BS는 밀라노 비 코카 여름 학생 연구 교육 프로그램의 대학에 의해 지원되었다; 연구는 건강와 이탈리아 교육부의 대학 및 GC에 대한 연구 폰다 치오 Humanitas의 이탈리아 정부의 자금 지원, 우리는 비판적를 읽는 마이클 VG Latronico 감사 원고.

1. 인간의 IPS 세포 라인 피더 무료 유지 보수 및과 Passaging <ol><li> 마트 리젤 코팅 접시를 준비합니다. 해동 한 한 시간 얼음에 인간의 ESC 자격을 갖춘 매트릭스의 유리 병 25 ML DMEM-F12 배지에 희석. 얼음에 모든 것을 유지하고 모든 접시와 튜브 사전 냉각되도록 각 35mm 플레이트 (또는 다른 접시를 사용할 경우 면적 당 상응하는 금액)에 1 ML을 추가합니다. 알루미늄 호일로 접시를 커버. </li></ol> 참고 : Matrigel의 재고 농도 배치에 따라 다릅니다. 희석 지침은 데이터 시트에 표시됩니다. <ol start="2"><li> 밤새 얼음 접시를 유지하고 다음날 얼음 제거합니다. 플레이트는 사용하기 전에 1 주일 냉장고에 보관하실 수 있습니다. </li><li> mTESR1 완전 배지 (또는 Nutristem 매체의 병을 해동) 아래 표에 따라 H-ESM을 (인간의 ESC 매체)를 준비. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> H- ESM </td><td> 최종 CONC </td><td> 500 ML에 대한 </td></tr><tr><td> 녹아웃 혈청 교체 (KSR) </td><td> 20 % </td><td> 100 ML </td></tr><tr><td> GlutaMAX 100X </td><td> 2 개 mm </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td> MEM 비 필수 아미노산 </td><td> 0.1 mM의 </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 </td><td> 100 U / ㎖ - 0.1 MG / ML </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td> 2 머 캅토 에탄올 </td><td> 0.1 mM의 </td><td> 900 μL </td></tr><tr><td> B27 보충 - VitaminA없이 </td><td> 1 % </td><td> 10 ㎖ </td></tr><tr><td> N2 보충 </td><td> 1 % </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td> 녹아웃 DMEM </td><td> - </td><td> 370 ML </td></tr></tbody></table> 주식 매체는 더 이상 2보다 주 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 전체 성장 매체를 준비하려면, 기본 FGF 그냥 befor에 추가됩니다20 NG / ML의 최종 농도에서 전자 먹이. </li></ol> 참고 : 마우스 배아 섬유 아세포 조건으로 H-ESM 전체가 IPS 세포 대신에 mTESR1 또는 Nutristem의 사용할 수 있습니다. <ol start="4"><li> 과 Passaging 전에 30 분 ~ 2 시간 동안 37 ° C에서 인큐베이터에있는 코팅 접시를 놓습니다. </li><li> 세포들은 합류에 도달하지 않은 경우에도 약 5 일마다 계대해야합니다. 식민지 감동 할 수 없습니다. </li><li> 디스 파제 (dispase) 1 ㎖ (1 ㎎ / ml의 PBS에서 10 MG / ML 주식에서 분해)와 함께 성장 매체를 교체하십시오. </li><li> 뽑아 유리 파스퇴르 피펫과 지역을 차별화 제거합니다. 제거해야 지역은 식민지의 중앙에 분화구처럼 또는 낭성 구조를 포함하고, 세포가 한 모든 영역 식민지로부터 분리 평평하게 바깥쪽으로 마이그레이션 될 것으로 보인다. </li><li> 식민지 테두리가 밝게되고 (보통 5-7 분 정도) 분리 시작할 때까지 문화 후드 아래 37 ° C에서 알을 품다. DiscarD 디스 파제 (dispase). 1 ML H-ESM, 세척 버린다. </li><li> 1 ML H-ESM에서 수확 식민지 세포 기중기 (스크레이퍼 주걱 등)를 사용하고 15 ML 에펜 도르프 튜브에 수집합니다. 1 ML H-ESM 헹군 후 튜브에 추가합니다. 4 분 1,000 RCF에서 회전 및 뜨는을 제거합니다. </li><li> 1 ML 미리 예열 성장 매체 (중 mTESR1 또는 Nutristem)에서 펠렛을 Resuspend. 