저자는 기술 지원 니콜 Hasenkampf 아만다 Tardo을 감사드립니다. 우리는 또한 Drs에 감사드립니다. 모세관 수유 방법에 대한 명령의 린든 후진타오와 아드리아나 마르케스 LeFlap 견제 장치의 추천, 그리고 박사 리자 게른. 이 작품은 NIH / NCRR 그랜트 8 P20 GM103458-09 (MEE)에 의해 연구 자원을위한 국립 센터와 보조금 P51OD011104/P51RR000164을 통해 건강의 국립 연구소의 연구 인프라 프로그램의 사무실 (ORIP)에 의해 지원되었다.

라임 병 연구를위한 동물에 따라 눈금 접종 및 먹이의 실험 개요는 그림 1에 묘사되어있다. 1. 접종 Nymphal Ixodes는 B. 눈금을 모세관 튜브 수유를 사용 burgdorferi 틱 조작을 수행 할 때, 탄성 소매, 장갑, 일회용 불룩한 모자​​와 흰색 실험실 코트를 착용하고 있습니다. <ol><li> 우리의 기술은 브로드 등. (49)에 의해보고 된의 수정 된 버전입니다. 피펫 풀러를 사용하여 파괴 두께에 파스퇴르 피펫을 가열 당겨 모세관 튜브를 준비합니다. 집게를 사용하여 범위를 해부하면, 최적의 직경 (약 0.2 mm)에 대한 팁을 휴식. 틱 mouthpart 크기로 표준화 튜브는 크기 조정 가이드로 사용됩니다. 피펫을 준비 할 때 얼굴 가리개를 착용해야한다. </li><li> B. 성장한다 BSK-H 배지 (시그마) 죄수의 10 × 2-8 사이의 7 / ㎖ (중간 로그 상)에 burgdorferi6 % 토끼 혈청 이닝. </li><li> 4-6주 후 유충의 탈피를위한 23 ° C에 저장되어있는 nymphal 틱을 사용합니다. 장소는 요리의 외부 바닥면에 양면 테이프로 작은 60 X 15mm 페트리 접시에 틱. 위로 향하게 틱 복부 쪽을 놓습니다. </li><li> B.에 모세관 팁 담그고 혼합 후 burgdorferi 문화 관. 해부 범위를 사용하여 진드기의 입 부분의 hypostome에 모세관 튜브를 놓습니다. 도 2a에 도시 된 바와 같이, 대신에 튜브를 고정하는 몰딩 점토를 사용한다. </li><li> 봉쇄의 추가 수준의 대형 투명한 플라스틱 욕조 안쪽에 부착 진드기와 배양 접시를 놓습니다. 젖은 종이 타월은 수분을 제공하기 위해 추가됩니다. 배변이 명백한 때까지 30 분 - 2의 시간 동안 37 ° C의 열 배양기에서 진드기를 놓습니다. 이 나선상 세균을 포함하는 매체가 진드기를 통과 한 것을 나타냅니다. </li><li> 수유하기 전에 틱 환경에 적응 할 수 있도록 23 ° C에서 2 ~ 4 주간 틱 휴식동물 그들. </li></ol> 2. B.와 마우스를 감염 진드기 burgdorferi <ol><li> 멸균 물에 케타민 주식 1:10 희석. 투베르쿨린 주사기와 복강 내 주사 케타민 100 ㎎ / ㎏으로 각각 마우스를 마취 </li><li> 마우스가 완전히 마취되면, 다시 (레밍턴 매끄럽고 &amp; 매끄러운) 전기 트리머 벌금을 사용하여 중간 귀에서 마우스를 면도. </li><li> 다른 개체에 흰색 냄비에 가까운, 마우스의 털이 영역에 적신 붓 nymphal 틱 (즉, 항구 B.의 burgdorferi)를 전송합니다. 