BBSRC에서 자금 조달이 친절하게 인정 (허가 번호 BB H011293 / 1).

개요 제 1 반응은 pH가 나노 센서와 SEM을 이용하여 형광 분석법 및 사이즈를 이용하여 pH를 행 나노 센서 응답의 특성화의 제조를 설명한다. 2 장에서는 전기 방사 된 고분자 지지체 및 SEM을 사용하여 형태와 크기의 특성의 준비에 대해 설명합니다. 섹션 2는 pH가 반응 나노 센서의 포함과 함께 전기 방사 공중 발판 자기보​​고 지지체의 제조 방법을 설명합니다. 그 결과 자기보고 발판은 전기 방사 섬유의 모든 형태 학적 변화가 발생했는지 여부를 평가하기 위해 SEM을 특징으로한다. 통합 된 나노 센서에서 발생하는 자기보고 발판에서 형광 공 초점 현미경에 의해 평가된다. 3 장에서는 전기 방사 비계와 자기보고 지지체에 세포의 문화를 설명합니다. 발판은 먼저 프레파라트에 멸균비계는 살균과 세포의 문화가 자기보고 비계의 형광 기능에 영향을 미치는 여부를 결정하기 위해 평가하는 세포 배양 다음에 대한 이온. 프로토콜은 전기 방사 지지체에 배양하는 세포에 나노 센서의 전달을 설명합니다. Lysotracker 염료는 나노 센서는 휴대 산성 구획으로 수행되지 않았 음을 확인하는 데 사용됩니다. 1. 준비 및 산도 응답 졸 - 겔 나노 센서의 분석 산도 응답 졸 - 겔 나노 센서의 1.1 준비 참고 :이 준비 흄 후드에서 수행해야합니다. <ol><li> (및-6) - 카르복시, 숙신 에스테르 디메틸 포름 아미드 (FAM-SE) (1.5 mg)을 (DMF) (1 ㎖) 라운드 플라스크와 6 carboxytetramethylrhodamine을 바닥 - 5를 용해하여 pH를 나노 센서 내에서 사용하기 위해 형광 준비 또 다른 라운드에서 숙신 에스테르 DMF에 (TAMRA-SE) (1.5 mg)을 (1 ㎖) 바닥 플라스크.각 플라스크에 3 - 아미노 프로필 트리에 톡시 실란 (APTES) (1.5 mL)을 추가하고 어둠 속에서 24 시간 동안 건조 질소 분위기 (21 ° C)에서 교반 즉 호일 샘플을 감싸줍니다. </li><li> 둥근 바닥 플라스크에 포함 된 에탄올의 혼합물 (6 ㎖)과 수산화 암모늄 (30 중량 %, 4 ㎖)에 위의 염료 (250 μL)의 양을 추가하고 1 시간 (21 ° C)에 저어. </li><li> 천천히 추가로 2 시간 동안 교반 계속 혼합물에 테트라 에틸 오르토 실리케이트 (TEOS) (0.5 ㎖)를 추가합니다. 혼합물 흐린 켜집니다. 나노 센서는 회전 증발에 의해 수집 될 수 있습니다. 나노 센서는 향후 사용을 위해 4 ℃로 유리 바이알에 저장 될 수있다. 주의 : 자신의 마른 형태의 나노 센서의 추가 처리가 연기 후드 또는 균형 Weighsafe 예를 들면, 묶어야합니다 그 무게의 경우 수행해야합니다. </li></ol> pH가 1.2 나노 센서 응답 <ol><li> 믹시에 의해 산도 5.5-8.0에 이르기까지 Sørensen의의 인산염 완충 용액을 준비나트륨 인산 (0.2 M) 및 제 2 인산 나트륨 (0.2 M) 스톡 용액 NG 특정 비율. pH 미터를 사용하여 최종 pH를 확인합니다. 수산화 나트륨 (NaOH를) (4 M) 또는 염산 (HCL) (2 M)를 사용하여 산도에 대한 약간의 조정을합니다. </li><li> 이 솔루션은 흐린 될 때까지 먼저 다음 초음파 세척기에서 선박을 잠수 3 분의 소용돌이에 나노 센서 솔루션을 포함하는 용기를 개최하여 pH를 버퍼 (5 ㎎ / ㎖)의 산도 나노 센서를 일시 중단 (약 5 분). 완전히 용액에 나노 센서를 일시 중단이 단계를 반복합니다. </li><li> 광 베트로 최초의 솔루션을 놓고 5에 488 ㎚의 여기 파장을 사용 - (및-6) - 카르복시 (FAM)와 6 carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) 568 nm의. FAM과 TAMRA는 형광 분광계를 사용하는 558-580 nm의에 대한 500-530 nm의 방출 파장을 수집합니다. </li><li> pH가 다른 pH에서 관찰 할 수 있도록 광 큐벳에서 해법을 변경 및 C를 계속발광 스펙트럼을 ollecting. </li><li> 교정 곡선을 생성하기 위하여 각각의 pH 값에서 생성 발광 최대 값의 비율을 계산한다. </li></ol> 나노 센서의 1.3 SEM <ol><li> 탄소 코팅 전자 현미경 스텁에 나노 센서의 샘플을 놓고 아르곤 분위기에서 5 분 동안 금으로 코팅 스퍼터. </li><li> 주사 전자 현미경 (SEM)으로 관찰한다. 