이 작품에 대한 자금 조달은 R. 임과 AJ 캠프에 가넷 패스포트와 로드니 윌리엄스 기념 재단 프로젝트 교부금에 의해 제공되었다.

1. 동물 <ol><li> 마우스는 호주의 설치류 센터 (ARC, 퍼스, 호주)에서 얻은 환경 농축과 일반 12 시간 빛 / 어둠주기 시드니 보쉬 동물 시설의 대학에서 개최. 설명 모든 실험은 시드니의 동물 윤리위원회의 대학에 의해 승인되었습니다. </li><li> 남성과 여성의 생쥐 (C57/BL6)이 변형은 일반적으로 유전자 조작을위한 배경으로 사용되기 때문에 모든 실험에 사용하였고, 8-9 야생형 같은 것으로 간주 될 수 있습니다. </li></ol> 2. 조직 준비 <ol><li> 26 NaHCO3를 11 포도당, 250 글리세롤, 2.5 KCl을, 1.2의 NaH 2 PO 4, 1.2 MgCl 2, 2.5 염화칼슘 2 : 구성된 글리세롤 기반의 인공 뇌척수 (ACSF) (단위 : mm)의 300 ML을 준비합니다. 염화칼슘의 추가 이전에, 가스 carbogen (95 % O 2 5 % CO 2)와 솔루션은 AP를 구축하는7.4 H 피하고 칼슘 침전 (흐려). 아이스 슬러리가 형성되도록 45 분 -80 ° C의 냉동고에서 솔루션을 고정합니다. </li><li> 깊이 복강 주사를 통해 케타민 (100 ㎎ / ㎏) (파넬, 알렉산드리아, 호주)와 쥐를 마취시키다. </li><li> 일단 뒷다리 사지 핀치 반사 날카로운 스테인리스 가위를 사용하여 결석 목을 벨 마우스이며 두개골을 노출하는 면도날 (# 22 반올림)를 사용하여 시상 ​​피부 절개를합니다. 이 시점에서와 같이 2.3-2.8에 걸쳐 두개골 금고, 뇌 및 기본 전정 장치는 조직에 얼음처럼 차가운 ACSF의 일반 응용 프로그램에서 가능한 시원한로 유지해야합니다. </li><li> 표준 패턴 가위의 뾰족한 팔 (FST, 노스 밴쿠버, 캐나다)를 사용하여 람다에서 두개골에 작은 절개를하고 시상 봉합을 따라 잘라. 뇌가이 단계에서의 전단 블레이드로 &quot;드래그&quot;되지 않았는지 확인합니다. </li><li> 조심스럽게 옆으로 멀리 정수리 뼈와 뒤통수 뼈 posterio 껍질RLY 얕은 굴곡 피어슨 rongeurs (FST)를 사용하여. </li><li> 작은 스테인레스 스틸 주걱은 조심스럽게 중간과 후방 두개골 fossae의 표면에서 머리를 들어 올리는 데 사용하고, 노출 vestibulocochlea 신경 (CNVIII)는 내이 (内耳) 및 미세 홍채 가위와 뇌간 사이의 중간을 잘라. 이 신경을 절단 머리 세포의 기본 심성과 연결 축삭에 과도한 긴장을 최소화합니다. </li><li> CN VIII의 절개에 따라 뇌 토토에서 제거됩니다. </li><li> 전정 미로는 달팽이관이 anteromedially 가리키는 이제 중간 두개골 포사에서 명확하게 볼 수 있습니다. 조심스럽게 앞쪽에 반원형의 운하를 잡고 옆으로 잡아 당겨 절개 전에 전정 미로의 양쪽을 Rongeur. </li><li> 2.1 절에 설명 된 얼음처럼 차가운 지속적으로 가스를 공급 ACSF를 포함하는 해부 접시에 절제 미로 (그림 1)을 담가. 입체 현미경 아래에 미로를 개최달팽이관을 잡고하여 요리의 기초. 전방 반원의 운하 팽대부를 덮고있는 뼈에 멀리 스크래치 미세 집게를 사용합니다. 뼈에 작은 구멍이 달성되면 멀리 팽대부에서 뼈를 가볍게하기 시작합니다. 주의이 기본 막성 미로와 감각 상피에 손상을 일으킬 수 있으므로 뼈를 집게를 밀어하지 않도록주의해야한다. 전방과 인접한 수평 반원 막 덕트 및 ampullae 모두 (그림 2) 노출 될 때까지이 절차를 계속합니다. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig1.jpg" /> 그림 1. 