너무 많은 덩어리를 깨는 방지 - 피펫 아래 적은 6 배속보다. 얼마나 많은 세포가 도금 수 있으며 1:5 2 판에 대한 예를 들어 불필요한 세포를 (보통 1:4 1시 5분 희석) 제거해야 결정, 600 μl를 제거한 다음 1.6 ML 신선한 매체를 추가합니다. </li><li> 접시에서 Matrigel을 제거합니다. 장소 세포는 접시에 고르게 배포, 드롭 들러. 이 세포는 중심을 향해 이동하게되므로, 지나치게 튜브를 흔들어 마십시오. </li><li> 판 사이 1 ML 매체 및 분할에 관을 씻으십시오. 각 판의 최종 부피는 1.5 -2 ML해야합니다. </li><li> 과 Passaging 이후 하루를 제외하고 매일 매체를 변경합니다. 그것은 있지만더 이상 2 ~ 3 일 이상은 능성 또는 분화 가능성에 영향을주지 않고 마지막 구절 경과 한 경우 매체 일상을 변경할 이상이 때때로 한 번씩 이틀 주파수에서 변경 될 수 있습니다. </li><li> 세포주 동결해야하는 경우, 2 ㎖ 피펫과 장소 1 ML / cryovial을 사용하여 1-2 ML mFreSR 동결 매체 대신에 다시 일시 중지합니다. -80 cryobox에서 개최 튜브 ° C ~ 4 일 액체 질소로 전송. </li></ol> 참고 : IPS 세포의 수동 microdissection을이 입체 현미경 하에서 수행되어야합니다. 그들은 가열 면적에 보관하는 동안 입체 현미경과 통합 체외 수정 (IVF) 워크 스테이션 (예 KSystem에서 IVF 워크 스테이션) 무균 상태에서 세포의 조작을 할 수 있습니다. 이 사용할 수없는 경우, 입체 현미경은 정기적 층류 후드 아래로 이동 할 수 있습니다. 2. 배아 체 집계 및 심장 InductioN <ol><li> 아래의 표에 따라 EBM-20 매체를 준비합니다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> EBM-20 </td><td> 최종 CONC </td><td> 500 ML에 대한 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 (원산지 남미) </td><td> 20 % </td><td> 100 ML </td></tr><tr><td> MEM은 비 필수 아미노산 </td><td> 0.1 mM의 </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 </td><td> 100U/ml - 0.1 MG / ML </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td> GlutaMAX 100X </td><td> 0.1 mM의 </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td> 2 머 캅토 에탄올 </td><td> 50 ㎛ </td><td> 450 μL </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> - </td><td> 385 ML </td></tr></tbody></table> 남미 출신의 FBS의 사용은 분화 효율을 결정하는 중요 : 세라의 다른 유형의 고용에 영향을 미칠 수 있습니다분화 과정. 50 μg / ML의 최종 농도에 완전한 EBM-20, 추가 아스 코르 빈산 (AA)를 준비합니다. 전체 성장 매체는 더 이상보다 주 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 수확의 IPS 식민지는 (단계 1.6-1.9) 위 설명했다. </li><li> 2 ML의 피펫 1 ML EBM-20에 부드럽게 resuspend을. 너무 많은 수풀을 파괴 방지 - 입체 현미경 하에서 식민지의 크기를 검사 더 2 배 이상을 피펫하지 않고. 1:1 비율에서 매우 낮은 부착 플레이트에 플레이트 (35mm 요리에 대한 예는 6 잘 플레이트 잘 사용 1). 1 ML EBM-20와 튜브를 세척하고 플레이트에 추가 할 수 있습니다. </li></ol> 참고 : 식민지의 크기는 효율성과 심장 유도 타이밍을 조절, 분화 과정에 영향을 미칩니다. 균일 크기 사채의 집계 분화 동안 관찰 변동성을 줄이기 위해 표시되었습니다. <ol start="4"><li> 3 일에 다시 방지하기 위해 현미경을 사용하여 EBM-20 번 변경사채의 제거율. 접시의 가장자리에 가까운 피펫, 그리고 매체를 제거하십시오. </li><li> 하루에 7 스위치 사채에 0.1 % 젤라틴 이전에 30 분 동안 37 ° C에서 배치로 코팅 접시에. 