또한, 감염되지 않은 진드기가 의심되는 감염 마우스의 xenodiagnosis 생쥐에 배치 할 수 있습니다. 틱 배치를위한 깨끗한 흰색 표면의 사용은 무소속 진드기가 쉽게 볼 수있는 것을 보장하는 데 도움이됩니다. </li><li> 전문 caging (앨런 타운 Caging, 앨런 타운, PA)에 마우스를 놓습니다. caging 케이지의 바닥에서 상승 스테인레스 스틸 그릴로 구성되어 있습니다. 티그는 케이지의 상단을 아래에 마우스의 자유로운 이동을 허용 할 정도로 물병 홀더를 상승시키는 우리의 사내 기계 공장에 의해 수정되었습니다. 팬은 트랩에 물을 약 ½ 인치 마우스 (그림 3A)를 떨어져 어떤 틱으로 가득합니다. 쥐가 마취로부터 완전히 깨어까지 저체온의 위험을 최소화하기 위해, 재사용 레인지 가열 패드를 사용하기 전에, 오리스 밑에 배치된다. 그들은 마취와 음식과 물을 트레이에 문질러 복구로 동물은 종종 ataxic, 그래서 이러한 제거해야합니다. 수위 침수에서 마우스의 사지를 방지하기에 충분히 낮다. </li><li> 절지 동물의 포획을 위해 엉킴 트랩 붙여 넣기 (본사로, 빅토리아, BC, 캐나다)와 테이프로 늘어선 된 트레이 내부에 케이지를 놓습니다. 마우스는 단독으로 갇힌 마취의 기간 동안 지속적으로 관찰된다. </li><li> 쥐가 마취에서 완전히 깨어있을 때 2 시간 내, 음식 쟁반과 물 병 케이지로 대체됩니다. 이 후4 시간은, 플라스틱 오두막 및 nylabone로 구성된 주택 농축가 대체됩니다. </li><li> 3, 4, 5 일 후, 공급 진드기 마우스, 케이지와 케이지 물을 확인합니다. 케이지 물 (즉, &quot;금을 패닝&quot;) 흰색 금속 냄비를 통해 체질한다. 공급 깨끗한 물 틱 씻어 플라스틱 단지 (그림 3B)에 저장합니다. 일 3, 4, 깨끗한 물 새장에 물을 교체합니다. 5 일에, 케이지, 그러나 진드기에 대한 철저 마우스뿐만 아니라 확인합니다. 보통이 시점에서 모든 진드기 공급하고 마우스는 일반 caging에 반환 할 수 있습니다. </li><li> 고압 증기 멸균 및 폐기에 대한 생물 학적 용기에 액체를 포함하여 마우스 케이지에서 모든 폐기물을 놓습니다. 생쥐와 항상 회수 이러한 배치 틱 수의 로그를 유지한다. </li></ol> 3. B.와 감염에 대한 비인간 영장류에 틱을 먹이 burgdorferi 또는 xenodiagnosis <ol><li> 진드기 억제 장치를 준비한다 : 3 인치 X에서 1 ¾ 인치 직경의 원을 잘라3 인치 LeFlap (플랩) 깨끗한 메스와 측정 가이드를 사용. Biatane 거품과 Duoderm에 동일한 크기의 원을 잘라 템플릿으로 컷 아웃을 사용합니다. 발포체는 피부의 표면 상에 플랩을 상승 및 진드기의 가능한 분쇄를 방지하기 위해 사용된다. Duoderm는 쿠션의 또 다른 레이어를 추가하고 진드기 탈출에서 추가 보안을 위해 격납 장치의 가장자리를 오버레이. 격납 장치의 다이어그램은 그림 4에 묘사되어있다. </li><li> 수의 직원은 근육 주사로 5-8 ㎎ / ㎏ Telazol과 동물을 마취합니다. </li><li> 사이즈 40 블레이드 탑재 전동 트리머 (오스타)를 사용하여 동물의 머리를 클립. 