고립 된 마우스 전정 미로입니다. A. 왼쪽 패널) 고립 된 마우스 전정 미로의 도식 표현. 전정 감각 상피에 액세스하기위한 기준의 중요한 점은, 달팽이관, 전방, 수평 반원의 운하 실험실입니다으로 모델링. 별표 전정 감각 상피를 포함하는 반원의 운하 팽대부를 나타냅니다. B.는 1 개월 마우스에서 분리 된 전정 미로의 오른쪽 패널) 현미경 사진. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig2.jpg" /> 그림 2. 막성 전정 미로의 노출. 전방 수평 반원의 운하 ampullae를 덮고있는 뼈는 블랙 / 브라운 반점이 막 ampullae 및 관련 팽대부 신경 (CNVIII)을 나타 내기 위해 멀리 긁힌되었습니다. 하단 패널의 회로도 현미경의 강조 표시된 영역에서 구조를 나타내고 ampullae 및 CNVIII에 반원의 운하 덕트의 관계를 보여줍니다. <ol start="10"><li> 미세 집게를 사용, 가볍게 보장, 뼈 ​​미로에서 멀리 ampullae 및 관련 난형를 들어 그 ampullae의 중심 지역 (콘타감각 상피를) ining가 손상되지 않습니다. 어떤 경우에는 반원형 막 덕트의 근위 부분은 뼈 ampullae을 해제 홍채 가위로 잘라해야 할 수 있습니다. </li><li> Leibovitz의 L-15 배양액 (시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO)로 가득 페트리 접시에 두 ampullae과 난형 낭을 포함하는 화음을 전송합니다. &quot;백라이트&quot;조직에 광학 섬유를 사용합니다. 이 ampullae 내 감각 상피를 포함하는 crista의 명확한 시각화 할 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 잘 홍채 가위로 난형의 얼룩덜룩 한 &quot;지붕&quot;의 절개를합니다. 전방의 지붕 그리고 수평 ampullae 통해 절개를 계속합니다. 합니다 (그림 3A)를 문의하지 않고 가능한 한 감각 상피의 가장자리에 가깝게 절개를합니다. 감각 상피를 덮고있는 막에는 조각 (그림 3B)가 없는지 확인 </li><li> 작은 GLAS에 고립 된 반 그대로 준비를 전송의 바닥 녹음 챔버 L-15 미디어로 채워진. 평평 U-모양의 백금 와이어 (그림 3B)에 고정 좋은 나일론 섬유의 격자를 사용하여 준비를 무게. 이상적으로, 그리드의 섬유 감각 상피를 덮어 쓰기하지 말아야하지만 더 많은 안정성이 요구되는 경우에, 어쩌면 선호하는 감각 상피를 끊어 버렸네 단 하나 섬유. </li></ol><img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig3.jpg" /> 그림 3. 반 그대로 준비 및 전극 구성의 전정 감각 상피. A. 도식 표현의 고립 된 반 그대로 준비. crista을 덮고 팽대부는 감각 상피 (녹색)의 표면을 노출하는 &quot;드 지붕&quot;이다. 전방 (AC)과 수평 (HC) crista (난형를 보여 준 그대로 &#39;깡패&#39;의 준비 B. 현미경 사진 할 가려) AC 뒷다리. 녹음 챔버의 기초에 준비를 고정하는 데 사용되는 나일론 섬유를합니다. 스케일 바 :. 100 μm의 C. 개별 전정 헤어 셀 위치 기록 전극. 스케일 바 : 15 μm의. 3. 전기 생리학 <ol><li> 지속적으로 산소 L-15 배지로 준 그대로 준비를 붓는다. 미디어 녹음을 통해 모니터링해야 배지의 pH 표시기 (페놀 레드)와 색상을 포함합니다. 