 또한, 가능 / 활성 형태로 정제 된 점착 리간드를 고정화 할 필요가 리간드의 범위를 제한 할 수있다. 된 Fc 융합 단백질의 용도는 크게 플레이트 표면에 적절한 리간드의 입체 구조를 달성 할 가능성을 향상시킨다. 그럼에도 불구하고, 우리의 방법은 접착 이벤트의 정량 분석​​을 허용하기 위해 상당한 유연성을 가지고 있습니다. 이러한 연구는 매우 우리의 유착 수용체 리간드 쌍의 이해, 유전자 변종의 잠재적 기능의 중요성을 향상시킬 것입니다이러한 단백질, 인간의 질병의 병인에.

모두 β 2 인테그린 및 ICAM 리간드의 유전자 변종은 현재자가 면역 질환의 1,2의 개발과 관련된 것으로 인식하고 있습니다. 이러한 변이를 가진 사람에서 파생 된 세포에서 이러한 변종의 기능적 결과의 결정은 이러한 변형은자가 면역 질환의 발병에 기여하는 방법에 대한 우리의 이해가 필요합니다. 이러한 기능적 연구는 자연적으로 발생하는 유전자 변종은 건강과 질병 모두에서 면역 반응을 형성하는기구의 판정을 허용. SLE의 구체적인 예에서, 우리는 지금 그 ITGAM (CD11b를) 변종 알고 리간드는, ICAM-1, 1,2 강하게 질환의 개발에 연결합니다. 호중구는 염증 반응에 중요하기 ​​때문에, 호중구 부착의 양적 연구는 ITGAM / ICAM의 유전자 변종이 염증을 변경하는 방법으로 기계적인 통찰력을 제공 할 수 있습니다. Neutrop세포 (EC)를 내피 밀착성을 HIL은 매우 규제 과정 및 염증 반응 3,4에 필수적인 역할을한다. 호중구의 밀착성은 EC에 초기 호중구 압연 및 캡처를 다음과 궁극적으로 생체 내에서 윤회가 발생할 수 있습니다. 이러한 프로세스는 ICAM-1을 포함한 부착 분자의 많은 종류, ICAM-2, P-셀렉틴, E-셀렉틴 내피 세포 및 호중구 5-9이 인테그린을 β를 포함한다. 따라서, 접착 분자의 서로 다른 대립 유전자 변형을 가진 기증자로부터 호중구 부착주의 정량화이 유전자 변종의 기능 및 병리학 적 결과를 이해하는 것이 중요 할 것입니다. 유동 챔버의 사용은 생체 내 실험 10-12에서 혈관 환경에서 관찰 된 것과 유사한 유체 전단 응력으로 체외 환경을 만들 수있다. 실제로, 유량 용기의 분석은 인간의 umbili과 함께CAL 정맥 내피 세포 (HUVEC)는 혈관의 생체 내 환경을 모방 할 수있다. 이 방법을 사용하여, 하나는 내피 세포를 향해 전체 세포 접착 특성을 연구 할 수 있습니다. 또, 유동 챔버의 고도로 통제 된 환경은 또한 셀의 평가는 ICAM-1의 특정 수용체​​ - 리간드 상호 작용의 연구를 용이하게 정제 된 점착 리간드에 결합한다. 우리는 여기에서 HUVEC로 정제하여 리간드 기재에 인간 말초 혈액 호중구의 접착 특성을 연구하는 유동 챔버 접착 분석 시스템을 이용하는 방법을 제시한다. 다른 접착 분자의 대립 유전자의 변형을 표현하는 기증자의 세포로이 방법을 사용하면 우리가이 유전자 변종 인간 호중구 회사의 접착 성을 변경할 수있는 방법을 평가할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:677px;" width="677">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:677px;">Table of Reagents Materials</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Name of reagent</td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:268px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">0.25% Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">25200-056</td>
			<td style="width:268px;">with Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">2X Trypsin inhibitor</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">R-002-100</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">35mm tissue culture dish</td>
			<td style="width:107px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:111px;">430165</td>
			<td>Standard Tissue Culture Treated Surface</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:192px;">75cm2 tissue culture flask</td>
			<td style="width:107px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:111px;">430641</td>
			<td>Standard Tissue Culture Treated Surface</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">CCD camera</td>
			<td style="width:107px;">Dage-MTI</td>
			<td style="width:111px;">Model 300T-RC</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Cell freezing container&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Biocision</td>
			<td style="width:111px;">BCS-045</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">EBM-2</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc.</td>
			<td style="width:111px;">CC-3156</td>
			<td style="width:268px;">HUVEC growth basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">EGM-2 Bulletkit</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc</td>
			<td style="width:111px;">CC-4176</td>
			<td style="width:268px;">HUVEC growth factors for basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">FBS</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">10082-147</td>
			<td style="width:268px;">Certified, Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Gelatin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">G9391</td>
			<td style="width:268px;">from bovine skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:107px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:111px;">02-671-51B&#160;</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">F2006</td>
			<td style="width:268px;">from human plasma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Flow chamber</td>
			<td style="width:107px;">Glyco Tech</td>
			<td style="width:111px;">31-001</td>
			<td style="width:268px;">Circular flow chamber for 35mm dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">fMLP</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">47729</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Histopaque-11191</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">11191</td>
			<td style="width:268px;">Heavy ficoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">HUVEC</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc.</td>
			<td style="width:111px;">CC-2517A</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">ICAM-1</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:111px;">720-IC</td>
			<td style="width:268px;">Fc chimera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Lymphocyte separation medium</td>
			<td style="width:107px;">Mediatech Inc.</td>
			<td style="width:111px;">25072CV</td>
			<td style="width:268px;">Light ficoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Microscope</td>
			<td style="width:107px;">Zeiss</td>
			<td style="width:111px;">Axiovert 100</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">11875</td>
			<td style="width:268px;">with L-Glutamine and Phenol Red&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Protein A</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P6031</td>
			<td style="width:268px;">resuspend in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">P-Selectin</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:111px;">137-PS</td>
			<td style="width:268px;">Fc chimera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:107px;">KD Scientific</td>
			<td style="width:111px;">KDS270</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">TNF-a</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">PHC3015</td>
			<td style="width:268px;">Recombinant Human Protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human neutrophil flow chamber adhesion assay

