우리는 유용한 토론 Colas 실험실의 구성원 및 원고의 중요 한 리뷰 감사합니다. 이 연구는 NIH/NIEHS R44ES023521-02에 의해 지원 되었다 고 CIRM DISC2-10110 박사 Colas를 부여 합니다.

1. Id1 바이러스 준비 및 감염
<ol><li>공동 transfecting pCMVDR8.74, pMD2.G, 및 pCDH EF1 Id1 PGK PuroR Id1 overexpressing lentivirus 생성 (Addgene: 플라스 미드 #107735) HEK293T 세포로. 바이러스 성 입자를 수집 하 고, 여과 하 고, 상쾌한에서 정화 하 고 무라 외 에서-80 ° C에서 저장 (2003) 19. 또는 pCDH EF1 Id1 PGK PuroR lentivirus 생산 공급 업체에 전송 하 여 Id1 lentivirus를 상업적으로 생산. 주의: lentiviral 안전 규정 및 표준 작동 프로토콜을 따르시기 바랍니다. 참고: 중요 한: 최적의 바이러스 titer 적어도 10 이어야 한다8 10에9 Transducing 단위/mL (TU/mL).</li>
	<li>이전에 감염, 코팅 시 약, 일반적으로 Engelbreth-Holm-떼 마우스 육 종 세포 ( 재료의 표참조)에 의해 분 비 젤라틴 단백질 혼합물의 50 µ l 96 잘 접시의 한 잘 코트.</li>
	<li>6 잘 플레이트에서 PBS 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 고 0.5 m EDTA의 1 mL을 추가 하 여 재배 하는 만능 줄기 세포의 한 잘 해리 참고: 3-10 분에서 분리 시간 변화 한다. 세포의 80% 이상이 접시의 바닥에서 분리 됩니다, 다음 단계로 진행.</li>
	<li>피펫으로 멸 균과 세포 현 탁 액 15 mL 플라스틱 원심 분리기 튜브에 수집 합니다.</li>
	<li>분리 시 약 5 mL의 PBS 포함 된 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +와 중화.</li>
	<li>원심 (200 x g 3 분) 하 여 펠 릿 세포.</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 펠 릿을 꺼내 위해 튜브를 터치.</li>
	<li>다시 셀 줄기 세포 미디어의 1 ml에서를 일시 중단 합니다.</li>
	<li>공급 업체 지침에 따라 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>당 접시 20000 가능한 셀 줄기 세포 미디어 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 보충의 50 µ L에서 잘 (96 잘 접시) 코팅 ( 표 1 및 2참조).</li>
	<li>24 시간 후에 셀 첨부 파일에 대 한 모니터링 및 2 µ M로 / 바위 통로 억제제와 6 ng/mL hexadimethrine 브 로마 이드 보충 100 µ l 줄기 세포 미디어 미디어 바꿉니다 ( 표 1 및 2참조), lentiviral 감염 전에 한 h. 참고: 셀 해야 단단히 장착할 접시의 바닥에.</li>
	<li>얼음에 Id1 lentivirus 녹여</li>
	<li>잘 당 정화 lentivirus의 3 µ L 추가 (바이러스 titer 10 사이 여야8 109 화/mL), 다음 셀 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2, 20% O2)를 다시 접시를 전송.</li>
	<li>24 시간 후 바이러스 성 감염, 감염된 세포에 신선한 줄기 세포 미디어의 100 µ L를 추가.</li>
	<li>48 h 후 lentiviral 감염, 신선한 줄기 세포 미디어 1 µ g/mL puromycin 보충의 200 µ L 미디어를 포함 하는 대체 바이러스.</li>
	<li>줄기 세포 미디어 1 µ g/mL puromycin 보충의 200 µ L 매일 미디어를 새로 고침 합니다.</li>
	<li>문화 80 %confluency 도달, 해리 (96 잘 접시의 한 우물)에 대 한 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + + 0.5 m EDTA 없이 PBS의 200 µ L를 사용 하 여 셀.</li>
	<li>원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 합니다.</li>
	<li>분리 시 약 5 mL의 PBS 포함 된 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +와 중화.</li>
	<li>원심 (200 x g 3 분) 하 여 펠 릿 세포.</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 펠 릿을 꺼내 위해 튜브를 터치.</li>
	<li>다시 셀 줄기 세포 미디어 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 보충의 1 ml를 일시 중단 합니다.</li>
	<li>모든 셀 (1 mL) 전송 12-잘 접시의 코팅.</li>
	<li>24 시간 후 셀 줄기 세포 미디어의 1 mL와 잘 및 바꾸기 미디어 첨부 파일에 대 한 모니터는 6 ng/mL hexadimethrine 브 로마 이드, 변환 전에 한 h 2 µ M로 / 바위 통로 억제제와 보충.</li>
	<li>얼음에 Id1 lentivirus 녹여</li>
	<li>잘 (12-잘 접시) 당 정화 바이러스의 5 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>24 시간 후 lentiviral 감염, 신선한 줄기 세포 미디어 3 µ g/mL puromycin 보충의 1 mL와 함께 미디어를 포함 하는 대체 바이러스.</li>