필요한 경우, 젤라틴은 세포 배양 후드를 제거하고 접시 남아있을 수 있습니다 O / N. 35mm 접시 당 35-40 사채를 추가합니다. </li><li> 일주일에 두 번 영역 및 변경 EBM-20을 상회을 위해 사채를 확인합니다. 입체 현미경 하에서 그들이 현지화를 촉진하기 위하여 박동 영역이 접시 덮개의 상단에있는 위치를 표시합니다. 계약 지역은 대략 10-20 일 후에 나타납니다. </li><li> 자연 수축을 가진 지역이 나타납니다 (대신 2 % FBS와 EBM-20과 같이 준비) EBM-2 배지를 전환하고 그들과 같은 제 3의 아래에 설명 격리합니다. 때 </li><li> 치고 치고 지역은 추가 실험을 위해 필요할 때까지 일주일에 두 번 매체 변화에 대한 다른 영역을 확인하기 위해 계속합니다. </li></ol> 참고 : 분화 과정의 효율성에 크게 의존여러 가지 요인, 그 중 가장 중요한이 심장 분화를 유도하는 데 사용되는 특정 세포 라인과 혈청의 배치입니다. 가장 높은 효율을 얻으려면, cardiomyogenic 잠재력과 혈청의 다양한 배치에 대한 테스트 셀 라인. 3. 지역 분리 및 문화를 치고 <ol><li> 코트 12 - 웰 플레이트 (4cm 2 영역) 또는 5 ㎍ / cm 2 피브로넥틴과 관심의 플레이트 (12 잘 접시에 잘 당 300 μL 총) 완전히 전체 표면을 커버하기에 충분한 볼륨을 만들기 위해 PBS에 희석. 세포 배양 후드에서 발견 유지하고 건조 할 수 있습니다. 플레이트는 4시에 싸여 저장할 수 있습니다 ° CO / N. </li><li> 필요에 따라 유리를 사용하여 영역을 치고 제거는 파스퇴르 피펫과 메스를 당겼다. 1 ML의 피펫과 fibronectin의 코팅 플레이트로 전송합니다. </li><li> 1 ML EBM-2를 추가합니다. </li><li> 세포가 제거 된 영​​역을 표시하고 매체를 변경하는 접시를 교차. 다른 지역은 B를 시작할 수 있으므로 플레이트는 1 개월로 유지 될 수나중에 먹는. </li></ol> 참고 : 작은 치는 덩어리가 필요한 경우는 작은 조각으로 분해 될 때까지, 실체 현미경 아래에서 몇 시간을 explanted 영역을 피펫. 이 작업은 몇 박동 세포 (동영상 3 참조)의 클러스터가 발생합니다. <ol start="5"><li> 분석을위한 준비가 될 때까지 일주일에 두 번 매체를 변경합니다. </li></ol> 참고 :이 프로토콜에서 얻은의 Cardiomyocytes는 태아와 같은 형태 및 기능적 특성을 가지고, 어른 표현형으로 성숙은 더욱 이러한 세포를 차별화하는 문화에 시간을 증가시켜 얻을 수있다. 4. 한 잔 세포 분리 및 분석 <ol><li> 코트 2 챔버 슬라이드 (4cm 2 영역) 또는 전체 문화 표면을 커버하기에 충분한 PBS에 희석 5 ㎍ / cm 2 피브로넥틴과 다른 적절한 지원합니다. 유리 지원을 사용하는 경우, 라미닌 및 피브로넥틴과 코트 (5 ㎍ / cm &lt;&gt; 2에게 각)을 먹다. </li><li> 제 3의 플레이트에서 파스퇴르 피펫 / 메스 지역을 치고 제거합니다. </li><li> 1 ML 피펫, 부화 기간 동안 한 번 튜브를 흔들어 500 μL 콜라 II (MG와 CA와 PBS에서 480 U / ㎖) 37 부화 15 분 ° C를 포함하는 15 ML 튜브로 전송 세포를 사용. </li><li> 200 μL 피펫 아래로 피펫. 어떤 덩어리가 남아있는 경우, 신선한 콜라 II에 전송하고 4.3 단계를 반복합니다. </li><li> 더 큰 덩어리가 남아 없을 때까지 단계 4.4를 반복합니다. </li><li> 3 ML EBM-2 (없음 AA)과 콜라를 비활성화합니다. 다른 튜브는 준비가 될 때까지 튜브는 다음 가열 랙의 후드 아래에 남아있을 수 있습니다. 4 분 1,000 RCF에서 원심 분리기. </li><li> 을 Resuspend 펠릿 1 ML 0.25 % 5 분 동안 37 ° C에서 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (1X PBS에 0.​​5 % 주식에서 희석) 등을 배양한다. 같은 초기 샘플에서 digestions의 분수를 결합합니다. </li><li> 4 ML EBM-2 (없음 AA)와 트립신을 비활성화. 더 t없는 2.5 ML의 주사기에 18G 바늘을 통해 세포를 통과한 7X. 4 분 1,000 RCF에서 원심 분리기. </li><li> 을 Resuspend 세포 펠렛 당 잘 플레이트 1 ML EBM-2인치 세포는 2-3 일 도금 후 기능적, 형태 학적 분석을 위해 사용될 수있다. </li></ol>