전자 충전 (그림 1)을 최소화하기 위해 작동 거리, 전압 및 배율을 조정 이미징 동안. </li></ol> 2. PLGA 발판의 준비 및 분석 2.1 전기 방사 PLGA 발판 <ol><li> 흄 후드에서 폴리 피리 디늄 메이트와 디클로로 메탄 (락트산 - 코 - 글리콜 산) (PLGA) (DCM) (20 % (w / w)) (PF) (1 % (W / W))를 녹입니다. 18 G 무딘 채우기 바늘과 주사기 펌프에 안전하게 적합으로 10 ML의 주사기로 솔루션을 놓습니다. </li><li> 거리를 20 cm (20)의 바늘 끝 거리cm X 15cm 알루미늄 포집 판. </li><li> 알루미늄 집 전판에 주사기 지구의 선단부에 고전압 전원 장치의 전극을 부착. 주의 : 관리는 높은 전압 즉, 항상 전기 방사 장비 중 하나를 처리하기 전에 전기 공급을 끄고 사용주의해야한다. </li><li> 2 시간 동안 12 kV의에 3.5 m / h의 일정한 유속을 이용하여 솔루션을 제공. 이러한 조건을 사용하여 전기 방사는 약 60 ㎛의 발판 깊이를 제공 할 것입니다. </li><li> 용매 잔류 물이 증발 할 수 있도록 24 시간 동안 흄 후드의 발판을 남겨주세요. </li></ol> 2.2 전기 방사의 pH 응답 PLGA 발판 <ol><li> 섹션 2.1에 있지만 고분자 용액 (5 ㎎ / ㎖)에 나노 센서를 추가로 수정 한 바와 같이 pH를 응답하여 나노 센서를 통합 발판을 준비한다. 초음파의 도움을 PLGA 솔루션의 나노 센서를 일시 중단 (약 5 분) 이전<html> 10 ML의 주사기에 배치합니다. </li></ol> 2.3 PLGA 비계의 SEM과의 pH 응답 비계 <ol><li> 탄소 코팅 전자 현미경 스텁에 PLGA 지지체 또는 산도 반응 발판의 샘플을 놓고 나노 센서의 SEM (그림 1)에 설명 된대로 진행합니다. </li></ol> 산도 응답 비계의 2.4 교정 <ol><li> 35mm 배양 접시에 산도 반응 발판의 샘플을 놓고 적절한 완충 용액에 담그지. </li><li> 공 초점 현미경에 나노 센서 내에서 TAMRA을 자극하는 FAM과 568 nm의 크립톤 레이저를 자극하는 488 nm의 아르곤 레이저를 사용합니다. FAM과 TAMRA에 대한 558-580 nm의에 대한 500-530 nm에서의 pH 반응 발판의 형광 방출을 관찰합니다. (그림 2). 여기 파장의 수집을 방지하기 위해 순차적 인 검색을 사용합니다. </li></ol> 3. PLGA 발판과의 pH 응답 PLGA 발판에 따라 세포 배양 ntent &quot;&gt; 주 : 다음은 세포 배양 캐비닛에서 수행되어야한다. 세포 배양을위한 PLGA 발판 3.1 준비 <ol><li> 2cm 2 조각으로 PLGA 또는 산도 반응 PLGA 지지체를 잘라. </li><li> 15 분 각면 8 cm의 거리에서 자외선 (UV) 빛을 조사하여 발판을 소독. </li><li> 12 잘 문화 판에 발판을 전송하고 상단에 스틸 링을 배치합니다. (5 % V / V) 내부에 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)와 스틸 링 밖에서 밤새 품어 페니실린 / 스트렙토 마이신의 솔루션을 추가 (37 ° C, 5 % CO 2). 2cm 외부 직경 1cm 내부 직경 1 cm 깊이 : 강철 반지는 노팅엄 대학에서 제조 다음과 같은 차원이되었다합니다. </li><li> 살균 용액을 제거하고 PBS로 세척. </li><li> (500 μL) 및 외부 (500 μL) 스틸 링, 인큐베이터에있는 곳 (37 ° C, 5 % CO 2 내부에 세포 배양 배지를 추가 </서브&gt;) 세포 현탁액을 준비하는 동안. </li><li> 세포 현탁액을 준비하고 트리 판 블루 배제 분석을 사용하여 세포 수를 수행합니다. </li><li> 1 × 106 세포 / ml의 세포 수를 달성하기 위해 세포 현탁액을 만들기. </li><li> 스틸 링의 내부와 외부에서 용지를 제거합니다. </li><li> 스틸 링 (1 평방 미터)의 외부에 데워진 세포 배양 배지로 교체하십시오. </li><li> 스틸 링의 내부에 세포 현탁액 300 μl를 추가합니다 - 바위 플레이트 앞뒤로 부드럽게 세포를 배포합니다. </li><li> 인큐베이터로 세포 배양 접시를 놓고 (37 ° C, 5 % CO 2) - 2-3 일마다 미디어를 새로 고침 - 세포 부착 그러나 한 실험이 필요로에 대한 문화를 계속, 24 시간 내 자리를 차지한다. </li></ol> PLGA 비계에 배양 된 세포에 3.2 나노 센서 납품 <ol><li> 3.1 절에 설명 된대로 PLGA 지지체 위에 종자 세포. 