	<li>48 h lentiviral 감염 게시, 신선한 줄기 세포 미디어 6 µ g/mL puromycin 보충의 1 mL와 함께 미디어를 포함 하는 바이러스를 대체.</li>
	<li>문화 80 %confluency 도달, 해리 (12-잘 접시의 한 우물)에 대 한 PBS 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 고 0.5 m EDTA의 500 µ L를 사용 하 여 셀.</li>
	<li>절반을 전송 (250 µ L) 코팅 시 약의 한 잘에 세포 현 탁 액의 줄기 세포 미디어 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 보충의 2 개 mL를 포함 하는 6 잘 플레이트 코팅.</li>
	<li>다른 절반을 사용 (250 µ L) RNA 추출 및 qRT-PCR lentiviral 중재 Id1 식 레벨, Colas 외 로 결정 하기 위해 샘플의 (2012 년) 4. 참고: 중요 한: Id1 mRNA 식 레벨 GAPDH 식 수준 (qRT-PCR 뇌관 표 3 참조)의 0.005 배 보다 낮은 경우, 반복 감염 과정 Id1 식 수준 초과 될 때까지 위에서 설명한 대로 임계값입니다.</li>
</ol>2입니다. hPSCsId1 유지 보수
<ol><li>코팅된 6 잘 플레이트에 hPSCsId1 문화와 줄기 세포 미디어 6 µ g/mL puromycin 보충의 당 3 mL에서 성장.</li>
	<li>HPSCsId1 80 %confluency 도달, 효소 없는 분리 시 약 공급 업체의 지침을 사용 하 여 집계 (1:6 분할 비율)로 셀을 통과 하 고 줄기 세포 미디어 6 µ g/mL puromycin 보충의 당 3 mL에 성장 한다.</li>
</ol>3. 차별화 hPSCsi d 1 의 준비
<ol><li>코트 코팅 시 약의 당 500 µ L와 12-잘 접시.</li>
	<li>Id1 도달 90% confluency hPSCs 1 mL의 PBS 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 고 잘 당 0.5 m m EDTA 추가 하 여 세포를 분리 하는 경우 5-10 분에 대 한 분리 과정 1 분 마다 확인 하 고 세포의 80%는 접시에서 해리는 한 번 다음 단계를 수행 하십시오.</li>
	<li>원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 합니다.</li>
	<li>분리 시 약 5 mL의 PBS 포함 된 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +와 중화.</li>
	<li>원심 (200 x g 3 분) 하 여 펠 릿 세포.</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 펠 릿을 꺼내 위해 튜브를 터치.</li>
	<li>다시 셀 줄기 세포 미디어 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 보충의 2 개 mL를 일시 중단 합니다.</li>
	<li>자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>줄기 세포 미디어 조직 문화 인큐베이터에 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 및 6 µ g/mL puromycin, 전송 접시 보충의 1 mL에 잘 당 300000 플레이트 세포.</li>
	<li>줄기 세포 미디어 문화 90 %confluency 도달할 때까지 6 µ g/mL puromycin 보충의 2 mL와 함께 매일 미디어를 새로 고침 합니다. 이 시점에서 심장 차별화를 시작 (다음 단계).</li>
</ol>4. 첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자 (FHF L CPs)에 hPSCsi d 1 의 차별화
<ol><li>12 잘 플레이트 형식에 대 한 유도 미디어 (표 1)의 1.5 mL와 함께 줄기 세포 미디어를 대체 하 여 시작 차별화 (0 일) 보충 Activin를 (100 ng/mL) (참조 표 2 에 대 한 권장 볼륨 및 Activin A에 대 한 농도 다른 플레이트 형식)입니다.</li>
	<li>하루에 1 (차별화 시작 후 24 h), 미디어를 (당 12-잘 접시의 우물) Activin A 없이 유도 미디어의 2 mL 바꿉니다.</li>
	<li>3 일에 2 mL (당 12-잘 접시의 우물) Activin A 없이 유도 미디어의 미디어를 바꿉니다.</li>
	<li>당일 5, FHF L CPs cryopreservation 수집 (다음 단계). 참고: 중요 한: Cryopreservation는 선호이 시점에서, 그것은 연결을 푸십시오 셀의 후속 cardiomyocyte 생산과 biobank 대규모 배치에서 심장 조상 세대 수 있습니다. 참고 또는 그 날 5 FHF L CPs 차별화 계속, 단계 5.1-5.5 passFHF L CPs 참조 하십시오 다음 단계 6.5 차별화 진행을 갓 코팅된 판에 전달 될 수 있습니다.</li>
</ol>5입니다. cryopreservation FHF L CPs의
<ol><li>5 일을 포함 하는 우물에서 모든 미디어를 발음 FHF L CPs 신속 하 게 따뜻한 (37 ° C) 1 x 분리 시 약 포함 하는 효소의 1 mL을 추가 ( 재료의 표참조). 조직 문화 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>1 분 후 접시를 인큐베이터에서 좌우로 흔들어.</li>
