Name: generation of first heart field-like cardiac progenitors and ventricular-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2018-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

우리는 유용한 토론 Colas 실험실의 구성원 및 원고의 중요 한 리뷰 감사합니다. 이 연구는 NIH/NIEHS R44ES023521-02에 의해 지원 되었다 고 CIRM DISC2-10110 박사 Colas를 부여 합니다.

1. Id1 바이러스 준비 및 감염
<ol><li>공동 transfecting pCMVDR8.74, pMD2.G, 및 pCDH EF1 Id1 PGK PuroR Id1 overexpressing lentivirus 생성 (Addgene: 플라스 미드 #107735) HEK293T 세포로. 바이러스 성 입자를 수집 하 고, 여과 하 고, 상쾌한에서 정화 하 고 무라 외 에서-80 ° C에서 저장 (2003) 19. 또는 pCDH EF1 Id1 PGK PuroR lentivirus 생산 공급 업체에 전송 하 여 Id1 lentivirus를 상업적으로 생산. 주의: lentiviral 안전 규정 및 표준 작동 프로토콜을 따르시기 바랍니다. 참고: 중요 한: 최적의 바이러스 titer 적어도 10 이어야 한다8 10에9 Transducing 단위/mL (TU/mL).</li>
	<li>이전에 감염, 코팅 시 약, 일반적으로 Engelbreth-Holm-떼 마우스 육 종 세포 ( 재료의 표참조)에 의해 분 비 젤라틴 단백질 혼합물의 50 µ l 96 잘 접시의 한 잘 코트.</li>
	<li>6 잘 플레이트에서 PBS 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 고 0.5 m EDTA의 1 mL을 추가 하 여 재배 하는 만능 줄기 세포의 한 잘 해리 참고: 3-10 분에서 분리 시간 변화 한다. 세포의 80% 이상이 접시의 바닥에서 분리 됩니다, 다음 단계로 진행.</li>
	<li>피펫으로 멸 균과 세포 현 탁 액 15 mL 플라스틱 원심 분리기 튜브에 수집 합니다.</li>
	<li>분리 시 약 5 mL의 PBS 포함 된 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +와 중화.</li>
	<li>원심 (200 x g 3 분) 하 여 펠 릿 세포.</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 펠 릿을 꺼내 위해 튜브를 터치.</li>
	<li>다시 셀 줄기 세포 미디어의 1 ml에서를 일시 중단 합니다.</li>
	<li>공급 업체 지침에 따라 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>당 접시 20000 가능한 셀 줄기 세포 미디어 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 보충의 50 µ L에서 잘 (96 잘 접시) 코팅 ( 표 1 및 2참조).</li>
	<li>24 시간 후에 셀 첨부 파일에 대 한 모니터링 및 2 µ M로 / 바위 통로 억제제와 6 ng/mL hexadimethrine 브 로마 이드 보충 100 µ l 줄기 세포 미디어 미디어 바꿉니다 ( 표 1 및 2참조), lentiviral 감염 전에 한 h. 참고: 셀 해야 단단히 장착할 접시의 바닥에.</li>
	<li>얼음에 Id1 lentivirus 녹여</li>
	<li>잘 당 정화 lentivirus의 3 µ L 추가 (바이러스 titer 10 사이 여야8 109 화/mL), 다음 셀 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2, 20% O2)를 다시 접시를 전송.</li>
	<li>24 시간 후 바이러스 성 감염, 감염된 세포에 신선한 줄기 세포 미디어의 100 µ L를 추가.</li>
	<li>48 h 후 lentiviral 감염, 신선한 줄기 세포 미디어 1 µ g/mL puromycin 보충의 200 µ L 미디어를 포함 하는 대체 바이러스.</li>
	<li>줄기 세포 미디어 1 µ g/mL puromycin 보충의 200 µ L 매일 미디어를 새로 고침 합니다.</li>
	<li>문화 80 %confluency 도달, 해리 (96 잘 접시의 한 우물)에 대 한 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + + 0.5 m EDTA 없이 PBS의 200 µ L를 사용 하 여 셀.</li>
	<li>원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 합니다.</li>
	<li>분리 시 약 5 mL의 PBS 포함 된 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +와 중화.</li>
	<li>원심 (200 x g 3 분) 하 여 펠 릿 세포.</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 펠 릿을 꺼내 위해 튜브를 터치.</li>
	<li>다시 셀 줄기 세포 미디어 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 보충의 1 ml를 일시 중단 합니다.</li>
	<li>모든 셀 (1 mL) 전송 12-잘 접시의 코팅.</li>
	<li>24 시간 후 셀 줄기 세포 미디어의 1 mL와 잘 및 바꾸기 미디어 첨부 파일에 대 한 모니터는 6 ng/mL hexadimethrine 브 로마 이드, 변환 전에 한 h 2 µ M로 / 바위 통로 억제제와 보충.</li>
	<li>얼음에 Id1 lentivirus 녹여</li>
	<li>잘 (12-잘 접시) 당 정화 바이러스의 5 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>24 시간 후 lentiviral 감염, 신선한 줄기 세포 미디어 3 µ g/mL puromycin 보충의 1 mL와 함께 미디어를 포함 하는 대체 바이러스.</li>
	<li>48 h lentiviral 감염 게시, 신선한 줄기 세포 미디어 6 µ g/mL puromycin 보충의 1 mL와 함께 미디어를 포함 하는 바이러스를 대체.</li>