내피 세포 호중구 회사 접착은 건강과 질병 모두 염증에 중요한 역할을합니다. 호중구 회사 접착 과정은 β 2 인테그린의 회원들과 ICAM 가족들의 반대 수용체 등 다양한 접착 분자를 포함한다. 최근에, 모두에서 자연적으로 발생하는 유전자 변종은 2 인테그린을 β 및 ICAMs은자가 면역 질환과 연관된 것으로보고있다. 따라서, 이러한 접착 분자의 다양한 대립 유전자 형태를 가진 사람에서 호중구의 양적 접착 능력은자가 면역의 개발을 기본 메커니즘과 관련하여 공부하는 것이 중요합니다. 흐름 챔버 시스템에서의 접착 연구는 생체 내에서 혈관 환경에서 관찰 된 것과 유사한 유체 전단 응력과 환경을 만들 수있다. 여기서, 우리는 인간 말초 혈액 호중구의 정량적 접착 특성을 연구하기 위해 유동 챔버 분석 시스템을 이용한 방법을 제시의 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)로 정제 리간드 기판에. 이 방법으로 접착 수용체 다른 대립 유전자 변형을 가진 기증자의 호중구 접착 능력을 평가하고 비교할 수 있습니다. 이 방법은 또한 다른 주 세포 유형 또는 세포주의 밀착성을 평가하기 위해 수정 될 수있다.