	<li>2 분 (전체 시간), 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거 하 고 10 %FBS 미디어의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>부드럽게 피펫으로 세포를 위아래로 5 mL 피펫으로 접시에서 셀 분리를 촉진 하기 위하여와.</li>
	<li>3 분 x g 200에서 원심 분리 하 여 원심 분리기 튜브와 펠 릿 세포에 세포 현 탁 액을 수집</li>
	<li>다시 cryopreservation 시 약의 2 mL에 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다.</li>
	<li>자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>추가 cryopreservation 시 약 ( 재료의 표참조) 원하는 농도 (일반적으로 5-10 × 106 셀/mL)에서 세포를 cryopreserve에 충분 한 볼륨에.</li>
	<li>Cryopreservation 튜브 셀 전송 냉각 장치 (1 ° C/min)에 튜브를 배치 하 고 냉각 장치-80 ° C 냉장고에서 밤새 껏 두기 위하여.</li>
	<li>24 시간 후 장기 저장을 위한 액체 질소 냉동된 튜브 전송. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.</li>
</ol>6. 심 실 같은 Cardiomyocytes에 FHF L CP 차별화
<ol><li>드라이 아이스 용기에 액체 질소 저장에서 하루 5 FHF L CPs 냉동 튜브를 전송.</li>
	<li>세포 현 탁 액은 완전히 해 동 때까지 2 ~ 3 분 동안 37 ° C 물 목욕에 튜브를 배치 합니다. 참고: 중요 한: 녹고 과정은 시간에 민감한. 과도 한 양의 시간에 대 한 셀 cryopreservation 미디어 노출 (즉, 10 분) 세포 생존 능력을 감소 것입니다.</li>
	<li>15 또는 50 mL 원심 분리기 튜브, 해 동된 튜브의 수에 따라 셀 전송.</li>
	<li>Dropwise (5 방울 30 초 마다) 미리 데워 진된 (37 ° C) cardiogenic 미디어 (표 1) 셀 솔루션을 분배. 1:3 cryopreservation 미디어까지이 과정을 계속: cardiogenic 미디어 비율에 도달. 이 시점에서, 1시 10분까지 cardiogenic 미디어 추가 속도 증가 cryopreservation 미디어: cardiogenic 미디어 비율에 도달. 참고: 중요 한: 빠른 osmolarity 변경 과정에서 녹고; 세포 죽음을 증가할 것 이다 따라서, cardiogenic 미디어의 dropwise 또한 위에서 설명한 대로 좋습니다.</li>
	<li>원심 (200 x g 3 분)에 의해 세포 현 탁 액 및 펠 릿 세포를 원심.</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 터치 하는 원심 분리기 튜브 셀 펠 릿을 꺼내.</li>
	<li>다시 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 보충 하는 cardiogenic 미디어와 셀을 일시 중단 합니다. 참고: 셀 생존 thaw 해 동에서 하 고, 일반적으로 다를 수 있습니다, 그리고 > 65% 생존 예측 좋은 도금 효율.</li>
	<li>도금에 대 한 원하는 셀 농도를 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 보충 하는 cardiogenic 미디어와 희석 집중 세포 현 탁 액 (다른 판 형식에 대 한 표 2 참조). 참고: 중요 한: 주의 심장 분화 효율 셀 너무 띄엄띄엄 시드 경우 거부할 수 있습니다.</li>
	<li>접시에 시드 셀입니다.</li>
	<li>조직 문화 인큐베이터에 그것을 전송 하기 전에 20 분 동안 조직 문화 후드에서 플레이트를 유지.</li>
	<li>차별화의 날 6, 셀 첨부 파일을 모니터링 합니다. 참고: 심장 창시자는 차별화의 5 일에 cryopreserved는. 셀을 녹고 후 24 h는 차별화의 6 일에는 것입니다. 참고: 부동 (죽은) 세포의 존재를 일반적입니다.</li>
	<li>7 일에는 미디어의 50%를 발음 하 고 신선한 cardiogenic 미디어의 동일한 금액으로 바꿉니다. 참고: cardiogenic 미디어 로/바위 통로 억제제의 추가 필요 하지 않습니다이 시점 이후.</li>
	<li>매일 cardiogenic 미디어와 미디어의 50%를 교체 합니다.</li>
	<li>참고를 꺾고 자발적인 11 일과 13 일 사이 나타납니다.</li>
	<li>15 일에 DAPI (핵 얼룩) 및 ACTC1를 사용 하 여 면역 형광에 의해 심장 분화 효율을 계량 (팬 심장 마커).</li>
</ol>7. 합격 및 심 실 같은 Cardiomyocytes의 유지 보수
참고: 하루 14 ~ 16, 자발적으로 심 실 같은 cardiomyocytes 계약의 단층 해야 얻을 수 있습니다. 이 시점에서, 그것은 해리 하 고 다시 접시 cardiomyocytes 문화를 균질 하 고 셀 접시에서 분리 하는 것을 방지 하기 위해 좋습니다.
<ol><li>우물에서 모든 미디어를 발음 하 고 신속 하 게 미리 따뜻하게 (37 ° C) 1 분리 시 약 포함 하는 효소의 1 mL를 추가 합니다. 참고: 포함 하는 효소 분리 시 볼륨 x 1 플레이트 형식에 따라 다르지만 완전히 잘 표면의 바닥을 커버 해야 합니다.</li>
	<li>조직 문화 인큐베이터에 접시를 전송 합니다.</li>
	<li>부드럽게 흔들 플레이트 좌우로 분리 프로세스를 가속 화 하기 위해 인큐베이터 안에 매 2 분.</li>