	<li>문화 80 %confluency 도달, 해리 (12-잘 접시의 한 우물)에 대 한 PBS 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 고 0.5 m EDTA의 500 µ L를 사용 하 여 셀.</li>
	<li>절반을 전송 (250 µ L) 코팅 시 약의 한 잘에 세포 현 탁 액의 줄기 세포 미디어 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 보충의 2 개 mL를 포함 하는 6 잘 플레이트 코팅.</li>
	<li>다른 절반을 사용 (250 µ L) RNA 추출 및 qRT-PCR lentiviral 중재 Id1 식 레벨, Colas 외 로 결정 하기 위해 샘플의 (2012 년) 4. 참고: 중요 한: Id1 mRNA 식 레벨 GAPDH 식 수준 (qRT-PCR 뇌관 표 3 참조)의 0.005 배 보다 낮은 경우, 반복 감염 과정 Id1 식 수준 초과 될 때까지 위에서 설명한 대로 임계값입니다.</li>
</ol>2입니다. hPSCsId1 유지 보수
<ol><li>코팅된 6 잘 플레이트에 hPSCsId1 문화와 줄기 세포 미디어 6 µ g/mL puromycin 보충의 당 3 mL에서 성장.</li>
	<li>HPSCsId1 80 %confluency 도달, 효소 없는 분리 시 약 공급 업체의 지침을 사용 하 여 집계 (1:6 분할 비율)로 셀을 통과 하 고 줄기 세포 미디어 6 µ g/mL puromycin 보충의 당 3 mL에 성장 한다.</li>
</ol>3. 차별화 hPSCsi d 1 의 준비
<ol><li>코트 코팅 시 약의 당 500 µ L와 12-잘 접시.</li>
	<li>Id1 도달 90% confluency hPSCs 1 mL의 PBS 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + 고 잘 당 0.5 m m EDTA 추가 하 여 세포를 분리 하는 경우 5-10 분에 대 한 분리 과정 1 분 마다 확인 하 고 세포의 80%는 접시에서 해리는 한 번 다음 단계를 수행 하십시오.</li>
	<li>원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 합니다.</li>
	<li>분리 시 약 5 mL의 PBS 포함 된 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +와 중화.</li>
	<li>원심 (200 x g 3 분) 하 여 펠 릿 세포.</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 펠 릿을 꺼내 위해 튜브를 터치.</li>
	<li>다시 셀 줄기 세포 미디어 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 보충의 2 개 mL를 일시 중단 합니다.</li>
	<li>자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>줄기 세포 미디어 조직 문화 인큐베이터에 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 및 6 µ g/mL puromycin, 전송 접시 보충의 1 mL에 잘 당 300000 플레이트 세포.</li>
	<li>줄기 세포 미디어 문화 90 %confluency 도달할 때까지 6 µ g/mL puromycin 보충의 2 mL와 함께 매일 미디어를 새로 고침 합니다. 이 시점에서 심장 차별화를 시작 (다음 단계).</li>
</ol>4. 첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자 (FHF L CPs)에 hPSCsi d 1 의 차별화
<ol><li>12 잘 플레이트 형식에 대 한 유도 미디어 (표 1)의 1.5 mL와 함께 줄기 세포 미디어를 대체 하 여 시작 차별화 (0 일) 보충 Activin를 (100 ng/mL) (참조 표 2 에 대 한 권장 볼륨 및 Activin A에 대 한 농도 다른 플레이트 형식)입니다.</li>
	<li>하루에 1 (차별화 시작 후 24 h), 미디어를 (당 12-잘 접시의 우물) Activin A 없이 유도 미디어의 2 mL 바꿉니다.</li>
	<li>3 일에 2 mL (당 12-잘 접시의 우물) Activin A 없이 유도 미디어의 미디어를 바꿉니다.</li>
	<li>당일 5, FHF L CPs cryopreservation 수집 (다음 단계). 참고: 중요 한: Cryopreservation는 선호이 시점에서, 그것은 연결을 푸십시오 셀의 후속 cardiomyocyte 생산과 biobank 대규모 배치에서 심장 조상 세대 수 있습니다. 참고 또는 그 날 5 FHF L CPs 차별화 계속, 단계 5.1-5.5 passFHF L CPs 참조 하십시오 다음 단계 6.5 차별화 진행을 갓 코팅된 판에 전달 될 수 있습니다.</li>
</ol>5입니다. cryopreservation FHF L CPs의
<ol><li>5 일을 포함 하는 우물에서 모든 미디어를 발음 FHF L CPs 신속 하 게 따뜻한 (37 ° C) 1 x 분리 시 약 포함 하는 효소의 1 mL을 추가 ( 재료의 표참조). 조직 문화 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>1 분 후 접시를 인큐베이터에서 좌우로 흔들어.</li>
	<li>2 분 (전체 시간), 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거 하 고 10 %FBS 미디어의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>부드럽게 피펫으로 세포를 위아래로 5 mL 피펫으로 접시에서 셀 분리를 촉진 하기 위하여와.</li>
	<li>3 분 x g 200에서 원심 분리 하 여 원심 분리기 튜브와 펠 릿 세포에 세포 현 탁 액을 수집</li>
	<li>다시 cryopreservation 시 약의 2 mL에 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다.</li>
	<li>자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>추가 cryopreservation 시 약 ( 재료의 표참조) 원하는 농도 (일반적으로 5-10 × 106 셀/mL)에서 세포를 cryopreserve에 충분 한 볼륨에.</li>