<ol>
	<li>Di Pasquale, E., Latronico, M. V., Jotti, G. S., Condorelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+and+cardiovascular+diseases:+a+genetic+tool+for+manipulating+cardiomyocyte+differentiation+and+function.">Lentiviral vectors and cardiovascular diseases: a genetic tool for manipulating cardiomyocyte differentiation and function.</a> Gene Therapy. 19, 642-648 (2012).</li><li>Laflamme, M. A., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473, 326-335 (2011).</li><li>Mummery, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes:+a+methods+overview.">Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview.</a> Circulation Research. 111, 344-358 (2012).</li><li>Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+fates+of+cardiovascular+progenitor+cells.">Origins and fates of cardiovascular progenitor cells.</a> Cell. 132, 537-543 (2008).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fresh+look+at+iPS+cells.">A fresh look at iPS cells.</a> Cell. 137, 13-17 (2009).</li><li>Josowitz, R., Carvajal-Vergara, X., Lemischka, I. R., Gelb, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+as+models+for+genetic+cardiovascular+disorders.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as models for genetic cardiovascular disorders.</a> Curr. Opin. Cardiol. 26, 223-229 (2011).</li><li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li><li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465, 808-812 (2012).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2010).</li><li>Yazawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+induced+pluripotent+stem+cells+to+investigate+cardiac+phenotypes+in+Timothy+syndrome.">Using induced pluripotent stem cells to investigate cardiac phenotypes in Timothy syndrome.</a> Nature. 471, 230-234 (2011).</li><li>Itzhaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia+with+patient-specific+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia with patient-specific human-induced pluripotent stem cells.</a> Journal of the American College of Cardiology. 60, 990-1000 (2012).</li><li>Jung, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+rescues+arrhythmogenic+RYR2+defect+in+a+patient-specific+stem+cell+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> EMBO Molecular Medicine. 4, 180-191 (2012).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4, 130ra147 (2012).</li><li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes.">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 108, 407-414 (2001).</li><li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+enhances+the+cardiac+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+through+promoting+the+proliferation+of+cardiac+progenitor+cells.">Ascorbic acid enhances the cardiac differentiation of induced pluripotent stem cells through promoting the proliferation of cardiac progenitor cells.</a> Cell Research. 22, 219-236 (2012).</li><li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+enhances+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiac+myocytes.">Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes.</a> Circulation. 107, 1912-1916 (2003).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2011).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).</li></ol>