	<li>5-15 분 후 세포의 80% ~ 100%는 접시의 바닥에서 분리 때 인큐베이터에서 접시를 제거 하 고 10 %FBS 미디어의 동일한 볼륨을 추가 하 여 포함 하는 효소 분리 시 약 활동 x 1을 억제. 참고:이 프로세스에 대 한 1 x 효소 포함 된 분리 된 보육 시간 일괄 처리를 일괄 처리에서 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 합니다.</li>
	<li>피펫으로 및 count 셀 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 세포 현 탁 액을 혼합.</li>
	<li>원하는 셀 농도에 세포 현 탁 액 희석 (다른 판 형식에 대 한 표 2 참조) 유지 보수 미디어 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 보충.</li>
	<li>Cardiomyocytes 접시에 시드, 후 균등 하 게 셀 하 고 세포 조직 문화 인큐베이터에 접시를 전송 하기 전에 10-20 분에 대 한 연결을 허용 합니다.</li>
	<li>다시 도금 후 h 24 모니터링 셀 첨부 파일 및 복구 합니다. 참고: 부동 (죽은) 세포의 존재를 일반적입니다. 다시 도금 후 48-72 h, cardiomyocyte 자발적 수축을 재개 한다.</li>
	<li>Cardiomyocyte 문화를 유지 하려면 대체 미디어의 50% 유지 보수 미디어와 함께 매일 같은 심 실 cardiomyocytes의 사용까지 후속 실험에 대 한.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chong, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic-stem-cell-derived+cardiomyocytes+regenerate+non-human+primate+hearts.">Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts.</a> Nature. 510, 273-277 (2014).</li><li>Kodo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPSC-derived+cardiomyocytes+reveal+abnormal+TGF-beta+signalling+in+left+ventricular+non-compaction+cardiomyopathy.">iPSC-derived cardiomyocytes reveal abnormal TGF-beta signalling in left ventricular non-compaction cardiomyopathy.</a> Nature cell biology. 18, 1031-1042 (2016).</li><li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+arrhythmogenic+right+ventricular+dysplasia+with+patient-specific+iPSCs.">Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs.</a> Nature. 494, 105-110 (2013).</li><li>Colas, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+microRNA+screening+identifies+let-7+and+mir-18+as+regulators+of+germ+layer+formation+during+early+embryogenesis.">Whole-genome microRNA screening identifies let-7 and mir-18 as regulators of germ layer formation during early embryogenesis.</a> Genes &amp; development. 26, 2567-2579 (2012).</li><li>Cunningham, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Id+genes+are+essential+for+early+heart+formation.">Id genes are essential for early heart formation.</a> Genes &amp; development. , (2017).</li><li>McKeithan, W. L., Colas, A. R., Bushway, P. J., Ray, S., Mercola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-free+generation+of+multipotent+mesoderm+(Kdr+)+progenitor+cells+in+mouse+embryonic+stem+cells+for+functional+genomics+screening.">Serum-free generation of multipotent mesoderm (Kdr+) progenitor cells in mouse embryonic stem cells for functional genomics screening.</a> Current protocols in stem cell biology. , 13 (2012).</li><li>McKeithan, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+platform+for+assessment+of+congenital+and+drug-induced+arrhythmia+with+hipsc-derived+cardiomyocytes.">An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hipsc-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in physiology. 