	<li>Cryopreservation 튜브 셀 전송 냉각 장치 (1 ° C/min)에 튜브를 배치 하 고 냉각 장치-80 ° C 냉장고에서 밤새 껏 두기 위하여.</li>
	<li>24 시간 후 장기 저장을 위한 액체 질소 냉동된 튜브 전송. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.</li>
</ol>6. 심 실 같은 Cardiomyocytes에 FHF L CP 차별화
<ol><li>드라이 아이스 용기에 액체 질소 저장에서 하루 5 FHF L CPs 냉동 튜브를 전송.</li>
	<li>세포 현 탁 액은 완전히 해 동 때까지 2 ~ 3 분 동안 37 ° C 물 목욕에 튜브를 배치 합니다. 참고: 중요 한: 녹고 과정은 시간에 민감한. 과도 한 양의 시간에 대 한 셀 cryopreservation 미디어 노출 (즉, 10 분) 세포 생존 능력을 감소 것입니다.</li>
	<li>15 또는 50 mL 원심 분리기 튜브, 해 동된 튜브의 수에 따라 셀 전송.</li>
	<li>Dropwise (5 방울 30 초 마다) 미리 데워 진된 (37 ° C) cardiogenic 미디어 (표 1) 셀 솔루션을 분배. 1:3 cryopreservation 미디어까지이 과정을 계속: cardiogenic 미디어 비율에 도달. 이 시점에서, 1시 10분까지 cardiogenic 미디어 추가 속도 증가 cryopreservation 미디어: cardiogenic 미디어 비율에 도달. 참고: 중요 한: 빠른 osmolarity 변경 과정에서 녹고; 세포 죽음을 증가할 것 이다 따라서, cardiogenic 미디어의 dropwise 또한 위에서 설명한 대로 좋습니다.</li>
	<li>원심 (200 x g 3 분)에 의해 세포 현 탁 액 및 펠 릿 세포를 원심.</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 터치 하는 원심 분리기 튜브 셀 펠 릿을 꺼내.</li>
	<li>다시 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 보충 하는 cardiogenic 미디어와 셀을 일시 중단 합니다. 참고: 셀 생존 thaw 해 동에서 하 고, 일반적으로 다를 수 있습니다, 그리고 > 65% 생존 예측 좋은 도금 효율.</li>
	<li>도금에 대 한 원하는 셀 농도를 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 보충 하는 cardiogenic 미디어와 희석 집중 세포 현 탁 액 (다른 판 형식에 대 한 표 2 참조). 참고: 중요 한: 주의 심장 분화 효율 셀 너무 띄엄띄엄 시드 경우 거부할 수 있습니다.</li>
	<li>접시에 시드 셀입니다.</li>
	<li>조직 문화 인큐베이터에 그것을 전송 하기 전에 20 분 동안 조직 문화 후드에서 플레이트를 유지.</li>
	<li>차별화의 날 6, 셀 첨부 파일을 모니터링 합니다. 참고: 심장 창시자는 차별화의 5 일에 cryopreserved는. 셀을 녹고 후 24 h는 차별화의 6 일에는 것입니다. 참고: 부동 (죽은) 세포의 존재를 일반적입니다.</li>
	<li>7 일에는 미디어의 50%를 발음 하 고 신선한 cardiogenic 미디어의 동일한 금액으로 바꿉니다. 참고: cardiogenic 미디어 로/바위 통로 억제제의 추가 필요 하지 않습니다이 시점 이후.</li>
	<li>매일 cardiogenic 미디어와 미디어의 50%를 교체 합니다.</li>
	<li>참고를 꺾고 자발적인 11 일과 13 일 사이 나타납니다.</li>
	<li>15 일에 DAPI (핵 얼룩) 및 ACTC1를 사용 하 여 면역 형광에 의해 심장 분화 효율을 계량 (팬 심장 마커).</li>
</ol>7. 합격 및 심 실 같은 Cardiomyocytes의 유지 보수
참고: 하루 14 ~ 16, 자발적으로 심 실 같은 cardiomyocytes 계약의 단층 해야 얻을 수 있습니다. 이 시점에서, 그것은 해리 하 고 다시 접시 cardiomyocytes 문화를 균질 하 고 셀 접시에서 분리 하는 것을 방지 하기 위해 좋습니다.
<ol><li>우물에서 모든 미디어를 발음 하 고 신속 하 게 미리 따뜻하게 (37 ° C) 1 분리 시 약 포함 하는 효소의 1 mL를 추가 합니다. 참고: 포함 하는 효소 분리 시 볼륨 x 1 플레이트 형식에 따라 다르지만 완전히 잘 표면의 바닥을 커버 해야 합니다.</li>
	<li>조직 문화 인큐베이터에 접시를 전송 합니다.</li>
	<li>부드럽게 흔들 플레이트 좌우로 분리 프로세스를 가속 화 하기 위해 인큐베이터 안에 매 2 분.</li>
	<li>5-15 분 후 세포의 80% ~ 100%는 접시의 바닥에서 분리 때 인큐베이터에서 접시를 제거 하 고 10 %FBS 미디어의 동일한 볼륨을 추가 하 여 포함 하는 효소 분리 시 약 활동 x 1을 억제. 참고:이 프로세스에 대 한 1 x 효소 포함 된 분리 된 보육 시간 일괄 처리를 일괄 처리에서 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 합니다.</li>
	<li>피펫으로 및 count 셀 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 세포 현 탁 액을 혼합.</li>
	<li>원하는 셀 농도에 세포 현 탁 액 희석 (다른 판 형식에 대 한 표 2 참조) 유지 보수 미디어 2 µ M로 / 바위 통로 억제제 보충.</li>
	<li>Cardiomyocytes 접시에 시드, 후 균등 하 게 셀 하 고 세포 조직 문화 인큐베이터에 접시를 전송 하기 전에 10-20 분에 대 한 연결을 허용 합니다.</li>
	<li>다시 도금 후 h 24 모니터링 셀 첨부 파일 및 복구 합니다. 참고: 부동 (죽은) 세포의 존재를 일반적입니다. 다시 도금 후 48-72 h, cardiomyocyte 자발적 수축을 재개 한다.</li>
	<li>Cardiomyocyte 문화를 유지 하려면 대체 미디어의 50% 유지 보수 미디어와 함께 매일 같은 심 실 cardiomyocytes의 사용까지 후속 실험에 대 한.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