이 연구 빈 PLGA 지지체 (하지 contai에 대한이미징 때 닝 나노 센서가)에 의한 형광 방출의 중첩에 사용되었다. </li><li> (37 ° C, 5 % CO 2) 72 시간 동안 세포 전달 나노 센서하기 전에 발판에 걸쳐 성장하고 마이그레이션 할 수 있도록 인큐베이터로 세포 시드 발판을 놓으십시오. </li><li> 배달 나노 센서에 앞서 1 시간 (37 ° C, 5 % CO 2) 배양, PBS로 세포를 씻어 표준 배지에서 항생제 및 혈청 무료 미디어에 미디어를 변경합니다. 참고 : 3T3 세포에 대한 표준 배지는 소 태아 혈청 (10 % (V / V)), L-글루타민 용액 (2 ㎜), 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보충 둘 베코의 수정 된 이글 매체의 구성 (1 % (V / V)) . </li><li> 배양 기간 동안 간단히 솔루션 A.을 만들 티멤 (50 μL)와 나노 센서 (5 mg)을 초음파 처리하여 나노 센서 - 리포좀 복합체를 제조 </li><li> 티멤 (45 μL)에 리포 펙 타민 2000 (5 μL)를 추가하여 용액 B를 만들고 5 분 실온에서 알을 품다. </li><li> 솔루션 추가용액 B에, 나노 센서 - 리포좀 복잡한 솔루션 C를 형성하기 위해 20 분 동안 실온에서 품어. </li><li> 세포에 용액 C (100 μL)를 첨가하고 3 시간 동안 (37 ° C, 5 % CO 2) 배양. </li><li> 인큐베이터, 대기음 미디어에서 셀 시드 발판을 제거하고 공 초점 현미경으로 살아있는 세포의 시각화를 허용하는 PBS (1 ㎖)를 추가하기 전에 PBS로 두 번 세척한다. 참고 : 다른 pH에서 보정이 수행되고 있었기 때문에 세포 배양 배지에 존재하는 페놀 빨간색 표시도 자기 형광을 일으킬하지 않고되도록 PBS는이 프로토콜에 사용되었다. 그러나 페놀 레드 무료 미디어는 세포 배양의 장기 분석을 위해 사용될 수 있습니다. </li><li> 다른 pH를 버퍼에 셀 시드 발판을 담그고 세포와 관련된 나노 센서의 반응을 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 공 초점 현미경 (Figu를 사용하여 형광을 관찰함으로써 및 TAMRA FAM에서 형광 농도의 비율을 결정함으로써 피를 모니터링다시 3). </li></ol> 포유 동물 세포 내에서 3.3 나노 센서 위치 <ol><li> 로 3.2의 설명 FAM 염료 (TAMRA의 형광 방출이 LysoTracker 레드와 같은 스펙트럼 영역에 있기 때문입니다)를 포함하는 나노 센서와 세포를 품어. 1.1 절에 있지만, 준비하고 TAMRA를 추가 생략하여 설명한 바와 같이 이러한 나노 센서를 준비합니다. </li><li> 나노 센서의 납품 기간에 따라 50 nm의 LysoTracker 레드 원액을 희석. </li><li> PLGA 인공 지지체에 배양 세포에 희석 용액 (2 μL)의 분취 량을 추가합니다. </li><li> 1 시간 (37 ° C에서 5 % CO 2)에 LysoTracker 레드와 세포를 품어. </li><li> 배양 기간에 따라 용지를 제거하고 공 초점 현미경을 사용하여보기위한 준비 (산도 7.4) (2 ㎖) PBS에 미디어를 변경하기 전에 PBS (산도 7.4)로 두 번 세포를 씻으십시오. 주 : 페놀 레드 무료 미디어 대신 PBS로 사용할 수 있습니다. </li><li> 핵 얼룩 드라 추가PBS에 Q5 그래서 최종 농도는 5 μM과 3 분 (37 ° C 5 % CO 2)의 세포 배양이다. 그것은 DRAQ5와 잠복기 다음 용지를 변경할 필요가 없다. </li><li> 650 만 나노 센서 DRAQ5 발색단을 흥분과 500-530 nm의 580-600 nm에서 형광을 관찰 할 수 LysoTracker 레드와 633 nm의 헬륨 / 네온 레이저를 자극 할 수있는 568 nm의 크립톤 레이저를 FAM을 자극하는 488 nm의 아르곤 레이저를 사용하여 -750 (그림 3) 각각 nm의. 여기 파장의 수집을 방지하기 위해 순차적 인 검색을 사용합니다. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