산소와 pH는 7.3-7.4이어야하며 붉은 색에 해당합니다. </li><li> 를 달성하기 위해 micropipette의 풀러 (모형 PP-830 Narishige, 일본)에 :; 두 단계 프로토콜 (50 열 2 단 72 열 1 단계)를 사용하여 1.5 mm (1.19 mm의 ID) 붕규산 유리에서 녹음 피펫을 준비 MΩ 3-4의 마지막 임피던스. </li><li> MgCl 2 (mm 단위) 110 KF, 12 KCl을 27 KOH 1, 염화나트륨, 10 HEPES, 10 EGTA, 1.8가 포함 된 칼륨 불소 기반의 내부 용액 3-4 mm 인 피펫의 정강이를 기입3 D-포도당과 2 NA-ATP, KOH로 pH를 7.4. </li><li> 멀리 아래로 전극을 절연 및 피펫 용량을 줄이기 위해 파라 필름 (parafilm)의 얇은 스트립 가능한 팁 피펫 2 ~ 3 배의 정강이를 래핑합니다. </li><li> 직립 현미경 (올림푸스 BX51)의 낮은 전력 배율 (배)에서 감각 상피에 피펫을 놓습니다. 높은 전력 (40X)로 전환 연결된 CCD 카메라로 개인의 전정 유모 세포를 시각화. </li><li> micromanipulator에 (셔터 악기, 캘리포니아, USA)를 사용하여 시각화 머리 세포 (그림 3C)의 막에 위치 피펫. 기가 옴 씰이 달성되면, 파열 피펫 홀더 흡입 포트를 통해 적용 부정적인 압력의 작은 양의 세포막. </li><li> 표준 기술 8-9를 사용하여 전체 셀 전압 클램프 녹음을합니다. </li></ol> 4. 두 광자 현미경 <ol><li> 5 mM의 오레곤 그린을 포함하는 0.9 % 생리 식염수를 준비488 BAPTA-1 (OGB-1, hexapotassium 소금, Invitrogen 사, 독일). </li><li> 감각 상피는 위의 방해임을 보장, 여전히 침수 동안 필터 종이의 작은 조각 (밀리 포아, 독일 4X4 mm, 두께 0.8 μm의)에 &quot;드 지붕&quot;반 그대로 깡패 준비를 놓습니다. </li><li> 합성 칼슘의 5 밀리미터 솔루션의 추가로 5 μL와 필터 종이 준비 펄스 발생기와 광대역 앰프의 조합으로 이루어진 electroporator의 염분 적용 기본 백금 전극 (7 μL) 위에, 그리고 덮개를 전송 표시 염료 오레곤 그린 488 BAPTA-1 (그림 4). </li></ol><img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig4.jpg" /> 그림 4. 대량의 electroporation. A. 회로도 일렉트로 구성의 단면을 표시합니다. 준 그대로 준비 (*)는 칼슘 DY에 몰두 필터 종이에 배치됩니다E (오레곤 그린 488 BAPTA-1)과 전류는 2 백금 전극 사이에인가. Briggman 오일러 2011 년 10에서 적응. <ol start="4"><li> 오레곤 그린 488 BAPTA-1 용액을 만들어 접촉 할 때 준비의 방향을 방해하지 않도록주의, 대략 2 mm의 거리에서베이스 전극 위에 백금 전극과 평행을 가져온다. </li><li> 10-11, 준비 (+13 V, 10 밀리 초 펄스 폭, 1 Hz의 주파수, 10 방형 파 펄스 전류에 대한 매개 변수)를 통해 짧은 전류 펄스를 전달합니다. </li><li> L-15 배지로 가득 유리 바닥 녹음 챔버의 바닥에, 다시 감각 상피 위에서 방해 것을 보장 그것에 실리콘 오일 및 위치 반 그대로 준비의 작은 덩어​​리를 놓습니다. (포인트 2.13 참조) 위에서 설명한대로 이미지를 통해 안정성을 보장하기 위해 준비에 나일론 격자를 교체합니다. </li><li> 두 광자 현미경을 사용하여 sponta의 광학 녹음을표준 영상 프로토콜에게 10-11를 사용하여 감각 상피 (그림 7)에서 neous 칼슘 활동. </li></ol>