성공적인 차별점에 대 한 밀접 하 게 지침에 따라 위에 나열 된 확인 합니다. 또한, 여기 우리가 강력 하 게 차별화 결과 영향을 주는 주요 매개 변수 강조 표시 합니다. 감 별 법을 시작 하기 전에 다음 세 개의 매개 변수 형태를 관찰 해야 합니다: hPSCsId1, 높은 세포 압축 및 높은 합류의 줄기 형태 (> 90%) 0에서 문화. 그런 측면에서 최적의 차별화 조건 단일 세포로 도금 해리 hPSCsi d 1 ...

인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)의 대규모 생산-파생된 심장 창시자 및 cardiomyocytes는 줄기 세포 기반 요법1,2,3 와의 빠른 특성을 모델링 하는 질병에 대 한 필수 새로운 통로 규제 심장 차별화4,,56 과 생리학7,8. 비록 연구9,10,11,12,,1314의 번호,15 는 앞에서 설명한 고효율 심장 차별화 프로토콜 hPSCs에서, 아무도 중요 한 분자 차이 왼쪽의 식별도 결과 cardiomyocytes의 심장 필드 근원 해결 (첫 번째 심장 분야) 및 오른쪽 (두 번째 심장 분야) 심 실 cardiomyocytes16 과 심장 분야 특정 선 천 성 심장 질환;의 존재 즉, hypoplastic 좌 심 혼 증후군17 또는 arrhythmogenic 오른쪽 심 실 발육 이상18. 따라서, 심장 창시자의 생성 및 hPSCs에서 정의 된 심장 분야 원산지 cardiomyocytes 되고있다 치료로 그들의 관련성을 증가 하기 위하여 필요성 및 질병 모델링 도구.
이 프로토콜의 Id1, 최근 확인 된5 첫 번째 심장 필드 지정 큐 필요 하 고 충분 한 hPSCs에서 cardiogenesis를 시작 하는 Activin A와 함께에서 하는 제정 overexpression에 의존 합니다. 특히, 커닝 햄 외. (2017) 5 표시는 Id1 유도 창시자 구체적으로 표현 첫 심장 필드 (HCN4, TBX5) 하지만 하지 두 번째 심장 필드 마커 (SIX2, ISL1) 그들은 심장 차별화를 받 다. 또한, 저자는 또한 표시 유전자 변형 마우스 배아의 유전자 (i d 1-4), 전체 Id 가족 부족 첫 심장 필드 심장 창시자, 더 많은 중간과 뒷부분 심장 창시자 (동안 형성 없이 개발 두 번째 심장 필드) 아직도 그로 인하여 Id 단백질 필수적인 첫 번째 심장 필드 cardiogenesis에서 vivo에서시작 하는 제안, 형성할 수 있다. 편리 하 게, Id1 유도 창시자 cryopreserved 수 고 저절로 cardiomyocytes 표시 심 실 같은 특성을 포함 하 여 심 실 전용 마커 (IRX4, MYL2) 식으로 차별화 하 고 같은 심 실 활동 전위.
여기는 첫 번째 심장 필드 같은 (FHF-L) 심장 창시자와 같은 심 실 cardiomyocytes Id1 overexpressing hPSCs에서 생성 하는 간단 하 고 확장 가능한 방법에 설명 합니다. 이 프로토콜의 중요 한 특징은 편리한 cryopreservation 단계를 사용 하 여 후속 cardiomyocyte 생산에서 심장 조상 세대 연결을 푸십시오 가능성. 요약 하자면,이 프로토콜 (1) 생성 Id1 overexpressing hPSCs, (2) hPSCs에서 FHF L 심장 창시자를 생성, (3) cryopreserve 결과 창시자, 및 (4) 재개 FHF L 심장 조상 차별화에 필요한 단계를 자세히 설명 하 고 생성 매우 농축 (> 70-90%) 심 실 같은 cardiomyocytes 박동.