조직 공학은 특정 조직이나 기관의 기능을 수리, 교체, 유지 또는 향상시키기 위해 생체 조직 모델과 같은 생체 조직 대체 요법에 모두로 사용할 수있는 생물학적 대체를 만드는 목표로. 몇 년 교체하거나 조직의 원조 수리 그러나이 자주 인해 궁극적으로 거부하거나 추가 재수술에 이르게 호스트 조직 및 / 또는 감염, 가난한 통합에 실패하는 합성 대체가 사용되었습니다. 주입 이전...

조직 공학의 주요 전략은 형태는 교체 예정의 조직과 유사하며 세포 성장 및 1,2 함수를 지원할 수 지지체를 제조하는 생체 적합성 물질의 사용이다. 비계는 세포 부착 및 증식이 아직 3 차원 세포 구조의 틈새를 통해 세포 이동을 할 수 있도록하여 기계적인 지원을 제공합니다. 비계는 세포의 영양분의 질량 수송을 허용하고 신진 대사 폐기물 3의 제거를 방해하지 않아야합니다. 전기 방사는 세포 성장의 4-6 지원할 수있는 고분자 지지체의 제조를위한 유망한 방법으로 떠오르고있다. 그들은 종종 다공성이며 3D 셀룰러 구조 (7)의 간극을 통하여 세포 - 세포 상호 작용뿐만 아니라 세포 이동을 허용로서 생성 부직포 전기 방사 섬유 세포 성장에 적합하다. 그것은 t 중에 세포 생존을 모니터링하는 것이 중요그는 문화의 기간 및 그 세포 생존을 보장하기는 3D 구조의 전체에 걸쳐 유지된다. 분석 농도 구배가 3D 구문에 존재할 수있는 예를 들어, 이러한 산소와 pH가 배양 조건, 조심 제어를 필요로합니다. 생물 반응기 또는 관류 시스템은 격자 간 흐름의 생체 내 조건에서 결과적 증가 영양소 입금 및 대사 폐기물 제거 8로 모방하기 위해 사용될 수있다. 이러한 시스템은 일정한 미세 환경 조건을 보장하는지 여부의 질문에 실시간으로 셀룰러 미시를 평가함으로써 해결 될 수있다. 실시간으로 모니터링 할 수있는 키 미시 메트릭은 다음을 포함한다 : 온도, 셀 매체의 화학적 조성, 용존 산소와 이산화탄소의 농도, 산도, 다습. 이러한 메트릭, 온도가 가장 쉽게 현장 프로브에 사용하여 모니터링 할 수 있습니다. 일반적으로 잔존 나열된 메트릭을 모니터링하기위한 방법따라서 volve 샘플링에 대한 나누어지는 제거하고 세포 배양을 방해하고 오염의 위험을 증가시킨다. 연속, 실시간 방법이 모색되고있다. 현재 모니터링 방법은 일반적으로 물리적으로 pH를 모니터 또는 산소 프로브와 같은 세포 구조를 조사 악기에 의존한다. 그러나 이러한 침입 방법은 세포 구조를 손상 지속적인 실험을 방해 할 수 있습니다. 3D 구조 내에서 분석 농도의 비 침습적 모니터링은 영양 고갈 9 등 다양한 환경 적 측면의 실시간 모니터링을 가능하게 할 수 있습니다. 이 구조 내에서 깊은 지역에 영양 공급의 평가를 허용하고 신진 대사 폐기물을 효과적으로 10,11 제거되는 여부를 결정하는 것입니다. 침입의 문제를 해결하기위한 시도 시스템은 일반적으로 pH가, 산소를 모니터링하고 12 포도당 배양 용기 모두를 통해 외부 센서에 배양액을 통과 관류 챔버의 사용을 수반한다.드레 직접 샘플링 분취 액의 제거를 필요로하지 않고 같은 시츄 모니터링에 제공 할 배양 용기에 통합 될 수있는 센서의 개발에 대한 관심이 높아지고있다. 현장과 우리가 자기보고 발판 (13)을 생성하는 전기 방사의 발판으로 분석 반응하는 나노 센서를 통합 한 미세 환경 조건의 비 침습적 모니터링에 대한 이러한 단점을 해결하기 위해. 감지 장치는 전기 방사에 의해 또는 종래 골격 형성 14,15로 중합체에 혼입된다 분석 반응 염료의 사용을 통해 생성 된 실제 고분자 지지체 하나 어디에 형광 활성을 모니터링함으로써 같은 촬상 장치의 역할을 지지체는, 미리 제조 된 . 그러나, 이러한 촬상 장치는 다른 분석에서 가능한 간섭으로 인한 잘못된 광 출력을 줄 가능성이있다. 비율 적 감지 장치 스와의 사용설명 된 프로토콜에서 제조 된 것과 같은 채널이 가능한 부작용을 제거하고 해당 분석 물에 대한 특정 응답을 제공하는 잠재력을 보유하고있다. 여기에 제시된 전기 방사의 발판이로 인해 선택, 합성 공중 합체 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) (PLGA)로부터 제조 된 식품의 약국의 생분해 성 및 생체 특성으로 인해 관리 (FDA) 승인 및 추적하는 데 다양한 세포 유형 16-18의 성장 및 기능을 지원하는 기록. 제조 된 비율 계량 분석 응답 나노 센서는 산도에 반응합니다. 나노 센서가 하나의 염료, FAM은 산도에 응답하고, 다른 생체 적합성 인 졸 - 겔 매트릭스로 두 형광 염료를 통합, TAMRA는 산도에 응답 아니므로 내부 표준으로서 작용한다. 그들은 크게 겹치지 않는 더욱이 TAMRA FAM 및 양쪽의 형광 별도로 분석 할 수있다. 형광 EMI의 비율을 결정특정 파장에서 두 염료 (투약) 소지는 다른 환경 조건의 독립의 pH 응답을 제공합니다. 자기보고 비계가 개발 한 3D 모델을 방해하지 않고 현장에서 실시간으로 pH를 반복 평가를 허용 할 수 있습니다. 우리는이 지지체는 세포 부착 및 증식을 지원할 수있는 문제의 분석에 응답하여 남아 있는지 보여 주었다. 설계 구조의 부산물 산성의 반응 속도는 understudied 아르 유지와 같은 산도 반응 발판을 사용하여 크게 이러한 연구 19을 용이하게 할 수 있습니다. 또한, 조직 공학 응용 프로그램에 대한 자기보고 발판의 사용 기회를 완전히 이해 모니터와 체외에서 3D 모델의 조직 구조의 성장, 비 침습적으로 실시간으로 최적화를을 제공합니다. 산도 반응 나노 센서는 전기 방사 PLGA의 scaffol에 따라 배양 섬유 아세포의 세포 내 환경에 배달 된DS. 염료의 형광 발광의 비율은 피를 모니터링하는 데 사용하고 자기보고 골격 도입 산도 나노 센서에 비교 하​​였다. 3D 환경에서 배양 된 세포에 나노 센서의 배송이 깊은 비파괴 방식으로 구문에 분석 농도의 모니터링을 가능하게 할 수 있습니다. 따라서 나노 센서 비파괴 3D를 통해 세포 행동을 평가하기 위해 실행 가능한 이미징 도구 장기 분석을 허용 생성 할 수있다. 3D 구조 내의 개별 세포의 분석 농도를 선별가 충분한 영양과 산소 농도를 받고있는 것을 확신 할 수있을 것입니다. 모니터링 프로세스 파라미터는 산소와 영양분의 효과적인 대량 수송을 위해 표준화 된 기술의 개발에 도움이 있었다. 세포 내 환경과 고분자 지지체에 나노 센서의 결합으로 나노 센서의 배송은 3 차원 CONST 내에서 세포 생존 능력의 평가뿐만 아니라 비계 성능을 허용하기 위해 결합 될 수있다조직 성장 프로세스 동안 ructs. 이것은 이러한 구조의 지식 증가로 이어질 생물학적으로 관련 조직 대체물의 제조를 진행 할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="481">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Ethanol</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:137px;">32221</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Anhydrous dimethylformamide (DMF)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">270547</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Ammonium hydroxide 50% (v/v) aqueous solution</td>
			<td style="width:71px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:137px;">35574</td>