8, 766 (2017).</li><li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+tyrosine+kinase+inhibitor+cardiotoxicity+with+human+induced+pluripotent+stem+cells.">High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells.</a> Science translational medicine. 9, (2017).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature methods. 11, 855-860 (2014).</li><li>Kattman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+optimization+of+activin/nodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines.">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell stem cell. 8, 228-240 (2011).</li><li>Laflamme, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells+in+pro-survival+factors+enhance+function+of+infarcted+rat+hearts.">Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts.</a> Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling.">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1848-1857 (2012).</li><li>Willems, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule-mediated+TGF-beta+type+II+receptor+degradation+promotes+cardiomyogenesis+in+embryonic+stem+cells.">Small molecule-mediated TGF-beta type II receptor degradation promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells.</a> Cell stem cell. 11, 242-252 (2012).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cardiovascular+progenitor+cells+develop+from+a+KDR++embryonic-stem-cell-derived+population.">Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population.</a> Nature. 453, 524-528 (2008).</li><li>Palpant, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+high-purity+cardiac+and+endothelial+derivatives+from+patterned+mesoderm+using+human+pluripotent+stem+cells.">Generating high-purity cardiac and endothelial derivatives from patterned mesoderm using human pluripotent stem cells.</a> Nature protocols. 12, 15-31 (2017).</li><li>DeLaughter, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+of+temporal+gene+expression+during+heart+development.">Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development.</a> Developmental cell. 39, 480-490 (2016).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+genetics+of+hypoplastic+left+heart+syndrome.">The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome.</a> Nature genetics. 49, 1152-1159 (2017).</li><li>Corrado, D., Link, M. S., Calkins, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arrhythmogenic+right+ventricular+cardiomyopathy.">Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy.</a> New England journal of medicine. 376, 1489-1490 (2017).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus-mediated+gene+transfer+and+expression+cloning:+powerful+tools+in+functional+genomics.">Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics.</a> Experimental hematology. 31, 1007-1014 (2003).</li></ol>