재킷이 적용되는 모든 분야가 잘립니다 : 다시, 정면, 상단에 팔을. 면도 크림과 듀얼 블레이드 처분 할 수있는 면도칼을 사용하여 밀접하게 X 20cm 가로 세로 약 25 ㎝의 면적을 면도. 축축한 종이 타월로 닦아 피부를 건조 낮은 열로 건조한다. </li><li> t에 플랩을 배치그는 동물의 배부, 다만 견갑골 아래, 척추의 양쪽에. 그 자리에 원을 추적 마커를 사용합니다. SkinPrep로 닦아 원 주위 피부의 영역을 준비합니다. 이 접착제 및 견제 장치의 부착에 영향을 미칠 수있는 피부에있는 기름을 제거합니다. 원의 주위에 공간을 1cm 둘레에 대해두면, 1 ~ 4 cm의 폭 피부 접착제 (SkinBond)의 층을 적용한다. </li><li> Biatane 거품의 뒷면에 접착제를 제거하고 적절한 자리에 피부에 부착. 동물은 다시 5 ㎎ / ㎏ Telazol와 수의학 직원 마취 있습니다. 피부 접착제 및 Hypafix 테이프로 가장자리를 밀봉. 플랩의 뒷면에 접착제를 제거하고 Biatane의 상단에 부착. LeFlap의 가장자리 주위에 Hypafix 테이프를 놓고, 다음 플랩의 메쉬 플랩을 테이프와 동물의 재킷을 배치합니다. 테이프 엉 키게 트랩 페이스트는 추가 보안을 위해 인간이 아닌 영장류 caging을 둘러싼 주변의 바닥에 적용됩니다. </li><li> Chemic의 효과를 최소화하기 위해,격납 장치가 제자리에 후 진드기 수유의 단계 3.4에서 사용되는 루게릭 병은 진드기는 24 시간을 추가됩니다. 이 시점에서, 장치의 보안도 검사하고 필요한 경우 강화된다. 일반적으로 20 unfed 님프 (4~8주 후 유충의 탈피)은 붓을 사용하여 장치 내 피부에 추가됩니다. </li><li> 플랩의 메쉬의 뒷면에 접착제를 제거하고 장소에 밀봉. 마지막으로, 접착제를 노출하는 Duoderm 받침을 제거하고 격납 장치의 상단에 배치합니다. 오픈 메쉬 원에서 Hypafix 테이프의 조각을 추가하고, 재킷을 교체합니다. 완성 격납 장치는도 5a에 도시된다. </li><li> 후에 5 일, 위와 같이 동물을 마취와 재킷이 제거됩니다. 메쉬 (그림 5B)을 통해 틱 먹이를 검사하기 위해 먼저 테이프를 제거합니다. 조심스럽게 플랩에서 Duoderm 껍질. </li><li> 진드기에 대한 액세스를 제공하는 모서리에서 메쉬 부를 후퇴. 연준 틱 자주 또는 근처에서 발견거품 원 (그림 5C)과는 붓으로 제거하고 깨끗한 물에 배치됩니다. 장치 모두 한 번에 볼 수 공급 진드기가 수집됩니다 (그림 5D)를 제거합니다. </li></ol> 참고 : 때때로, 견제 장치는 단순히 떨어져 피부로부터 박리 할 수​​ 있습니다. 접착력이 강한 잠재적으로 피부에 손상을 줄 수 있다면, Unisolve 용매는 부드러운 제거를위한 영역에 적용된다. 피부는 이소프로판올로 닦아 진드기는 23 ℃에서 저장된다 감염에 사용되는 경우, 틱은 B를 포함 된 숫자를 확인하기 위해 분쇄 할 수있다 burgdorferi. xenodiagnosis 사용하면 진드기가 이전 중장 내용의 분석에 1-3 주 동안 유지된다.