			<td style="width:79px;">diluted to 30% (v/v) with pure water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">TEOS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">13190-3</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">A3648</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">5-(and-6)-carboxyfluorescein, succinimidyl ester (FAM-SE)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">C1311</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">6-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester (TAMRA-SE)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">C1171</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Sodium phosphate monobasic (0.2 M)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S-9638</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Sodium phosphate dibasic (0.2 M)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S-0876</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">NaOH</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S8045</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T4174</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">P0781</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">PBS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D8537</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">D6046</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">FBS</td>
			<td style="width:71px;">Source Bioscience</td>
			<td style="width:137px;">Batch-213-101992</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G7513</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">11668-019</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Optimem</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">11058-021</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">LysoTracker Red</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">L-7528</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Draq5</td>
			<td style="width:71px;">Biostatus Ltd</td>
			<td style="width:137px;">DR50050</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Nitrogen gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">DCM</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">320269</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">TFA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T6508</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="211">
			<td height="211" style="height:211px;width:195px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:71px;">Leica TCS-SP</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;">equipped with argon and krypton lasers and a 63X 0.9NA water immersion lens</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">UV light</td>
			<td style="width:71px;">UVLS28 UVP, USA</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Stirrer plate</td>
			<td style="width:71px;">SB161-3 Jencons-PLS</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">pH meter</td>
			<td style="width:71px;">Jenway model 3510</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Rotary Evaporator</td>
			<td style="width:71px;">Buchi Rotary Evaporator R200</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Centrifuge (nanosensors)</td>
			<td style="width:71px;">Hermle Z300</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:195px;">Centrifuge (cell culture)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Vortex</td>
			<td style="width:71px;">Whirlimixer Fisherbrand</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Ultrasonicator</td>
			<td style="width:71px;">FB11021 Fisherbrand</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Aluminum sheet</td>
			<td style="width:71px;">Nottingham University</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">35mm cell culture plate</td>
			<td style="width:71px;">Iwaki</td>
			<td style="width:137px;">3000035</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">10 ml syringe</td>
			<td style="width:71px;">Becton Dickenson</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">3T3 Fibroblast cells</td>
			<td style="width:71px;">European Collection of Cell Cultures</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">PLGA</td>
			<td style="width:71px;">Lakeshore Biomaterials</td>
			<td>7525 DLG 7E</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Pyridinium formate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P8535</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">HCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

