다음 프로토콜은 다웰 MEA 플레이트에서 인간 유발 만능 줄기 세포 유래 심근세포 네트워크의 개발을 설명하여 작용 전위 측정을 위해 세포막을 가역적으로 전기화합니다. 그런 다음 작업 잠재적 매개 변수를 사용하여 전기 생리학에 대한 화합물을 테스트하기 위해 이러한 반응 곡선을 생성할 수 있습니다. 멀티웰 MEA 코딩 및 셀 도금은 특별한 주의가 필요한 가장 어려운 단계입니다.
물방울이 퍼지고 건조되는 것을 방지하기 위해 부지런하고 신속하게 이러한 단계를 수행해야합니다. 연습으로, 이것은 쉽게 극복 할 수 있습니다. 단일 세분화, 품질 보증 및 매개 변수 추출을 위한 사용자 지정 그래픽 사용자 인터페이스를 개발했습니다.
당사의 강력한 MATLAB 워크플로우는 대량의 원시 실험 데이터를 처리 가능성이 파형의 편향된 그룹으로 빠르게 줄이기 위해 구현되었습니다. 원고 방향에 따라 인간 유발 만능 줄기 세포 유래 심근세포를 해동하여 시작합니다. 세포 덩어리를 해리하기 위해 전달 파이펫을 사용하여 세포를 부드럽게 일시 중단합니다.
그런 다음 기판 코팅 6웰 플레이트의 각 웰에 셀 서스펜션 2밀리리터를 조심스럽게 분배하고 37°C와 이산화탄소 5%의 세포 배양 배양배에 플레이트를 배치합니다. 세포는 24 시간까지 젤 지역을 준수하고 48 시간 후 도금에서 자발적으로 이길 해야합니다. 도금 이틀 전에 인간 iPSC 심근세포 배양 배지의 0.5 밀리리터를 24웰 다중 전극 어레이 또는 MEA 플레이트의 각 웰에 추가하고, MEA의 품질 검사로서 신호 대 잡음 비율을 확인하기 위해 기준기록을 수행한다.
그런 다음, 매체를 흡습하고, 멸균물로 우물을 헹구고, 밤새 라미나르 플로우 후드에서 UV 빛 아래에서 멸균한다. 다음 날, MEA 표면의 친수성 치료를 위해 각 웰에 FBS의 0.1 밀리리터를 추가하고 30 분 동안 실온에서 플레이트를 배양하십시오. 그런 다음 FBS를 흡인하고 멸균 수의 0.5 밀리리터로 각각 두 번 헹구세요.
접시를 떠나 밤새 라미나르 플로우 후드에 건조. 다음 날, 파이펫 5 마이크로리터의 섬유네틴 희석을 하고 각 웰의 중앙에 액적을 조심스럽게 분배하여 12개의 전극을 모두 커버합니다. 접시 표면 전체를 덮을 수 있을 만큼 충분한 멸균물이 들어 있는 가습 챔버 내부에 접시를 즉시 놓습니다.
3 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트와 챔버를 배치 한 다음 세포 도금으로 진행합니다. 심근세포를 플레이트할 준비가 되면, 인간 iPSC 심근세포 해동 배지에서 희석하여 마이크로리터당 세포 밀도를 6, 000세포로 조절한다. 부드러운 깜박임으로 세포가 퇴적하지 않도록 하십시오.
MEA 플레이트를 라미나르 플로우 후드에 넣고 전극을 건드리지 않고 P10 파이펫으로 섬유네틴 드롭을 조심스럽게 제거합니다. 즉시 5 마이크로 리터 세포 액적을 우물의 중앙에 분배하여 모든 12 개의 전극을 덮습니다. 섬유네틴이 건조되는 것을 방지하기 위해 한 번에 이 작업을 잘 수행하십시오.
도금이 완료되면 MEA 플레이트를 느슨하게 덮인 가습 챔버에 다시 놓고 세포 배양 인큐베이터로 3시간 동안 되돌려 놓습니다. 인큐베이션 후 P200 파이펫을 사용하여 세포를 방해하지 않고 각각의 양에 인간 iPSC 심근세포 해동 배지의 200 마이크로리터를 조심스럽게 추가하십시오. MEA 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 다시 배치하고 도금 후 24시간 배양 배지를 교체한다.