<ol>
	<li>Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Otoferlin+is+critical+for+a+highly+sensitive+and+linear+calcium-dependent+exocytosis+at+vestibular+hair+cell+ribbon+synapses.">Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).</li><li>Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+pre-+and+post-synaptic+recording+from+the+peripheral+vestibular+calyx+and+its+included+type+I+hair+cell.">Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell.</a> , (2009).</li><li>Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+dependent+currents+in+type+I+and+II+hair+cell+and+calyx+terminals+of+primary+afferents+in+an+intact+in+vitro+mouse+vestibular+crista+preparation.">Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation.</a> , (2009).</li><li>Chatlani, S., Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+recordings+from+calyx+endings+in+the+turtle+posterior+crista.">Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista.</a> , (2010).</li><li>Songer, J. E., Eatock, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+in+the+mammalian+saccule.">Transduction in the mammalian saccule.</a> , (2010).</li><li>Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vestibular+primary+afferent+activity+in+an+in+vitro+preparation+of+the+mouse+inner+ear.">Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear.</a> J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).</li><li>Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+accumulation+between+type+I+hair+cells+and+calyx+terminals+in+mouse+crista.">Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista.</a> Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).</li><li>Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+synaptic+transmission+differs+in+mouse+type+A+and+B+medial+vestibular+nucleus+neurons+in+vitro.">Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro.</a> J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).</li><li>Camp, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+glycine+receptor+function+reduces+excitability+of+mouse+medial+vestibular+nucleus+neurons.">Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons.</a> Neuroscience. 170, 348-360 (2010).</li><li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina.">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).</li><li>Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+specificity+in+the+direction-selectivity+circuit+of+the+retina.">Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina.</a> Nature. 471, 183-188 (2011).</li><li>Rennie, K. J., Streeter, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+currents+in+isolated+vestibular+afferent+calyx+terminals.">Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals.</a> J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).</li><li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+voltage-+and+ion-dependent+conductances+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog,+Rana+catesbeiana.">Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> J. Physiol. 400, 237-274 (1988).</li><li>Rennie, K. J., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+currents+in+isolated+vestibular+hair+cells+from+the+guinea-pig+crista+ampullaris.">Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris.</a> Hear. Res. 51, 279-291 (1991).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