self-reporting scaffolds for 3-dimensional cell culture

적절한 지지체에 3 차원 배양 세포는 더 생체 내 미세 환경을 모방 및 세포 - 세포 상호 작용을 증가하는 것으로 생각된다. 그 결과 3 차원 세포 구조는 종종 차원에서 연구와 유사한 실험을보다 분자 이벤트 및 세포 - 세포 상호 작용을 공부에 더 관련이있을 수 있습니다. 발판에 걸쳐 높은 세포 생존 능력과 효과적인 3D 문화를 만들려면 산소주의 깊게 분석 농도 구배로 제어 할 산도 필요로 배양 조건은 3 차원 구조 전반에 걸쳐있을 수 있습니다. 여기에서 우리는 많은 포유 동물 세포의 문화에 대한 자신의 이후의 준비와 함께 (락트산 - 코 - 글리콜 산) (PLGA) 전기 방사 발판으로 생체 적합성의 pH 반응 졸 - 겔 나노 센서 및 그 설립을 준비하는 방법을 설명합니다. 산도 반응 발판은 3 차원 세포 구조 내에서 미세 환경의 산도를 결정하는 도구로 사용할 수 있습니다. 또한, 세부에게 산도 반응 nanose의 전달을 우리성장 전기 방사 PLGA 지지체에 의해 지원되었다 포유 동물 세포의 세포 내 환경에 nsors. 산도 응답 나노 센서의 세포질 위치는 전진 동안 실험 세포 내 산도 (PHI)를 모니터링하는 데에 이용 될 수있다.

