이 프로토콜은 심장 스페로이드의 생성, 유지 관리 및 광학 분석을 위한 워크플로우를 설명합니다. 이러한 심장 스페로이드는 현재 체외 질환 모델의 격차를 메우는 데 필수적입니다. 이 기술을 통해 연구자들은 차세대 고처리량 스크리닝 및 심장 스페로이드의 기능적 보관을 만들 수 있습니다.
인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포를 포함하는 배양 플레이트의 각 웰에 1 밀리리터 / 센티미터 제곱의 멸균 심장 박리 용액을 추가하는 것으로 시작하십시오. 플레이트를 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 명시야 현미경의 4배 배율로 흰색과 둥근 모양의 세포를 관찰하여 세포의 분리를 확인합니다.
5 밀리리터 피펫을 사용하여 2 밀리리터의 따뜻한 기저 배지로 세포를 플러싱하여 세포를 기계적으로 해리시켜 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 세포 현탁액을 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고, 300g에서 3분 동안 원심분리한다. 그런 다음 상청액을 흡인하고 1밀리리터의 hiPSC-CM 재도금 매체에 세포를 재현탁합니다.
1, 000 마이크로 리터 피펫 팁을 사용하여 세포 펠릿을 해리하십시오. 3 회 또는 4 회 혼합 후 용액이 균질하게 나타나면 카세트에 로드하여 세포를 계수하고 100 마이크로 리터의 재 도금 배지에 적절한 양의 세포를 초저 부착, 둥근 바닥, 96 웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 인큐베이터의 오비탈 셰이커에 심장 스페로이드 플레이트를 섭씨 37도의 온도, 5%의 이산화탄소, 21%의 산소, 90%습도로 24시간 동안 70rpm으로 놓습니다.
스페로이드 파열을 방지하려면 각 웰에서 50마이크로리터의 배지만 흡입하고 처음 48시간 동안 웰당 100마이크로리터의 RPMI와 B27 배지를 추가합니다. 다음에, 각 웰로부터 100 마이크로리터의 배지를 흡인하고, 웰 당 100 마이크로리터의 성숙 배지를 첨가한다. 성숙 배지에서 세포를 유지하고 2-3 일마다 배지를 새로 고칩니다.
스페로이드 플레이트를 얼음 위에 10분 동안 놓아 예냉한 후 플레이트를 70g에서 3분 동안 원심분리합니다. 50마이크로리터가 우물에 남을 때까지 배지를 제거합니다. 그런 다음 웰당 200마이크로리터의 얼음처럼 차가운 hiPSC 동결 매체를 추가합니다.
플레이트 밀봉 필름으로 플레이트를 밀봉합니다. 실리콘 몰드를 준비하기 위해 실리콘 엘라스토머 키트의 구성 요소를 10:1 비율로 혼합하고 웰 플레이트의 바닥 부분에 용액을 추가합니다. 진공 펌프를 사용하여 15-20분 동안 용액의 기포를 제거합니다.
몰드를 오븐에 넣고 섭씨 60도에서 8시간 동안 경화시켜 플레이트에서 벗겨낸 반유연 엘라스토머를 얻습니다. 밀봉된 플레이트를 실리콘 몰드에 조심스럽게 넣어 웰 플레이트와 냉동실 사이의 균일한 열 교환을 보장합니다. 플레이트를 액체 질소 탱크 또는 장기 보관을 위해 섭씨 150도 냉동고로 옮기기 전에 준비된 실리콘 몰드에서 최소 4시간 동안 플레이트를 섭씨 80도에서 동결합니다.
심장 스페로이드의 빠른 해동을 보장하기 위해 액체 질소에서 한 번에 심장 스페로이드가 있는 세포 플레이트 하나를 수집하고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소, 21% 산소 및 90% 습도의 인큐베이터에 15분 동안 두십시오. 플레이트에서 밀봉 필름을 제거하고 각 웰에 200 마이크로리터의 따뜻한 기본 배지를 추가하기 전에 각 웰의 150마이크로리터를 흡인합니다. 플레이트를 70g에서 3분 동안 원심분리하고 따뜻한 기초 배지 세척을 반복합니다.