공개 할 재정적 이해하지 않습니다.

pluripotent 줄기 세포 라인 사이에 낮은 효율과 높은 변동성이기는하지만, CM을에 자발적으로 분화 할 수있는 잠재력이있다. 새로운 유도 방법의 개발은 따라서 프로세스의 효율성을 개선하고 더 많은 정의 된 프로토콜을 향해 이동에 초점을 맞추고있다. 그러나, 이러한 새로운 차별화 방법의 대부분은 정교한 배양 조건, 타이밍 및 시약의 농도의 미세 조정, 고가의 사이토 카인과 성장 인자 치료를 ...

역사적으로, 인간 발달과 질병을 운전 유전 및 분자 메커니즘 연구는 유전자 변형 동물 모델의 생성에 기초하고있다. 그러나 수많은 인간의 표현형이 성공적으로 주로하기 때문에 두 종족 사이에 존재하는 생물학적 차이, 생쥐 복제에 실패합니다. 반면에, 인간의 조직에 대한 액세스를 제한 할 수 있으며, 자주 자료가 심도있는 실험 연구를 취득 할 수 없습니다. 심장 혈관 생물학 분야는 이러한 제한을 모두 앓고 : 인간의 마음의 생리는 마우스의 그것과 크게 다르고, 심장 조직의 상당한 수량은 사후 또는 심장 수술 동안 액세스 할 수 있습니다. 기능 인간의 CMS 분화 최적의 소스를 찾기 때문에 심장 혈관 생물학의 중심 화제가되고 있으며, 많은 노력이 문제를 해결하기 위해 만들어졌다. 다양한 세포 유형은 내가 제안되었다ncluding 골격 근모, 지역 심장 줄기 세포, 골수 단핵 세포, 내피 전구 세포와 중간 엽 줄기 세포. 그러나 데이터는 4 일치되지 않은 이러한 세포를 사용하여 얻었다. 인간 배아 줄기 세포 (ESC)의 유도는 처음 5 야마나카와 톰슨 6,7에 의해 유도 된 pluripotent 줄기 (IPS의) 세포의 획기적인 발견은 나중에 솔루션을 제공 할 듯 : 이러한 세포주기 위하여 무한정 성장 능력과 잠재력을 가지고 CMS를 포함한 세 가지 배엽의 세포 파생 상품에 상승. IPS 세포의 사용이 더 장점을 제공합니다 :자가 성인 세포에서 파생 된을, 그들은이 파생되는 개인 또는 환자와 같은 게놈을 가지고 다니십시오. 그러므로 그들은 인간의 유전 질환 및 개발 메커니즘의 조사를 용이하게 체외 모델의 개발을 할 수 있습니다. 이러한 특성 덕분에, IPS 세포는 O를 할 수 있습니다면역 거부 및 윤리적 문제 8에 관한 vercome 문제. 줄이고 ESCs는 여전히 줄기 세포 생물학 분야의 황금 표준을 표현하더라도 이러한 이유로 들어, 연구자들은 전세계는 이제 만능 줄기 세포 기술쪽으로 더 이동하고있다. IPS 세포는 현재 선천성 심장 질환 9,10 등 다양한 조건에 대한 체외에서 인간의 질병을 모델로 채택되고있다. 최근의 IPS 세포 질병 모델링 응용 프로그램은 단일 유전자 심장 질환 (즉, 긴 QT 증후군, 카테콜아민 다형성 심실 빈맥)과 심장 결함이 복잡한 표현형 (예 : 레오파드와 티모시 증후군, 확장 성 심근증)의 일부가되는 병리에 대해 수행되었다. 이 보고서는 CM을로 분화되어 환자 특정 만능 줄기 세포가 생체 내에서 질병으로 유사한 표현형과 기능적 특성을 표시 함을 확인 하였다. 그러나,심장 계통에 만능 줄기 세포를 유도 효능을 개선하기 위해 여전히 많은 도전이 있습니다. 골재 형성을 통해 인간 줄이고 ESCs에서 CMS를 자연 발생은 배아 체는 (사채) 성공 17 입증했다. 이 발견 이후, 많은 다른 방법이 제안되었다. 여러 그룹이 크게 분화 프로토콜의 효율성을 향상하고 (무언극을 참조 C., 외., 기존의 모든 방법 3의 종합적인 검토를위한 순환 연구 (2012) 화학적 및 동물 제품 무료 문화 시약쪽으로 이동 한 ). 그럼에도 불구하고, EB 집계에 따라 고전적인 방법은 여전히​​ 가장 일반적으로 기능 연구를 수행하고 질병의 메커니즘을 조사에 대한 고용을 나타냅니다. 제안 프로토콜은 심장 분화 과정을 개선하기 위해 표시되었습니다 혈청 아스 코르 빈산의 존재 사채에 IPS 세포의 집단 문화와 포에 근거sitively 이러한 세포 18,19의 성숙에 영향을 미칠. 이 문서에서 우리는 구체적으로이 방법을 통해 이동하고 환자 특정 IPS-파생 CM을 생성을위한 장치가없는 만능 줄기 세포 라인을 사용하는 방법을 보여줍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Media and Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ESC-qualified Matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
			<td>Thaw the 5 ml bottle at 4 &deg;C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 &deg;C .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0896-2MG</td>
			<td>Working concentration: 5 &mu;g/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td>Working concentration: 5 &mu;g/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (no Mg and Ca), 10X</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-515F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (with Mg and Ca), 10X</td>
			<td>Bio Sera</td>
			<td>XC-S2067/500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, neutral protease, grade II</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td>Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 &deg;C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA, 0.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 2</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>4176</td>
			<td>Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21331-020</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Thaw at 4 &deg;C, aliquot and store at -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (origin South America)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 &deg;C, heat-inactivate at 56 &deg;C for 30 min, aliquot and store at -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX, 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA, 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-135</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement, 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement, 50X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31350-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin, from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890-100G</td>
			<td>Make stock at 1% in water, store at -20 &deg;C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td>Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 &deg;C. Do not keep complete medium at 4 &deg;C for more than 1 week</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutristem hESC XF</td>
			<td>Stemgent from Biological Industries</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>Thaw at 4 &deg;C O/N, aliquot and store at -20 &deg;C until use. Aliquots may be kept at 4 &deg;C for no more than a week.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mFreSR</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5853</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-25G</td>
			<td>Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 &deg;C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dishes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>353001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3008</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>353043</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanox 2-well chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>177437</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass 2-well chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>177380</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates, ultra-low-attachment surface</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3471</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>304622</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes, 230 mm</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>612-1702</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 ml syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>300188</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVF Workstation</td>
			<td>KSystem, by Nikon</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon SMZ1500 Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human cardiomyocytes: a differentiation protocol from feeder-free human induced pluripotent stem cells