<table><tbody><tr><td>ACTC1 antibody</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>Hu Recom Activin A</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic Antimycotic (Anti-Anti)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement w/o - insulin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement w/o - vitamin A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587001</td><td></td></tr><tr><td>CDH5 antibody</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF938</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7930</td><td>Cryopreservation reagent</td></tr><tr><td>DMEM high Glucose</td><td>Mediatech</td><td>10-013-CV&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DPBS w/ Ca &amp;amp; Mg</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR</td><td>89510-186</td><td></td></tr><tr><td>FluoVolt membrane potential kit&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F10488</td><td>For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Gibco</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, Growth Factor Reduced</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Coating reagent</td></tr><tr><td>mTeSR1 media kit</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>PBS w/o Ca &amp;amp; Mg</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puromycin&amp;nbsp;</td><td>Acros</td><td>227422500</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5872</td><td>Enzyme-free dissociation reagent</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>TAGLN antibody</td><td>Abcam</td><td>ab14106</td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72254</td><td>RHO/ROCK pathway inhibitor</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605 -010</td><td>1X enzyme-containing dissociation reagent</td></tr><tr><td>Tyrodes solution mix packets&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T2145-10X1L</td><td>(For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017)</td></tr></tbody></table>

generation of first heart field-like cardiac progenitors and ventricular-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells

많은 양의 기능 인간의 pluripotent 줄기 세포 파생 심장 창시자의 정의 심장 분야 원산지 cardiomyocytes 세대 셀 기반 심장 치료 및 질병 모델링에 대 한 필수입니다. 우리는 최근 Id 유전자는 필요 하 고 척추 개발 하는 동안 첫 번째 심장 필드 창시자 지정 하려면 충분 한 나타났습니다. 이 분화 프로토콜 이러한 연구 결과 활용 하 고 첫 번째 심장 필드 같은 (FHF-L) 창시자를 생산 하 강력한 지정 큐로 Activin A와 함께에서 Id1 overexpression를 사용 합니다. 중요 한 것은, 결과 창시자 효율적으로 심 실 같은 cardiomyocytes에 (~ 70-90%)를 구분합니다. 여기는 1) 생성 Id1 overexpressing hPSCs 2) 차별화 cryopreservable FHF L 창시자와 같은 심 실 cardiomyocytes의 확장 가능한 수량을 상세한 방법에 설명 합니다.

HPSCs의 생성 I d 1 라인 hPSCs 중재 Id1 overexpression (그림 1A) lentivirus 감염 됩니다. HPSCId1 생성 됩니다 일단 transgene 식 qRT-PCR (그림 1B)에 의해 정량입니다. 그 GAPDH 0.005 배 보다 높은 레벨에서 Id1 mRNA 표현으로 하는 hPSCId1 선만 차별?...

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Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

여기 우리 Activin A와 overexpression-lentivirus 중재 Id1의 간단한 조합을 사용 하 여 첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서 생성 하는 확장 메서드를 설명 합니다.

첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 Cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서의 세대

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

generation-first-heart-field-like-cardiac-progenitors-ventricular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.9K 조회수.  Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute. 여기 우리 Activin A와 overexpression-lentivirus 중재 Id1의 간단한 조합을 사용 하 여 첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서 생성 하는 확장 메서드를 설명 합니다.

비디오: Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

배아 줄기 세포에서 심장 전구 세포의 유도

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

연구

발생학

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs)

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) are increasingly recognized as having great value for modeling cardiovascular diseases in humans, especially arrhythmia syndromes. They have also demonstrated relevance as in vitro systems for predicting drug responses, which makes them potentially useful for drug-screening and discovery, safety pharmacology and perhaps eventually for personalized medicine. This would be facilitated by deriving hPSC-CMs from patients or susceptible individuals as hiPSCs. For all applications, however, precise measurement and analysis of hPSC-CM electrical properties are essential for identifying changes due to cardiac ion channel mutations and/or drugs that target ion channels and can cause sudden cardiac death. Compared with manual patch-clamp, multi-electrode array (MEA) devices offer the advantage of allowing medium- to high-throughput recordings. This protocol describes how to dissociate 2D cell cultures of hPSC-CMs to small aggregates and single cells and plate them on MEAs to record their spontaneous electrical activity as field potential. Methods for analyzing the recorded data to extract specific parameters, such as the QT and the RR intervals, are also described here. Changes in these parameters would be expected in hPSC-CMs carrying mutations responsible for cardiac arrhythmias and following addition of specific drugs, allowing detection of those that carry a cardiotoxic risk.

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes hPSC-CMs Using Multi-electrode Arrays MEAs

Electrophysiological characterization of cardiomyocytes derived from human Pluripotent Stem Cells (hPSC-CMs) is crucial for cardiac disease modeling and for determining drug responses. This protocol provides the necessary information to dissociate and plate hPSC-CMs on multi-electrode arrays, measure their field potential, and a method for analyzing QT and RR intervals.

다중 전극 배열 (MEAs)을 이용한 인간 다 능성 줄기 세포 유래 심근 세포 (hPSC-CMs)의 전기 생리 학적 분석

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading cause of mortality worldwide. Mesenchymal stem cells (MSCs) are a promising option for cell-based therapies to replace current, invasive techniques. MSCs can differentiate into mesenchymal lineages, including cardiac cell types, but complete differentiation into functional cells has not yet been achieved. Previous methods of differentiation were based on pharmacological agents or growth factors. However, more physiologically relevant strategies can also enable MSCs to undergo cardiomyogenic transformation. Here, we present a differentiation method using MSC aggregates on cardiomyocyte feeder layers to produce cardiomyocyte-like contracting cells.
Human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs) have been shown to have a greater differentiation potential than commonly investigated MSC types, such as bone marrow MSCs (BMSCs). As an ontogenetically younger source, we investigated the cardiomyogenic potential of first-trimester (FTM) HUCPVCs compared to older sources. FTM HUCPVCs are a novel, rich source of MSCs that retain their in utero immunoprivileged properties when cultured in vitro. Using this differentiation protocol, FTM and term HUCPVCs achieved significantly increased cardiomyogenic differentiation compared to BMSCs, as indicated by the increased expression of cardiomyocyte markers (i.e., myocyte enhancer factor 2C, cardiac troponin T, heavy chain cardiac myosin, signal regulatory protein &#945;, and connexin 43). They also maintained significantly lower immunogenicity, as demonstrated by their lower HLA-A expression and higher HLA-G expression. Applying aggregate-based differentiation, FTM HUCPVCs showed increased aggregate formation potential and generated contracting cells clusters within 1 week of co-culture on cardiac feeder layers, becoming the first MSC type to do so. 
Our results demonstrate that this differentiation strategy can effectively harness the cardiomyogenic potential of young MSCs, such as FTM HUCPVCs, and suggests that in vitro pre-differentiation could be a potential strategy to increase their regenerative efficacy in vivo.