완료되면 150 마이크로 리터의 배지를 제거하고 각 웰에 200 마이크로 리터의 심근 세포 해동 배지를 추가합니다. 그런 다음 심장 스페로이드 생성 동안 언급된 대로 RPMI 세척을 반복한 다음 성숙 배지에서 세포를 유지합니다. 배양 1주일 후, 해동된 심장 스페로이드는 칼슘 취급 광학 이미징에 최적입니다.
각 웰의 150 마이크로 리터를 흡인합니다. 해동된 심장 스페로이드를 어두운 조건에서 웰 당 100마이크로리터의 Cal-520 AM 칼슘 염료 배지로 처리하고 플레이트를 60분 동안 배양합니다. 현미경에 전원을 공급하고 환경 제어 옵션이 켜져 있는지 확인하여 칼슘 획득 및 분석 시스템을 준비합니다.
카메라와 프레이밍 조리개 크기를 조정하여 배경 영역을 최소화합니다. 칼슘 신호를 측정하려면 488나노미터 레이저를 사용하여 칼슘 방출 중에 밝은 녹색 신호가 있는 검은색 배경으로 대비를 설정합니다. 10초 이내에 2-10개의 피크의 일관된 스트림으로 비디오를 녹화합니다.
10초 분량의 비디오를 녹화하고 96웰 플레이트를 스캔하여 처음에는 왼쪽으로 이동한 다음 지그재그 방식으로 아래쪽으로 이동하여 전체 플레이트를 덮습니다. 과도칼슘을 획득한 후 형광 추적 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. 심장 스페로이드는 파종 후 첫날까지 3D 구조를 획득했으며 최대 6주 동안 배양할 수 있었습니다.
3주령 심장 스페로이드의 대부분은 알파 액티닌 및 트로포닌 T.0일째에 높은 수준의 알파 액티닌과 3주 된 심장 스페로이드가 배양 중에 일정하고 매우 순수한 세포 조성을 나타냄으로써 규칙적인 육종 조직을 나타냈습니다. 심장 유전자, 데스모솜 및 미토콘드리아의 증가된 발현은 90일 동안 2D에서 배양된 hiPSC-CM보다 스페로이드에서 관찰되었습니다. 심장 스페로이드의 박동 비율은 생성 후 처음 3주 동안 비슷했으며 심장 스페로이드 악화로 인해 6주차에 크게 떨어졌습니다.
박동률은 3주차에 비해 현저히 감소했고 악화의 결과로 6주차에 감소했습니다. 칼슘 과도 매개변수는 2주차에 더 높은 피크 값을 나타냈고, 상승 시간, 붕괴 시간 및 붕괴의 90%에서 칼슘 과도 지속 시간은 3주차에 유의하게 증가하여 hiPSC-CM 유래 스페로이드가 생성 후 2주차와 3주차에 기능적으로 최적임을 보여줍니다. 스페로이드 크기는 파종에 사용되는 세포의 수에 따라 증가했습니다.
더 큰 크기의 오래된 스페로이드에서는 박동이 훨씬 더 컸습니다. 2.5k 스페로이드와 비교하여 5k, 10k 및 20k 스페로이드에서 유사하고 상당히 높은 박동률이 나타났습니다. 냉동보존은 심장 스페로이드 내의 세포 생존율에 영향을 미치지 않았습니다.
해동된 스페로이드와 신선한 연령 일치 스페로이드에서 육종 단백질의 유사한 발현은 냉동 보존 효율을 나타냅니다. 해동되거나 신선한 심장 스페로이드의 박동률에는 큰 변화가 없었습니다. 상승 시간, 붕괴 시간 및 해동 또는 신선한 CS의 CTD90에서 유의미한 변화가 관찰되지 않았습니다. 질병 모델링 및 고처리량 약물 스크리닝 외에도 이러한 스페로이드는 세포외 소포 생산 및 세포외 소포 관련 치료의 생물반응기에도 사용할 수 있습니다.
또한 이러한 스페로이드의 바이오뱅킹은 재생 전략을 위한 새로운 심근세포 공급원으로 사용될 수 있습니다. 축적된 증거에 따르면 낭포성 섬유증, 암 및 심장 스페로이드에 대한 환자 유래 줄기 세포 모델의 바이오뱅크는 약물 스크리닝 및 개인 맞춤형 의학을 위한 분자 메커니즘을 밝힐 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다.