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

그 항구 B. 틱 얻기 위해 하류 연구에 burgdorferi, 진드기가 될 수있다 : (1) 애벌레 단계에 감염된 생쥐에 공급 (2) B.에 몰입 하나 애벌레 또는 nymphal 단계 48에서 burgdorferi 문화 (3) B를 미세 주입 burgdorferi 47 또는 (4) 모세관 튜브 공급 B. burgdorferi 49. 각 방법은 진드기의 많은 부분이 감염 항구 B.에 사용되는 것을 보장하기위한...

2011 년, 라임 병은 북미 (에서 6 번째로 가장 흔한 전국적으로 신고 대상 질병이었다 <a href="http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html" target="_blank">http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html</a> ). B. burgdorferi는 모두 유전자 및 항원 (1 검토), 다양한 미생물이다. 그것의 유전 적 구성에 큰 (&gt; 900 KB) 염색체를 포함하는 플라스미드의 내용이 분리 사이에서 변화하는 21 플라스미드 (12 선형, 9 원)까지. 대부분은 플라스미드 오픈 리딩 프레임의 90 % 이상이 알려진 세균 서열 2,3와 관련이없는,이 spirochete에 대해 알게 될 것입니다. B. burgdorferi 호스트 면역의 잠재적 인 공격 대상으로 항원의 다양한 제공합니다. 그러나, 치료 감염은 종종 지속. 틱 환경과 척추 호스트 환경과 나선상 세균의 상호 작용은 B.에 의해 적응을 필요로 감염 과정을 통해 burgdorferi. 여러 플라스미드 인코딩유전자는 차등 온도, pH, 세포 밀도 및 진드기의 라이프 사이클 4-8에서도 스테이지의 변화에 응답하여 표현되는 것으로 알려져있다. B. 연구 자연 경로로 감염 다음의 enzootic주기 전반에 걸쳐 burgdorferi 적응 및 호스트 응답은 적절한 동물 모델에서 틱을 공급하는 능력에 의존한다. 이러한 연구 결과는 B. 항구 진드기를 생성하는 기술 과제를 충족 burgdorferi하고 모델 호스트 틱의 효율적인 전송 및 / 또는 공급을 보장한다. 또한, 감염된 진드기의 억제 및 복구가 필수적이다. 사용되는 모델에 따라 마우스와 라임 병 연구에 중요한 도구 역할을 각각의 인간이 아닌 영장류이다. B.에 대한 자연 저수지 호스트 흰 발이 마우스와 마찬가지로 burgdorferi는 실험실 마우스 B.에 의해 지속적인 감염을 지원하는 매우 취약 호스트입니다 9 burgdorferi. FOL이러한 C3H 변형 등의 질병 감염 마우스의 감염을 lowing, 나선상 세균은 피부, 방광, 근육, 관절, 심장 등의 여러 조직에 배포. 감염에 대한 염증 반응은 질병 심장과 관절 조직을 초래할. 나선상 세균이 호스트에서 지속 전염성 남아 있지만, 염증성 병변이없는 인간의 과정과는 달리, 간헐적 될 수 있습니다. 마우스 모델 따라서 B에 많은 정보를 제공하고 있습니다 관절염과 심장 염과 면역 반응 10-12 호스트를 포함 burgdorferi에 의한 병리. 틱 벡터 13-21에서 전송에 대한 몇 가지 필요한이 같은 병원체의 관점에서, 차별적 포유류 감염시 표현 특정 유전자가 특징으로하고 있습니다. 여러 동물 종 라임 병 (22)를 연구하는 데 사용되었습니다 만, 붉은 털 원숭이는 가장 밀접하게 인간의 질병 (23)의 멀티 기관 문자를 모방. 다른과는 달리동물 모델은, 홍반 이행 증, 심장 염, 관절염, 및 말초, 중추 신경 시스템의 신경 장애 등의 질병 발현의 폭은 짧은 꼬리 원숭이에서 관찰된다. 생쥐, B의 저수지 호스트 초기와 후기 - 전파 양상이 드문 9 동안 burgdorferi는, 질병, 마우스 긴장과 24 세에 따라 다릅니다. 또한, 다른 설치류, 토끼 목, 그리고 개 부대는 모든 B.에서 신경 질환을 전시하는 실패 burgdorferi 감염 25. 중요한 것은, 짧은 꼬리 원숭이는 라임 borreliosis, 즉, 초기 지역화, 조기 파종 및 말기 라임 병 26-28 3 단계의 특징적인 증상을 나타낸다. 홍반 이행 증 (EM)는 인간의 경우 29 70 ~ 80 %가 발생하는 것으로 생각되고, 또한 붉은 털 원숭이 (28, 30)에서 볼 수있다. 감염 후, 나선상 세균은 여러 기관에 접종의 사이트에서 배포. Spirochetal DNA 골격 무에서 검출 된scles, 심장, 방광, 말초 신경 및 신경 얼기뿐만 아니라 중추 신경계 (뇌, 뇌간 및 소뇌, 척수 및 경막) 31. 저장 능력은 32 ~ 36를 연구와 B의 연구에서 틱 쥐에 먹이가, 진드기 식민지의 전파를 위해 우리와 다른 연구 팀에 의해 활용되고 있습니다 burgdorferi는 37-40을 발병. 