준비된 산도 응답 나노 센서의 크기 분포는 묘화 나노 센서의 인구가 측정 및 240-470 nm의 (도 1a)의 범위 내에서 나노 미터 크기를 갖는 것으로 하였다 SEM을 사용하여 분석되었다. 좁고 비교적 작은 직경의 과제는 나노 입자를 제조 Stöber 메서드를 사용과 일치한다. 그것은 산성 조건을 사용하여 제제가 입경 넓은 분산을 생성하는 반면 나노 입자 Stöber 방법을 사용하여 나노 입자의 합?...

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Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

생체의 pH 응답 졸 - 겔 나노 센서는 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) (PLGA) 전기 방사 지지체에 혼입 될 수있다. 생성 된 자기보고 지지체는 지지체에 세포를 배양하는 동안 미세 환경 조건 인 시츄 모니터링에 사용될 수있다. 3D 셀룰러 구조는 실험을 방해하지 않고 실시간으로 모니터링 할 수있는 이는 유익하다.

3 차원 세포 배양을위한 자기보고 발판

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.1K 조회수.  University of Nottingham.  생체의 pH 응답 졸 - 겔 나노 센서는 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) (PLGA) 전기 방사 지지체에 혼입 될 수있다. 생성 된 자기보고 지지체는 지지체에 세포를 배양하는 동안 미세 환경 조건 인 시츄 모니터링에 사용될 수있다. 3D 셀룰러 구조는 실험을 방해하지 않고 실시간으로 모니터링 할 수있는 이는 유익하다. 

비디오: Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Elastomeric PGS Scaffolds in Arterial Tissue Engineering

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.

Elastomeric PGS scaffolds with vascular smooth muscle cells cultured in a pulsatile flow bioreactor may lead to promising small-diameter arterial constructs with native ECM production in a relatively short culture period.

탄성 PGS는 아티 조직 공학 공사장 공중 발판

Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and ...

연구

생체공학

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

Proteolytically 분해 3 차원 시스템에서 난소 대과의 캡슐화 및 문화에 대한 방법

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent shape upon the application of a stimulus such as heat1-5. In a typical shape memory cycle, the SMP is first deformed at an elevated temperature that is higher than its transition temperature, Ttrans [either the melting temperature (Tm) or the glass transition temperature (Tg)]. The deformation is elastic in nature and mainly leads to a reduction in conformational entropy of the constituent network chains (following the rubber elasticity theory). The deformed SMP is then cooled to a temperature below its Ttrans while maintaining the external strain or stress constant. During cooling, the material transitions to a more rigid state (semi-crystalline or glassy), which kinetically traps or "freezes" the material in this low-entropy state leading to macroscopic shape fixing. Shape recovery is triggered by continuously heating the material through Ttrans under a stress-free (unconstrained) condition. By allowing the network chains (with regained mobility) to relax to their thermodynamically favored, maximal-entropy state, the material changes from the temporary shape to the permanent shape.
Cells are capable of surveying the mechanical properties of their surrounding environment6. The mechanisms through which mechanical interactions between cells and their physical environment control cell behavior are areas of active research. Substrates of defined topography have emerged as powerful tools in the investigation of these mechanisms. Mesoscale, microscale, and nanoscale patterns of substrate topography have been shown to direct cell alignment, cell adhesion, and cell traction forces7-14. These findings have underscored the potential for substrate topography to control and assay the mechanical interactions between cells and their physical environment during cell culture, but the substrates used to date have generally been passive and could not be programmed to change significantly during culture. This physical stasis has limited the potential of topographic substrates to control cells in culture.
Here, active cell culture (ACC) SMP substrates are introduced that employ surface shape memory to provide programmed control of substrate topography and deformation. These substrates demonstrate the ability to transition from a temporary grooved topography to a second, nearly flat memorized topography. This change in topography can be used to control cell behavior under standard cell culture conditions.

A method for developing cell culture substrates with the ability to change topography during culture is described. The method makes use of smart materials known as shape memory polymers that have the ability to memorize a permanent shape. This concept is adaptable to a wide range of materials and applications.