심근세포로부터 신호를 획득할 준비가 되면, 획득 소프트웨어를 시작하고 원고 의 방향에 따라 MEA 플레이트를 삽입한다. 탐색 버튼을 클릭하여 모든 우물에서 신호를 시각화하고 안정적인 상태 조건에서 신호 품질을 확인합니다. 밀리볼트 범위의 필드 전위 또는 FP 신호가 있는 전극에 대해 기록해 보세요.
그런 다음 동일한 버튼을 클릭하여 탐색을 중지합니다. 이 시점까지 데이터가 기록되지 않았습니다. 이동 버튼을 클릭하여 녹화를 시작합니다.
각 웰의 전극은 원시 데이터 창에 FP 신호를 표시합니다. 30초 동안 녹화한 후, 자극 버튼을 클릭하고 선택한 사이트에서 30초 동안 전기포공을 수행합니다. 그런 다음 동일한 버튼을 클릭하여 시뮬레이션을 중지하고 60초 동안 계속 녹음합니다.
MATLAB 기반 사용자 지정 소프트웨어를 사용하여 다양한 필드 잠재력 및 작업 잠재적 데이터 매개 변수를 세분화하고 추출합니다. 먼저 파형 분석 코드를 실행하고 File.h5를 클릭하고 프로세스.h5를 선택합니다. 이전에 만든 mwd를 찾아 선택합니다.
h5 파일. 디렉토리 저장 버튼을 클릭하여 출력 파일의 저장소 위치를 변경합니다. 그런 다음 전극과 관심있는 조합을 선택한 다음 큐 버튼을 클릭하여 신호 처리 큐를 만듭니다.
이 단계를 반복하여 대기열에 전극과 잘 조합을 추가합니다. 세포가 약물로 처리된 경우, 메드 이름, 메드 농도를 직접 클릭하여 큐를 편집할 수 있습니다. 큐가 완료되면 파형 초기화 버튼을 클릭하여 신호를 식별하고 세분화하기 위해 추출되는 예비 처리를 시작합니다.
처리가 완료되면 확대/축소 버튼을 클릭하고 작업 잠재력 또는 AP 관심 영역을 선택합니다. 유지 버튼을 클릭하고 패널을 검토합니다. 모든 파형에 대해 피크와 쓰루가 감지되고 정규화된 AP가 중첩됩니다.
완료되면 유지 버튼을 클릭하여 큐의 다음 추적으로 이동하고 나머지 전극 및 잘 조합된 신호에 대한 프로세스를 반복합니다. 해동 후 심근세포의 생존력과 도금 밀도는 다중웰 MEA 문화에 매우 중요합니다. 적절한 도금은 48 시간에서 자발적인 구타와 건강한 단층 배양귀, 가난한 세포 생존능력비의 높은 비율로 배양귀귀.
세포 물방울 분산은 배양 밀도에 영향을 미치고 세포 사멸로 이어질 수 있으므로 정확한 세포 배치가 중요합니다. MEA에서 배양된 세포는 도금 후 48시간 동안 전기 활성에 대한 품질 검사를 받습니다. 네트워크 내전극의 50%와 전체 네트워크의 70%가 FP 신호를 생성하지 않으면 배양이 최적이 아닙니다.
전기포기 매개 AP 기록은 MEA 도금 후 48시간 후 여러 번 얻을 수 있다. 0, 24, 48, 72 및 96시간에 동일한 셀 부위의 다중 전기기화는 시간이 지남에 따라 AP 형상에 큰 영향을 미치지 않는다. 또한 동일한 세포 부위로부터 FP와 후 전기기 AP 진폭 사이의 상관 관계가 관찰되지 않았습니다.
이 방법의 중요한 장점은 다중웰 MEA 플레이트를 여러 번 재사용할 수 있다는 것입니다. 이 어레이의 신뢰성을 입증하기 위해 3, 815 AP 파형은 세 개의 복원 배치에서 추출되고 AP 기간 데이터는 추출되어 결과의 반복성을 검사합니다. 관심 있는 경우, 유전자 발현, 칼슘 과도 측정 및 패치 클램프와 같은 추가 분석서를 수행하여 특정 이온 전류의 동작을 조사할 수 있다.
이 기술은 연구원이 심근세포에 만성 복용량 효력을 스크린하는 것 뿐만 아니라 전기 생리성 성숙을 강화하는 쪽을 포장합니다.