균형 우리의 감각을 기본 메커니즘은 다른 감각 시스템에 비해 제한적인 주목을 받고 있고, 시각 및 청각 시스템을 예를 들어. 전정이나 균형 기능의 변화를 연구 한 연구의 대부분은 밸런스 전정 유모 세포 자체의 기본적인 빌딩 블록의 불완전한 지식, 전정 안구 반사 등의 행동 조치에 초점을 맞추고있다. 자신의 네이티브 환경에서 제거 심하게 격리 된 머리 세포를 사용하므로 유모 세포...

우리의 일상 생활에 전정의 큰 공헌에도 불구하고, 나이 전정 기능 관찰 하락에 대한 책임 프로세스의 명확한 이해가 어려운 남아있다. 지식이 부족 한 이유는 전정 기능이 저하 거의 독점적으로 전정 안구 반사 (VOR), 외적 전정 기능의 정확한 지표 등 행동 분석을 사용하여 탐구되었습니다,하지만 본질적인 구성 요소의 변경에 제한 통찰력을 제공합니다 . 이 건강, 질병 또는 노화 전정 헤어 세포 기능에 대한 우리의 이해에 큰 장애물이다. 각각의 전정 유모 세포의 많은 연구가되어 있지만, 주요 단점은 머리카락 세포와도 꽃받침 성의 터미널은 기계적 및 / 또는 효소 처리를 통해 정상적인 환경에서 제거됩니다 급성 머리 세포 준비에 의존하고있다. 이러한 접근 방식의 필연적BLY 머리 세포와 꽃받침, 헤어 세포와지지 세포 사이의 섬세한 마이크로 아키텍처를 중단. 준 그대로 준비 1-5, 그리고 고립 된 마우스 미로 준비 6의 발달과 함께, 더 밀접하게 생체 내에서 이러한 닮은 상태에서 시냅스 통신의 다양한 형태를 연구 할 수있는 기회가 지금있다. 실제로 임 하였다. (2011) I 전정 유모 세포가 neuroepithelium 내에 포함 된 유지하는 사람에 비해 심하게 고립 된 형식에서 기록 된 전체 셀 전류에 표시된 차이를 보였다. 특히 칼륨은 머리 세포 성의 꽃받침 사이 간 공간에 축적 생각하고, 크게 머리 세포 반응 7 변경합니다. 이러한 유형의 정보는 여기에 설명 된 전정 감각 상피의 반 그대로 준비없이 취득하는 것은 불가능합니다. 우리는 마우스 crista 3 반 그대로 준비를 보여줍니다, 및 전체 세포 패치 전기 생리학에서 얻은 대표적인 결과, 두 광자 칼슘 이미징을 보여줍니다.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Leibovitz medium L-15</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>L4386-10X1L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BAPTA-1-oregon green</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>O6806 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereo microscope</td>
 <td>Leica Microsystems</td>
 <td>A60S</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Upright microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>BX51WI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Two-photon microscope</td>
 <td>Olympus/La Vision</td>
 <td>BX51WI/ TriMScope II</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont #5 SF Forceps</td>
 <td>FST</td>
 <td>11252-00</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Friedman-Pearson Rongeurs</td>
 <td>FST</td>
 <td>16221-14</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Standard Pattern Scissors</td>
 <td>FST</td>
 <td>14001-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>InstraTECH A-D converter</td>
 <td>HEKA</td>
 <td>ITC-18</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sutter Micromanipulator</td>
 <td>Sutter</td>
 <td>MP-225/M</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>multiclamp amplifier</td>
 <td>Axon Instruments</td>
 <td>700B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Data acquisition software (electrophysiology)</td>
 <td>Axograph</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imspector Data acquisition software (two-photon)</td>
 <td>Max Planck innovation</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

an isolated semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium for electrophysiology and high-resolution two-photon microscopy

이해 전정 유모 세포가 정상 조건 하에서 작동하는 방법이나 외상, 질병,이 기능을 방해 노화가 예방 방법 및 / 또는 새로운 치료 전략의 개발에 중요한 단계입니다. 그러나 비정상적인 전정 기능을 찾고 연구의 대부분은 세포 수준에서하고 있지만, 주로 보행 분석과 전정 안구 반사 성능과 같은 전정 기능 장애의 행동 분석에 집중하지 않았습니다. 이 작품은 일이 잘못 갈 때 일어나는에 대한 귀중한 데이터를 굴복하면서, 약간의 정보는 장애의 근본 원인에 대한 수집하고 있습니다. 전정 기능의 기초가 세포와 세포 내 프로세스에 집중하는 연구의 대부분은 시냅스 연결 및 지원 세포 환경의 결여 심하게 고립 된 유모 세포에 의존했다. 따라서 중요한 기술적 과제 준비에 절묘하게 맞는 전정 유모 세포에 액세스 할 수있다aration은 최소한 생리 학적, 중단됩니다. 여기에서 우리는 헤어 셀 / 기본 심성 단지 등 지역의 미세 환경을 유지 마우스 전정 감각 상피의 반 그대로 준비를 보여줍니다.

전정 유모 세포의 전기 생리학 속성들은 7 포함하는 내 복잡한 마이크로 아키텍처에 따라 다릅니다. 반 그대로 전정 상피 준비가 유형을 구별하는 데 사용할 수 있습니다 그림 5를 보여줍니다 I 유모 세포 (그림 5A), II 형 유모 세포 (그림 5B), 그리고 꽃받침 기본 심성 (그림 5C) 특징 전체 세포의 컨덕턴스에 따라. 이러한 특성은 탈분극하는 ...

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An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

전정 헤어 세포 기능의 분석은 두개골, 추체 측두골의 가장 어려운 부분 깊은 곳의 위치가 복잡합니다. 대부분의 기능 모발 세포 연구는 심하게 고립 된 유모 세포를 사용했습니다. 여기에서 우리는 전기 생리학 및 2 광자 현미경 연구를위한 마우스 전정 상피 세포의 반 그대로 준비에 대해 설명합니다.