심장 개발을 운전 사건을 조사하고, 인간의 심근 질환에 이르는 분자 메커니즘을 결정하기 위해 기능적 인간의 심근 (CMS)를 생성하는 첫 번째 필수입니다. 약물 발견 및 독성학 연구에서 이러한 세포의 사용은 또한 인간의 기원 세포 사전 임상 적 유효성을 검사 할 심장 질환의 치료를위한 새로운 약물 분자를 허용, 매우 도움이 될 것입니다. CMS를 수있는 소스, 유도 pluripotent 줄기 (IPS의) 세포들이 쉽게 접근 환자의 조직에서 직접 파생 될 수있는, 가장 유망한 사이이며, 본체 (1)의 모든 세포 유형을 야기 할 수있는 고유의 능력을 가지고있다. 여러 가지 방법이 화학적으로 정의 된 프로토콜 2,3에 고전 배아 체에서 (사채) 집계 방식에 이르기까지, CM을에 IPS 세포 차별화를 위해 제안되었다. 이 문서에서 우리는 사채 기반 프로토콜을 제안하고 보여주는 방법이 METHOD를 효율적으로 장치가없는 IPS 세포의 기능 CM과 같은 세포를 생성하기 위해 사용 할 수 있습니다.

우리의 연구에서 우리는 몇 가지 만능 줄기 세포 라인에서 CM을 생성. 이 라인은 처음 MEF 피더 레이어에서 생성되었지만 바로 정의 매체 (mTESR1 또는 Nutristem 중 하나)을 사용하여 리겔에 배치했다. 다양한 분석은 형태 학적 특성, 만능 세포의 일반적인 마커의 발현 (10 월 4 SSEA4 및 TRA1-60)과 유전체의 안정성 (그림 1)의 유지를 확인하는 데 사용되었다. 심장 계통에 유...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

만능 줄기 세포는 배아 또는 유도 된 pluripotent 줄기 (IPS의) 세포 중 하나는 심근을 포함한 인간의 차별화 된 세포의 중요한 소스를 구성합니다. 여기, 우리는 배아 체 기반 프로토콜을 통해 기능적 인간의 심근을 얻기 위해 그들을 사용하는 방법을 보여주는, IPS 세포의 심장 유도에 초점을 맞출 것이다.

인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

generation-human-cardiomyocytes-differentiation-protocol-from-feeder

Research

JoVE Journal

Biology

21.2K 조회수.  Humanitas Clinical and Research Center, Italy. 만능 줄기 세포는 배아 또는 유도 된 pluripotent 줄기 (IPS의) 세포 중 하나는 심근을 포함한 인간의 차별화 된 세포의 중요한 소스를 구성합니다. 여기, 우리는 배아 체 기반 프로토콜을 통해 기능적 인간의 심근을 얻기 위해 그들을 사용하는 방법을 보여주는, IPS 세포의 심장 유도에 초점을 맞출 것이다.

비디오: Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing the pluripotent state in mouse fibroblasts.1 The same group also reported the successful reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells using human versions of the same transcription factors delivered by retroviral vectors.2 Additionally, James Thomson et al. reported that the lentivirus-mediated co-expression of another set of factors (Oct4, Sox2, Nanog and Lin28) was capable of reprogramming human somatic cells into iPS cells.3
iPS cells are similar to ES cells in morphology, proliferation and the ability to differentiate into all tissue types of the body. Human iPS cells have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction. The generation of patient-specific iPS cells circumvents an important roadblock to personalized regenerative medicine therapies by eliminating the potential for immune rejection of non-autologous transplanted cells.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming human fibroblast cells using the Stemgent Human TF Lentivirus Set. We also show that cells reprogrammed with this set begin to show iPS morphology four days post-transduction. Using the Stemolecule Y27632, we selected for iPS cells and observed correct morphology after three sequential rounds of colony picking and passaging. We also demonstrate that after reprogramming cells displayed the pluripotency marker AP, surface markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, and SSEA-3, and nuclear markers Oct4, Sox2 and Nanog.

We demonstrate the protocol for the generation of induced pluripotent stem cells from human somatic cells using lentivirus-mediated delivery of the human factors Oct4, Sox2, Nanog, and Lin28. Pluripotency was confirmed by morphology and the presence of embryonic stem (ES) cell-specific markers.

Stemgent 인간 TF의 Lentivirus와 인간의 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성 세트

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

연구

생물학

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Oligodendrocyte 엽 성의 전구 물질로 배아 줄기 세포의 분화

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem cells has created a valuable new source of pluripotent cells for drug discovery, cell therapy, and basic research.
GIBCO media and reagents have been at the forefront of pluripotent stem cell research for years. Knockout DMEM supplemented with Knockout Serum Replacement is the media of choice for embryonic stem cell growth and now iPS cell culture 3-9. This gold standard media system can now be used for feeder-free culture with the addition of Knockout SR Growth Factor Cocktail.
Traditional human ES and iPS cell culture methods require the use of mouse or human fibroblast feeder layers, or feeder-conditioned medium. These culture methods are labor-intensive, hard to scale and it is difficult to maintain hiPS cells undifferentiated due to the undefined conditions. Invitrogen has developed Knockout SR Growth Factor Cocktail to allow you to easily transition your hiPS cell cultures to feeder-free while still maintaining your use of Knockout SR.