호중구의 예는 정제 리간드 (ICAM-1/P-Selectin) 코팅 유량 용기 (그림 2) 또는 HUVEC 코팅 흐름 챔버 분석 (그림 3)에 결합하는 호중구의에 바인딩이 표시됩니다. 도면에 도시 된 바와 같이, 호중구는 연속적인 흐름의 조건 하에서 피복면 또는 HUVEC에 밀착 / 축적하는 것을 계속한다. 우리의 일반적인 실험 조건에서, 우리는 확고하게 네 분의 기록 기간 동안 코팅 표면 또는 HUVEC에 부착 50-70 인간 호중구를 관찰 할 수 있습니다. 그러나, 호중구 부착 분자, 또는 기판 (정제 리간드 또는 HUVEC)에있는 대립 유전자 변형 대립 유전자 변형이 실질적으로 양적 호중구 부착 (14)를 변경할 수 있습니다. 우리는 우리의 연구에서 관찰 된 호중구 부착 이벤트의 시간 의존성을 평가했다. 우리가 일정한 유량 조건을 유지하고 있지만, 그것은 세포의 접착 성이 시간에 따라 변경하는 것이 가능하다. However, 우리의 연구에서 비교적 짧은 시간의 과정을 통해, 우리는 시간이 지남에 따라 접착력의 비율에 어떤 일관성있는 차이를 관찰하지 않습니다. 예를 들어, 3-4 분 시간 지점 사이에서 관찰 접착력에 비해 1-2 분 시점에서의 밀착성을 평가 일관 다르지 않다. 세포 부착 실험 동안 자극되는 경우 물론, 다음 시간에 따른 접착 특성의 변화가 예상 될 수있다. 우리의 연구에서, 우리는 의도적으로 공부를하기 전에 10 분 동안 낮은 복용량 fMLP (10-8 M)와 함께 세포를 프라이밍하여 격리 유도 호중구의 활성화를 위해 제어. 내피 세포 (우리의 연구에서 HUVEC)도 최적의 백혈구 회사의 접착 접착 분자의 발현을 상향 조절하기 전에 정품 인증이 필요합니다. 전처리의 부재에서, 내피 세포 (HUVEC를)는 매우 적은 호중구 부착을 지원할 것이다. 우리의 연구에서, 우리는 10 NG / ML 사용하기 전에 4-6 시간 동안 TNFα 처리를 사용했다. IL-1β (10 NG / ㎖)<html> LPS (0.5 ㎍ / ㎖)을 또한 내피 세포를 미리 활성화하는 데 사용할 수있다. 중요한 치료는 HUVEC 세포 부착이 특정 (수용체 - 매개) 중성구 - 내피 세포 상호 작용에 의해 발생되도록하여 음성 대조군으로 사용할 수있다. 또는, 항 - 수용체 항체는 접착 특이성을 평가하는 특정 수용체​​를 차단하기 위해 사용될 수있다. <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1.jpg" /> 현미경 단계의 그림 1. 흐름 챔버 구성. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> oad/51410/51410fig2.jpg &quot;/&gt; 0 시점, B : 1 분 시점, C : 2 분의 시점, 그리고 D. 다른 시간 지점 (A로 코팅 된 표면을 ICAM-1/P-Selectin에 부착 된 호중구의 샘플 비디오에서 그림 2 스크린 샷 : 4 분 시점). ICAM-1의 농도가 25 ㎍ / ㎖를이고 P-셀렉틴은 0.5 ㎍ / ㎖의이다. 호중구의 흐름 속도가 500,000 세포 / ml로 호중구 밀도 350 μL / 분이다. <img alt="그림 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3.jpg" /> . 서로 다른 시간의 점 (0 시점, B : 1 분 시점, C : 2 분의 시점, 그리고 D : 4 분의 시점)에서 HUVEC 코팅 표면에 부착 호중구의 샘플 비디오에서 그림 3의 스크린 샷.호중구의 흐름 속도가 500,000 세포 / ml로 호중구 밀도 ML 350 μL /이다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" ><tbody><tr ><td> 종 </td><td > 위치 </td><td > 전단 응력 (다인 / cm 2) </td></tr><tr ><td> 사람의 </td><td> 일반 caroid 동맥 </td><td> 11.6 </td></tr><tr ><td> 사람의 </td><td> 아가미 동맥 </td><td> 6.5 </td></tr><tr ><td> 사람의 </td><td> 대퇴 동맥 </td><td> 4.3 </td></tr><tr ><td> 사람의 </td><td> 부신 대동맥 </td><td> 7.3 </td></tr><tr ><td> 사람의 </td><td> Supraceliac 대동맥 </td><td> 4.2 </td></tr><tr ><td> 사람의 </td><td> 표면 fermoral 동맥 </td><td> 4.4 </td></tr><tr ><td> 사람의 </td><td> 세정맥 </td><td> 0.5 ~ 5.0 </td></tr><tr ><td> 사람의 </td><td> 망막 처음 소동맥 </td><td> 40.2 </td></tr><tr ><td> 사람의 </td><td> 두 번째 망막 세동맥 </td><td> 0.001 </td></tr><tr ><td> 사람의 </td><td> 망막 처음 세정맥 </td><td> 23.2 </td></tr><tr ><td> 사람의 </td><td> 망막 번째 세정맥 </td><td> 0.43 </td></tr><tr ><td> 개 </td><td> 일반 caroid 동맥 </td><td> 15.8 </td></tr><tr ><td> 토끼 </td><td> 일반 caroid 동맥 </td><td> 23.3 </td></tr><tr ><td> 쥐 </td><td> 일반 caroid 동맥 </td><td> 46.​​6 </td></tr><tr ><td> 마우스 </td><td> 일반 caroid 동맥 </td><td> 64.8 </td></tr><tr ><td> 개 </td><td> 대퇴 동맥 </td><td> 9.8 </td></tr><tr ><td> 토끼 </td><td> 대퇴 동맥 </td><td> 156.8 </td></tr><tr ><td> 쥐 </td><td> 대퇴 동맥 </td><td> 65.9 </td></tr></tbody></table> 다른 기관과 다른 종의 표 1. 샘플 전단 응력. * 참고 문헌 13, 16, 19, 20에서 요약.