활성 세포 배양을위한 형상 기억 폴리머

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

Organotypic 콜라겐 I 분석 : 3 차원 컨텍스트에서 셀 행동을 평가하기 위해 가단 플랫폼

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

인간 세포 배양을위한 회전 세포 배양 시스템 : 모델로 인간 Trophoblast 셀

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

3D 섬유소의 준비는 줄기 세포 배양 용도 공사장 공중 발판

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

3 차원 자기 조립 펩티드 히드로겔에서 인간 신경 전구 세포의 배양

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer cartilage tissue offer a promising solution to repair articular cartilage. To select the optimal cell source for tissue repair, it is important to develop an appropriate culture platform to systematically examine the biological and biomechanical differences in the tissue-engineered cartilage by different cell sources. Here we applied a three-dimensional (3D) biomimetic hydrogel culture platform to systematically examine cartilage regeneration potential of juvenile, adult, and osteoarthritic (OA) chondrocytes. The 3D biomimetic hydrogel consisted of synthetic component poly(ethylene glycol) and bioactive component chondroitin sulfate, which provides a physiologically relevant microenvironment for in vitro culture of chondrocytes. In addition, the scaffold may be potentially used for cell delivery for cartilage repair in vivo. Cartilage tissue engineered in the scaffold can be evaluated using quantitative gene expression, immunofluorescence staining, biochemical assays, and mechanical testing. Utilizing these outcomes, we were able to characterize the differential regenerative potential of chondrocytes of varying age, both at the gene expression level and in the biochemical and biomechanical properties of the engineered cartilage tissue. The 3D culture model could be applied to investigate the molecular and functional differences among chondrocytes and progenitor cells from different stages of normal or aberrant development.

Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes.

관절 연골 세포 문화와 연골 생성을위한 3D 하이드로 겔 공사장 공중 발판

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model substrates for organ-scale tissue development. Sprague Dawley rat kidneys are cannulated by inserting a catheter into the renal artery and perfused with a series of low-concentration detergents (Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate (SDS)) over 26 hr to derive intact, whole-kidney scaffolds with intact perfusable vasculature, glomeruli, and renal tubules. Following decellularization, the renal scaffold is placed inside a custom-designed perfusion bioreactor vessel, and the catheterized renal artery is connected to a perfusion circuit consisting of: a peristaltic pump; tubing; and optional probes for pH, dissolved oxygen, and pressure. After sterilizing the scaffold with peracetic acid and ethanol, and balancing the pH (7.4), the kidney scaffold is prepared for seeding via perfusion of culture medium within a large-capacity incubator maintained at 37 &#176;C and 5% CO2. Forty million renal cortical tubular epithelial (RCTE) cells are injected through the renal artery, and rapidly perfused through the scaffold under high flow (25 ml/min) and pressure (~230 mmHg) for 15 min before reducing the flow to a physiological rate (4 ml/min). RCTE cells primarily populate the tubular ECM niche within the renal cortex, proliferate, and form tubular epithelial structures over seven days of perfusion culture. A 44 &#181;M resazurin solution in culture medium is perfused through the kidney for 1 hr during medium exchanges to provide a fluorometric, redox-based metabolic assessment of cell viability and proliferation during tubulogenesis. The kidney perfusion bioreactor permits non-invasive sampling of medium for biochemical assessment, and multiple inlet ports allow alternative retrograde seeding through the renal vein or ureter. These protocols can be used to recellularize kidney scaffolds with a variety of cell types, including vascular endothelial, tubular epithelial, and stromal fibroblasts, for rapid evaluation within this system.

This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.

상피 세포 다시 채우기 및 신장 조직 개발을위한 설치류 세포 외 기질 비계의 준비

This protocol details the generation of acellular, yet biofunctional, renal extracellular matrix (ECM) scaffolds that are useful as small-scale model ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block co-polymers featuring cholesterol units as side-chain pendant groups, resulting in smectic-A (SmA) liquid crystal elastomers (LCEs). Foam-like scaffolds, prepared using metal templates, feature interconnected microchannels, making them suitable as 3D cell culture scaffolds. The combined properties of the regular structure of the metal foam and of the elastomer result in a 3D cell scaffold that promotes not only higher cell proliferation compared to conventional porous templated films, but also better management of mass transport (i.e., nutrients, gases, waste, etc.). The nature of the metal template allows for the easy manipulation of foam shapes (i.e., rolls or films) and for the preparation of scaffolds of different pore sizes for different cell studies while preserving the interconnected porous nature of the template. The etching process does not affect the chemistry of the elastomers, preserving their biocompatible and biodegradable nature. We show that these smectic LCEs, when grown for extensive time periods, enable the study of clinically relevant and complex tissue constructs while promoting the growth and proliferation of cells.

This study presents a methodology to prepare 3D, biodegradable, foam-like cell scaffolds based on biocompatible side-chain liquid crystal elastomers (LCEs). Confocal microscopy experiments show that foam-like LCEs allow for cell attachment, proliferation, and the spontaneous alignment of C2C12s myoblasts.

3D 공간 세포 배양을위한 세포 발판으로 생체 적합성 액정 엘라스토머 거품의 합성

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...