The following protocol provides instruction for adapting human induced Pluripotent Stem (iPS) Cells to feeder-free culture using complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free medium (KSR-FF). Once adapted, instructions for continual maintenance are also provided.

완료 녹아웃 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여 인간의 IPS 세포 피더 - 자유 적응력, 문화와 Passaging

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

인간 유도 만능의 줄기 세포를 Transfecting 및 Nucleofecting

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

STEMCCA Lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are multistep procedures involving the isolation and expansion of neural precursor cells, prior to terminal differentiation. In comparison to these time-consuming approaches, we have recently found that combined inhibition of three signaling pathways, TGF&beta;/SMAD2, BMP/SMAD1, and FGF/ERK, promotes rapid induction of neuroectoderm from hPSCs, followed by immediate differentiation into functional neurons. Here, we have adapted our procedure to a novel multititre plate format, to further enhance its reproducibility and to make it compatible with mid-throughput applications. It comprises four days of neuroectoderm formation in floating spheres (embryoid bodies), followed by a further four days of differentiation into neurons under adherent conditions. Most cells obtained with this protocol appear to be bipolar sensory neurons. Moreover, the procedure is highly efficient, does not require particular expert skills, and is based on a simple chemically defined medium with cost-efficient small molecules. Due to these features, the procedure may serve as a useful platform for further functional investigation as well as for cell-based screening approaches requiring human sensory neurons or neurons of any type.

Protocols for neuronal differentiation of pluripotent human stem cells (hPSCs) are often time-consuming and require substantial cell culture skills. Here, we have adapted a small molecule-based differentiation procedure to a multititre plate format, allowing simple, rapid, and efficient generation of human neurons in a controlled manner.

Multititre 판 형식으로 인간 만능의 줄기 세포에서 뉴런의 신속하고 효율적인 생성

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the heart, and improving strategies to accurately model heart disease. The potential of exploiting human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology to generate cardiac muscle &#8220;in a dish&#8221; for these applications continues to generate high enthusiasm. In recent years, the ability to efficiently generate cardiomyogenic cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) has greatly improved, offering us new opportunities to model very early stages of human cardiac development not otherwise accessible. In contrast to many previous methods, the cardiomyocyte differentiation protocol described here does not require cell aggregation or the addition of Activin A or BMP4 and robustly generates cultures of cells that are highly positive for cardiac troponin I and T (TNNI3, TNNT2), iroquois-class homeodomain protein IRX-4 (IRX4), myosin regulatory light chain 2, ventricular/cardiac muscle isoform (MLC2v) and myosin regulatory light chain 2, atrial isoform (MLC2a) by day 10 across all human embryonic stem cell (hESC) and hiPSC lines tested to date. Cells can be passaged and maintained for more than 90 days in culture. The strategy is technically simple to implement and cost-effective. Characterization of cardiomyocytes derived from pluripotent cells often includes the analysis of reference markers, both at the mRNA and protein level. For protein analysis, flow cytometry is a powerful analytical tool for assessing quality of cells in culture and determining subpopulation homogeneity. However, technical variation in sample preparation can significantly affect quality of flow cytometry data. Thus, standardization of staining protocols should facilitate comparisons among various differentiation strategies. Accordingly, optimized staining protocols for the analysis of IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, and TNNT2 by flow cytometry are described.

The article describes the detailed methodology to efficiently differentiate human pluripotent stem cells into cardiomyocytes by selectively modulating the Wnt pathway, followed by flow cytometry analysis of reference markers to assess homogeneity and identity of the population.

유동 세포 계측법에 의한 고효율 심근에 인간 다 능성 줄기 세포의 분화 및 특성

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...