Watch this Scientific Journal Video about Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay at JoVE.com

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

호중구의 부착을 정량하는 방법이보고되어있다. 이 방법은 혈관에서 발생 된 것과 유사한 동적 흐름 환경을 생성한다. 그것은 허용 정제 부착 분자 (리간드) 또는 투명 스트레스 생체 환경 유사한 맥락에서 내피 세포 기질 (HUVEC) 중 하나에 호중구 부착 조사.

인간 호중구 유량 용기 접착 분석

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

human-neutrophil-flow-chamber-adhesion-assay

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.7K 조회수.  University of Alabama at Birmingham.  호중구의 부착을 정량하는 방법이보고되어있다. 이 방법은 혈관에서 발생 된 것과 유사한 동적 흐름 환경을 생성한다. 그것은 허용 정제 부착 분자 (리간드) 또는 투명 스트레스 생체 환경 유사한 맥락에서 내피 세포 기질 (HUVEC) 중 하나에 호중구 부착 조사. 

비디오: Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

포유류의 상피 세포에 박테리아의 접착 시험 관내 분석

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

연구

면역학 및 감염병학

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

사람의 체외에서</em면역 불균형의 초기 국가의 인정을위한 심사 도구를> 억제

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

흐름 조건에서 인간 제대 정맥 내피 세포 및 호중구 윤회의 연구에서 이들의 사용 격리

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

전단 응력의 인간 간 사인 내피에서 조건에 백혈구 모집을 연구하는 흐름 접착 분석

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role in fighting infections, recent research has demonstrated that they may be involved in many other disease processes, including cancer progression. Isolating purified NETs is a crucial element to allow the study of these functions.
In this video, we demonstrate a simplified method of cell free NET isolation from human whole blood using readily available reagents. Isolated NETs can then be used for immunofluorescence staining, blotting or various functional assays. This enables an assessment of their biologic properties in the absence of the potential confounding effects of neutrophils themselves.
A density gradient separation technique is employed to isolate neutrophils from healthy donor whole blood. Isolated neutrophils are then stimulated by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) to induce NETosis. Activated neutrophils are then discarded, and a cell-free NET stock is obtained.
We then demonstrate how isolated NETs can be used in an adhesion assay with A549 human lung cancer cells. The NET stock is used to coat the wells of a 96 well cell culture plate O/N, and after ensuring an adequate NET monolayer formation on the bottom of the wells, CFSE labeled A549 cells are added. Adherent cells are quantified using a Nikon TE300 fluorescent microscope. In some wells, 1000U DNAse1 is added 10 min before counting to degrade NETs

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

In the following protocol, we describe a very simple way to isolate Neutrophil Extracellular traps (NETs) from human whole blood using readily available reagents. We then demonstrate how the isolated NETs can be used in an in vitro adhesion assay with cancer cells.

단순화 된 인간 호중구 세포 외 트랩 (그물)의 분리 및 처리

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

T 림프구 - 접착 분자 상호 작용의 연구에 대한 접착에서 전단 응력의 분석

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

호중구 계보 세포의 질량 세포 분석 분석을위한 전체 골수의 준비

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...