이 기술은 또한 xenodiagnosis 생쥐 41-44 백신 효능의 시험에 사용되었다. 우리는 Ixodes 모델 개발 28 인간이 아닌 영장류에 틱 공급 한 백신의 효능 (45)의 연구 및 지속성 후 항생제 치료 (46)의 평가에 xenodiagnosis하십시오. 그 항구 B. 틱 burgdorferi는 나선상 세균이 생활 단계를 통해 전송 될 때, 감염된 마우스에 애벌레를 공급하고 연구에 약충을 사용하여 천연 enzootic 사이클에서 유지 될 수있다. 이 보고서에우리는 야생형 또는 돌연변이 B.에 감염된 진드기를 생성하는 방법에 대한 지시 burgdorferi, 모세관 튜브 수유를 사용하여. 이것은 또한 마이크로 인젝션 (47)에 의해 침지 (48)에 의해 달성 될 수있다. B. 인공 도입 목적 진드기, 누구의 투과율을 알 수없는 돌연변이 균주를 연구 할 수있는 높은 감염률과 진드기의 그룹을 생성하고, 깨끗하고, 그렇지 않으면 감염되지 않은 진드기 식민지를 유지하여 오류 가능성을 줄이기 위해에 burgdorferi. 봉쇄 및 구비 틱 복구를 보장 할 수 있도록 또한, 우리는 마우스와 인간이 아닌 영장류에 진드기 먹이를 보여줍니다. 진드기의 먹이의 사용은 B. 면역 반응의 미래 연구에 필수적이다 burgdorferi 감염, 잠재적 인 라임 백신의 효능과 신비로운 감염의 검출을위한 xenodiagnosis.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BSK-H</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-8291</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tangle Trap coating Paste</td>
			<td>Ladd research</td>
			<td>T-131</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SkinPrep</td>
			<td>Allegro Medical Supplies</td>
			<td>177364</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LeFlap, 3" x 3"</td>
			<td>Monarch Labs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hypafix tape</td>
			<td>Allegro Medical Supplies</td>
			<td>191523</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SkinBond</td>
			<td>Allegro Medical Supplies</td>
			<td>554536</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>UniSolve</td>
			<td>Allegro Medical Supplies</td>
			<td>176640</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Biatane Foam, adhesive 4"x4"</td>
			<td>Coloplast</td>
			<td>3420</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DuoDerm CGF Dressing - 4" x 4", (3/4)" adhesive border </td>
			<td>Convatec</td>
			<td>187971 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nonhuman primate jackets with flexible 2" back panels; add drawstrings at top and bottom</td>
			<td>Lomir Biomedical Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipet puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 700C</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dark field microscope</td>
			<td>Leitz Wetzlar</td>
			<td>Dialux</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Zoom 2000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mouse caging</td>
			<td>Allentown caging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