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Here, we present a method to efficiently harness the cardiac differentiation potential of young sources of human mesenchymal stem cells in order to generate functional, contracting, cardiomyocyte-like cells in vitro.

생체 외에서 기능 Cardiomyocyte-같은 세포로 인간 중간 엽 줄기 세포의 분화

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in developmental cardiology have led to generating cardiac cells from pluripotent stem cells, it is unclear if the two cardiac fields - the first and second heart fields (FHF and SHF) &#8212; are induced in pluripotent stem cells systems. To address this, we generated a protocol for in vitro specification and isolation of heart field-specific cardiac progenitor cells. We used embryonic stem cells lines carrying Hcn4-GFP and Tbx1-Cre; Rosa-RFP reporters of the FHF and the SHF, respectively, and live cell immunostaining of the cell membrane protein Cxcr4, a SHF marker. With this approach, we generated progenitor cells which recapitulate the functional properties and transcriptome of their in vivo counterparts. Our protocol can be utilized to study early specification and segregation of the two heart fields and to generate chamber-specific cardiac cells for heart disease modelling. Since this is an in vitro organoid system, it may not provide precise anatomical information. However, this system overcomes the poor accessibility of gastrulation-stage embryos and can be upscaled for high-throughput screens.

The purpose of this method is to generate heart field-specific cardiac progenitor cells in vitro in order to study the progenitor cell specification and functional properties, and to generate chamber specific cardiac cells for heart disease modelling.

마우스 심장 필드 특정 심장 전구 세포의 시험관 내 생성

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

Generating Self-Assembling Human Heart Organoids Derived from Pluripotent Stem Cells

The ability to study human cardiac development in health and disease is highly limited by the capacity to model the complexity of the human heart in vitro. Developing more efficient organ-like platforms that can model complex in vivo phenotypes, such as organoids and organs-on-a-chip, will enhance the ability to study human heart development and disease. This paper describes a protocol to generate highly complex human heart organoids (hHOs) by self-organization using human pluripotent stem cells and stepwise developmental pathway activation using small molecule inhibitors. Embryoid bodies (EBs) are generated in a 96-well plate with round-bottom, ultra-low attachment wells, facilitating suspension culture of individualized constructs.
The EBs undergo differentiation into hHOs by a three-step Wnt signaling modulation strategy, which involves an initial Wnt pathway activation to induce cardiac mesoderm fate, a second step of Wnt inhibition to create definitive cardiac lineages, and a third Wnt activation step to induce proepicardial organ tissues. These steps, carried out in a 96-well format, are highly efficient, reproducible, and produce large amounts of organoids per run. Analysis by immunofluorescence imaging from day 3 to day 11 of differentiation reveals first and second heart field specifications and highly complex tissues inside hHOs at day 15, including myocardial tissue with regions of atrial and ventricular cardiomyocytes, as well as internal chambers lined with endocardial tissue. The organoids also exhibit an intricate vascular network throughout the structure and an external lining of epicardial tissue. From a functional standpoint, hHOs beat robustly and present normal calcium activity as determined by Fluo-4 live imaging. Overall, this protocol constitutes a solid platform for in vitro studies in human organ-like cardiac tissues.

Here, we describe a protocol to create developmentally relevant human heart organoids (hHOs) efficiently using human pluripotent stem cells by self-organization. The protocol relies on the sequential activation of developmental cues and produces highly complex, functionally relevant human heart tissues.

다능성 줄기 세포에서 파생된 자가 조립 인간 심장 오르가노이드 생성

The ability to study human cardiac development in health and disease is highly limited by the capacity to model the complexity of the human heart in ...