전기 생리학 및 고해상도 두 광자 현미경을위한 마우스 전정 감각 상피의 격리 된 세미 그대로 준비

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

an-isolated-semi-intact-preparation-mouse-vestibular-sensory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.8K 조회수.  University of Sydney. 전정 헤어 세포 기능의 분석은 두개골, 추체 측두골의 가장 어려운 부분 깊은 곳의 위치가 복잡합니다. 대부분의 기능 모발 세포 연구는 심하게 고립 된 유모 세포를 사용했습니다. 여기에서 우리는 전기 생리학 및 2 광자 현미경 연구를위한 마우스 전정 상피 세포의 반 그대로 준비에 대해 설명합니다.

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In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

두 광자 현미경을 사용하여 마우스 척수의 생체내 이미징에

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

연구

신경과학

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

피부와 사지 본즈 Innervating 마우스 감각 신경 섬유의 조직 준비 및 Immunostaining

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls gastrointestinal motility. A procedure for the isolation and culture of a mixed population of neurons and glia from the myenteric plexus is described. The primary cultures can be maintained for over 7 days, with connections developing among the neurons and glia. The longitudinal muscle strip with the attached myenteric plexus is stripped from the underlying circular muscle of the mouse ileum or colon and subjected to enzymatic digestion. In sterile conditions, the isolated neuronal and glia population are preserved within the pellet following centrifugation and plated on coverslips. Within 24-48 hr, neurite outgrowth occurs and neurons can be identified by pan-neuronal markers. After two days in culture, isolated neurons fire action potentials as observed by patch clamp studies. Furthermore, enteric glia can also be identified by GFAP staining. A network of neurons and glia in close apposition forms within 5 - 7 days. Enteric neurons can be individually and directly studied using methods such as immunohistochemistry, electrophysiology, calcium imaging, and single-cell PCR. Furthermore, this procedure can be performed in genetically modified animals. This methodology is simple to perform and inexpensive. Overall, this protocol exposes the components of the enteric nervous system in an easily manipulated manner so that we may better discover the functionality of the ENS in normal and disease states.

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

<em&gt; 체외</em성인 마우스 Myenteric 신경총에서 분리 된 장내 뉴런과 교세포의&gt; 준비

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

피부의 단일 신경 종말의 생체 두 광자 현미경에서

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

마우스 척수의 세포 역학의 두 광자 이미징

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

HIV 유도 된 신경 염증의 마우스 모델에서 이광자 현미경을 사용하여 뇌 혈관 구조의 정량

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog (Rana catesbeiana)

The study of hearing and balance rests upon insights drawn from biophysical studies of model systems. One such model, the sacculus of the American bullfrog, has become a mainstay of auditory and vestibular research. Studies of this organ have revealed how sensory cells hair can actively detect signals from the environment. Because of these studies, we now better understand the mechanical gating and localization of a hair cell&#39;s transduction channels, calcium&#39;s role in mechanical adaptation, and the identity of hair cell currents. This highly accessible organ continues to provide insight into the workings of hair cells. Here we describe the preparation of the bullfrog&#39;s sacculus for biophysical studies on its hair cells. We include the complete dissection procedure and provide specific protocols for the preparation of the sacculus in specific contexts. We additionally include representative results using this preparation, including the calculation of a hair bundle&#39;s instantaneous force-displacement relation and measurement of a bundle&#39;s spontaneous oscillation.

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog Rana catesbeiana

The American bullfrog&#39;s (Rana catesbeiana) sacculus permits direct examination of hair-cell physiology. Here the dissection and preparation of the bullfrog&#39;s sacculus for biophysical studies is described. We show representative experiments from these hair cells, including the calculation of a bundle&#39;s force-displacement relation and measurement of its unforced motion.

미국 황소 개구리의 Sacculus (헤어 세포의 생리 준비<em&gt; 모이 catesbeiana</em&gt;)

The study of hearing and balance rests upon insights drawn from biophysical studies of model systems. One such model, the sacculus of the American ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Vivo에서 신생아 쥐에 있는 대뇌 피 질의 뉴런의 두 광자 영상

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...