저자는 공개 없다.

성공적인 차별점에 대 한 밀접 하 게 지침에 따라 위에 나열 된 확인 합니다. 또한, 여기 우리가 강력 하 게 차별화 결과 영향을 주는 주요 매개 변수 강조 표시 합니다. 감 별 법을 시작 하기 전에 다음 세 개의 매개 변수 형태를 관찰 해야 합니다: hPSCsId1, 높은 세포 압축 및 높은 합류의 줄기 형태 (> 90%) 0에서 문화. 그런 측면에서 최적의 차별화 조건 단일 세포로 도금 해리 hPSCsi d 1 ...

인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)의 대규모 생산-파생된 심장 창시자 및 cardiomyocytes는 줄기 세포 기반 요법1,2,3 와의 빠른 특성을 모델링 하는 질병에 대 한 필수 새로운 통로 규제 심장 차별화4,,56 과 생리학7,8. 비록 연구9,10,11,12,,1314의 번호,15 는 앞에서 설명한 고효율 심장 차별화 프로토콜 hPSCs에서, 아무도 중요 한 분자 차이 왼쪽의 식별도 결과 cardiomyocytes의 심장 필드 근원 해결 (첫 번째 심장 분야) 및 오른쪽 (두 번째 심장 분야) 심 실 cardiomyocytes16 과 심장 분야 특정 선 천 성 심장 질환;의 존재 즉, hypoplastic 좌 심 혼 증후군17 또는 arrhythmogenic 오른쪽 심 실 발육 이상18. 따라서, 심장 창시자의 생성 및 hPSCs에서 정의 된 심장 분야 원산지 cardiomyocytes 되고있다 치료로 그들의 관련성을 증가 하기 위하여 필요성 및 질병 모델링 도구.
이 프로토콜의 Id1, 최근 확인 된5 첫 번째 심장 필드 지정 큐 필요 하 고 충분 한 hPSCs에서 cardiogenesis를 시작 하는 Activin A와 함께에서 하는 제정 overexpression에 의존 합니다. 특히, 커닝 햄 외. (2017) 5 표시는 Id1 유도 창시자 구체적으로 표현 첫 심장 필드 (HCN4, TBX5) 하지만 하지 두 번째 심장 필드 마커 (SIX2, ISL1) 그들은 심장 차별화를 받 다. 또한, 저자는 또한 표시 유전자 변형 마우스 배아의 유전자 (i d 1-4), 전체 Id 가족 부족 첫 심장 필드 심장 창시자, 더 많은 중간과 뒷부분 심장 창시자 (동안 형성 없이 개발 두 번째 심장 필드) 아직도 그로 인하여 Id 단백질 필수적인 첫 번째 심장 필드 cardiogenesis에서 vivo에서시작 하는 제안, 형성할 수 있다. 편리 하 게, Id1 유도 창시자 cryopreserved 수 고 저절로 cardiomyocytes 표시 심 실 같은 특성을 포함 하 여 심 실 전용 마커 (IRX4, MYL2) 식으로 차별화 하 고 같은 심 실 활동 전위.
여기는 첫 번째 심장 필드 같은 (FHF-L) 심장 창시자와 같은 심 실 cardiomyocytes Id1 overexpressing hPSCs에서 생성 하는 간단 하 고 확장 가능한 방법에 설명 합니다. 이 프로토콜의 중요 한 특징은 편리한 cryopreservation 단계를 사용 하 여 후속 cardiomyocyte 생산에서 심장 조상 세대 연결을 푸십시오 가능성. 요약 하자면,이 프로토콜 (1) 생성 Id1 overexpressing hPSCs, (2) hPSCs에서 FHF L 심장 창시자를 생성, (3) cryopreserve 결과 창시자, 및 (4) 재개 FHF L 심장 조상 차별화에 필요한 단계를 자세히 설명 하 고 생성 매우 농축 (> 70-90%) 심 실 같은 cardiomyocytes 박동.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:911px;" width="910">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:204px;">ACTC1 antibody</td>
			<td style="width:144px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A7811</td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Activin A</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>Hu Recom Activin A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic Antimycotic (Anti-Anti)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B27 supplement w/o - insulin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B27 supplement w/o - vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CDH5 antibody</td>
			<td style="width:144px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>AF938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CryoStor CS10</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7930</td>
			<td style="width:444px;">Cryopreservation reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM high Glucose</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>10-013-CV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DPBS w/ Ca &#38; Mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89510-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FluoVolt membrane potential kit&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F10488</td>
			<td>For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel, Growth Factor Reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td style="width:444px;">Coating reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mTeSR1 media kit</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS w/o Ca &#38; Mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Puromycin&#160;</td>
			<td>Acros</td>
			<td>227422500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ReLeSR</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5872</td>
			<td style="width:444px;">Enzyme-free dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TAGLN antibody</td>
			<td style="width:144px;">Abcam</td>
			<td>ab14106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thiazovivin</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72254</td>
			<td style="width:444px;">RHO/ROCK pathway inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TrypLE Express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605 -010</td>
			<td style="width:444px;">1X enzyme-containing dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tyrodes solution mix packets&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2145-10X1L</td>
			<td>(For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of first heart field-like cardiac progenitors and ventricular-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells

많은 양의 기능 인간의 pluripotent 줄기 세포 파생 심장 창시자의 정의 심장 분야 원산지 cardiomyocytes 세대 셀 기반 심장 치료 및 질병 모델링에 대 한 필수입니다. 우리는 최근 Id 유전자는 필요 하 고 척추 개발 하는 동안 첫 번째 심장 필드 창시자 지정 하려면 충분 한 나타났습니다. 이 분화 프로토콜 이러한 연구 결과 활용 하 고 첫 번째 심장 필드 같은 (FHF-L) 창시자를 생산 하 강력한 지정 큐로 Activin A와 함께에서 Id1 overexpression를 사용 합니다. 중요 한 것은, 결과 창시자 효율적으로 심 실 같은 cardiomyocytes에 (~ 70-90%)를 구분합니다. 여기는 1) 생성 Id1 overexpressing hPSCs 2) 차별화 cryopreservable FHF L 창시자와 같은 심 실 cardiomyocytes의 확장 가능한 수량을 상세한 방법에 설명 합니다.

HPSCs의 생성 I d 1 라인 hPSCs 중재 Id1 overexpression (그림 1A) lentivirus 감염 됩니다. HPSCId1 생성 됩니다 일단 transgene 식 qRT-PCR (그림 1B)에 의해 정량입니다. 그 GAPDH 0.005 배 보다 높은 레벨에서 Id1 mRNA 표현으로 하는 hPSCId1 선만 차별?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

여기 우리 Activin A와 overexpression-lentivirus 중재 Id1의 간단한 조합을 사용 하 여 첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서 생성 하는 확장 메서드를 설명 합니다.

첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 Cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서의 세대

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

generation-first-heart-field-like-cardiac-progenitors-ventricular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.9K 조회수.  Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute. 여기 우리 Activin A와 overexpression-lentivirus 중재 Id1의 간단한 조합을 사용 하 여 첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서 생성 하는 확장 메서드를 설명 합니다.

비디오: Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes available for basic research and translational applications. To differentiate hiPSCs into cardiomyocytes, various protocols including embryoid body (EB)-based differentiation and growth factor induction have been developed. However, these protocols are inefficient and highly variable in their ability to generate purified cardiomyocytes. Recently, a small molecule-based protocol utilizing modulation of Wnt/&#946;-Catenin signaling was shown to promote cardiac differentiation with high efficiency. With this protocol, greater than 50%-60% of differentiated cells were cardiac troponin-positive cardiomyocytes were consistently observed. To further increase cardiomyocyte purity, the differentiated cells were subjected to glucose starvation to specifically eliminate non-cardiomyocytes based on the metabolic differences between cardiomyocytes and non-cardiomyocytes. Using this selection strategy, we consistently obtained a greater than 30% increase in the ratio of cardiomyocytes to non-cardiomyocytes in a population of differentiated cells. These highly purified cardiomyocytes should enhance the reliability of results from human iPSC-based in vitro disease modeling studies and drug screening assays.

Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.

작은 분자 변조 차별화 및 후속 포도당 기아을 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포에서 고도로 정제 된 심근 세포의 유도

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes ...

연구

발생학

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Differentiation of Atrial Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells Using the BMP Antagonist Grem2

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed phenotypes. Researchers interested in pursuing studies involving specific myocyte subtypes require a more directed differentiation approach. By treating mouse embryonic stem (ES) cells with Grem2, a secreted BMP antagonist that is necessary for atrial chamber formation in vivo, a large number of cardiac cells with an atrial phenotype can be generated. Use of the engineered Myh6-DSRed-Nuc pluripotent stem cell line allows for identification, selection, and purification of cardiomyocytes. In this protocol embryoid bodies are generated from Myh6-DSRed-Nuc cells using the hanging drop method and kept in suspension until differentiation day 4 (d4). At d4 cells are treated with Grem2 and plated onto gelatin coated plates. Between d8-d10 large contracting areas are observed in the cultures and continue to expand and mature through d14. Molecular, histological and electrophysiogical analyses indicate cells in Grem2-treated cells acquire atrial-like characteristics providing an in vitro model to study the biology of atrial cardiomyocytes and their response to various pharmacological agents.

Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.

BMP 길항제 Grem2를 사용하여 다 능성 줄기 세포에서 심방 심근의 차별화

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets of patients with metastatic melanoma. Major obstacles of this approach are the reduced viability of transferred T cells, caused by telomere shortening, and the limited number of TILs obtained from patients. Less-differentiated T cells with long telomeres would be an ideal T cell subset for adoptive T cell therapy;however, generating large numbers of these less-differentiated T cells is problematic. This limitation of adoptive T cell therapy can be theoretically overcome by using induced pluripotent stem cells (iPSCs) that self-renew, maintain pluripotency, have elongated telomeres, and provide an unlimited source of autologous T cells for immunotherapy. Here, we present a protocol to generate iPSCs using Sendai virus vectors for the transduction of reprogramming factors into TILs. This protocol generates fully reprogrammed, vector-free clones. These TIL-derived iPSCs might be able to generate less-differentiated patient- and tumor-specific T cells for adoptive T cell therapy.

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

인간의 흑색 종 종양 침윤 림프구에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

정의 및 간세포와 같은 세포의 확장 성 생성 인간 다 능성 줄기 세포에서

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

말초 혈액 유래 인간 유래 다 능성 줄기 세포에서 연골 세포 분화

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. Efforts to study human cerebral cortex development have been limited by the availability of model systems. Translating results from rodent studies to the human system is restricted by species differences and studies on human primary tissues are hampered by a lack of tissue availability as well as ethical concerns. Recent development in human pluripotent stem cell (PSC) technology include the generation of three-dimensional (3D) self-organizing organotypic culture systems, which mimic to a certain extent human-specific brain development in vitro. Currently, various protocols are available for the generation of either whole brain or brain-region specific organoids. The method for the generation of homogeneous and reproducible forebrain-type organoids from induced PSC (iPSC), which we previously established and describe here, combines the intrinsic ability of PSC to self-organize with guided differentiation towards the anterior neuroectodermal lineage and matrix embedding to support the formation of a continuous neuroepithelium. More specifically, this protocol involves: (1) the generation of iPSC aggregates, including the conversion of iPSC colonies to a confluent monolayer culture; (2) the induction of anterior neuroectoderm; (3) the embedding of neuroectodermal aggregates in a matrix scaffold; (4) the generation of forebrain-type organoids from neuroectodermal aggregates; and (5) the fixation and validation of forebrain-type organoids. As such, this protocol provides an easily applicable system for the generation of standardized and reproducible iPSC-derived cortical tissue structures in vitro.

Cerebral organoids represent a new model system to investigate early human brain development in vitro. This article provides the detailed methodology to efficiently generate homogeneous dorsal forebrain-type organoids from human induced pluripotent stem cells including critical characterization and validation steps.

인간에서 표준화 되 고 재현 가능한 개 타입 대뇌 Organoids의 생성 유도 만능 줄기 세포

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...