생화학

Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells

Generating patient-specific cardiomyocytes from a single blood draw has attracted tremendous interest in precision medicine on cardiovascular disease. Cardiac differentiation from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is modulated by defined signaling pathways that are essential for embryonic heart development. Numerous cardiac differentiation methods on 2-D and 3-D platforms have been developed with various efficiencies and cardiomyocyte yield. This has puzzled investigators outside the field as the variety of these methods can be difficult to follow. Here we present a comprehensive protocol that elaborates robust generation and expansion of patient-specific cardiomyocytes from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). We first describe a high-efficiency iPSC reprogramming protocol from a patient&#39;s blood sample using non-integration Sendai virus vectors. We then detail a small molecule-mediated monolayer differentiation method that can robustly produce beating cardiomyocytes from most human iPSC lines. In addition, a scalable cardiomyocyte expansion protocol is introduced using a small molecule (CHIR99021) that could rapidly expand patient-derived cardiomyocytes for industrial- and clinical-grade applications. At the end, detailed protocols for molecular identification and electrophysiological characterization of these iPSC-CMs are depicted. We expect this protocol to be pragmatic for beginners with limited knowledge on cardiovascular development and stem cell biology.

Here, we present a protocol to robustly generate and expand human cardiomyocytes from patient peripheral blood mononuclear cells.

환자 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 심근세포의 생성 및 확장

Generating patient-specific cardiomyocytes from a single blood draw has attracted tremendous interest in precision medicine on cardiovascular disease. ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

생물학

Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We recently published a cost-effective strategy for the massive expansion of hiPSC-CMs in two dimensions (2D). Two major limitations are cell immaturity and a lack of three-dimensional (3D) arrangement and scalability in high-throughput screening (HTS) platforms. To overcome these limitations, the expanded cardiomyocytes form an ideal cell source for the generation of 3D cardiac cell culture and tissue engineering techniques. The latter holds great potential in the cardiovascular field, providing more advanced and physiologically relevant HTS. Here, we describe an HTS-compatible workflow with easy scalability for the generation, maintenance, and optical analysis of cardiac spheroids (CSs) in a 96-well-format. These small CSs are essential to fill the gap present in current in vitro disease models and/or generation for 3D tissue engineering platforms. The CSs present a highly structured morphology, size, and cellular composition. Furthermore, hiPSC-CMs cultured as CSs display increased maturation and several functional features of the human heart, such as spontaneous calcium handling and contractile activity. By automatization of the complete workflow, from the generation of CSs to functional analysis, we increase intra- and inter-batch reproducibility as demonstrated by high-throughput (HT) imaging and calcium handling analysis. The described protocol allows modeling of cardiac diseases and assessing drug/therapeutic effects at the single-cell level within a complex 3D cell environment in a fully automated HTS workflow. In addition, the study describes a straightforward procedure for long-term preservation and biobanking of whole-spheroids, thereby providing researchers the opportunity to create next-generation functional tissue storage. HTS combined with long-term storage will substantially contribute to translational research in a wide range of areas, including drug discovery and testing, regenerative medicine, and the development of personalized therapies.

Presented here is a set of protocols for the generation and cryopreservation of cardiac spheroids (CSs) from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured in a high-throughput, multidimensional format. This three-dimensional model functions as a robust platform for disease modeling, high-throughput screenings, and maintains its functionality after cryopreservation.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심장 스페로이드의 생성, 고처리량 스크리닝 및 바이오뱅킹

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...

생체공학

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) provide a valuable human source for studying the basic science of calcium (Ca2+) handling and signaling pathways as well as high-throughput drug screening and toxicity assays. Herein, we provide a detailed description of the methodologies used to generate high-quality iPSC-CMs that can consistently reproduce molecular and functional characteristics across different cell lines. Additionally, a method is described to reliably assess their functional characterization through the evaluation of Ca2+ handling properties. Low oxygen (O2) conditions, lactate selection, and prolonged time in culture produce high-purity and high-quality ventricular-like cardiomyocytes. Similar to isolated adult rat cardiomyocytes (ARCMs), 3-month-old iPSC-CMs exhibit higher Ca2+ amplitude, faster rate of Ca2+ reuptake (decay-tau), and a positive lusitropic response to &#946;-adrenergic stimulation compared to day 30 iPSC-CMs. The strategy is technically simple, cost-effective, and reproducible. It provides a robust platform to model cardiac disease and for the large-scale drug screening to target Ca2+ handling proteins.

Here we describe and validate a method to consistently generate robust human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and characterize their function. These techniques may help in developing mechanistic insight into signaling pathways, provide a platform for large-scale drug screening, and reliably model cardiac diseases.

칼슘 취급 특성화를 위한 심실 유사 HiPSC 유래 심근세포 및 고품질 세포 제제 의 생성

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) provide a valuable human source for studying the basic science of calcium (Ca2+) ...