feeding of ticks on animals for transmission and xenodiagnosis in lyme disease research

라임 병, 보렐리 아 burgdorferi의 병인의 전송은, 포유류의 호스트에 틱 Ixodes 종의 부착 및 혈액 공급에 의해 발생합니다. 자연 속에서,이 동물 매개 세균성 병원체는 저수지의 다양한 호스트를 사용할 수 있지만 흰색 발이 마우스 (Peromyscus의 leucopus)는 북아메리카에있는 애벌레와 nymphal 틱의 기본 저장소입니다. 인간은 가장 자주 B. 감염 부수적 호스트입니다 nymphal 단계. B.에있는 진드기에 물린 상처에 의해 burgdorferi burgdorferi는 enzootic주기를 통해 그 호스트에 적응하므로 포유류의 호스트에서이 나선상 세균과 그 효과의 기능을 탐색 할 수있는 기능은 진드기 먹이를 사용해야합니다. 또한, (탐지 및 감염원의 복구를위한 자연 벡터를 사용하여) xenodiagnosis의 기술은 암호화 된 감염의 연구에 유용하고있다. 얻기 위해서는 nymphal 해당 항구 B. 틱 burgdorferi,틱은 모세관 튜브를 통해 문화에 살고있는 나선상 세균을 공급하고 있습니다. 두 동물 모델 쥐와 인간이 아닌 영장류가 가장 일반적으로 진드기의 먹이를 포함하는 라임 병 연구에 사용됩니다. 우리는이 진드기에 공급, 감염 또는 xenodiagnosis 하나에 대한 동물에서 복구 할 수있는 방법을 보여줍니다.

그들은 전송을 위해 동물에 공급되기 전에 모세 혈관 공급의 완료 후, 진드기는 일반적으로 2 ~ 3 주간 23 ° C에서 휴식 있습니다. 모세관 수유 기술을 사용하여, 우리는 공급의 90 % 이상이 항구 B. 틱 것을 발견했다 burgdorferi. 긍정적 인 진드기의 비율이 세탁에 의해 결정된다 다음의 미세 튜브 모양의 유 봉과 멸균 PBS에서 그들을 분쇄, 과산화수소, 에탄올 틱. 중장 내용은 PBS에 유출은 ?...

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Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

라임 병은 북미에서 가장 일반적으로보고 된 벡터 매개 질병입니다. 원인 물질은 보렐리 아 burgdorferi는 Ixodid 진드기에 의해 전송 spirochete 박테리아입니다. 동물 모델에서 감염의 전송 및 검출은 우리가 여기에서 설명하는 진드기의 먹이의 사용에 최적화되어 있습니다.

라임 병 연구의 변속기 및 Xenodiagnosis에 대한 동물에 진드기의 먹이

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

feeding-ticks-on-animals-for-transmission-xenodiagnosis-lyme-disease

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.1K 조회수.  Tulane University Health Sciences Center.  라임 병은 북미에서 가장 일반적으로보고 된 벡터 매개 질병입니다. 원인 물질은 보렐리 아 burgdorferi는 Ixodid 진드기에 의해 전송 spirochete 박테리아입니다. 동물 모델에서 감염의 전송 및 검출은 우리가 여기에서 설명하는 진드기의 먹이의 사용에 최적화되어 있습니다. 

비디오: Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

RNA Interference in Ticks

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors of human diseases1 and the most important vectors affecting cattle industry worldwide2. Ticks are classified in the subclass Acari, order Parasitiformes, suborder Ixodida and are distributed worldwide from Arctic to tropical regions3. Despite efforts to control tick infestations, these ectoparasites remain a serious problem for human and animal health4,5.
RNA interference (RNAi)6 is a nucleic acid-based reverse genetic approach that involves disruption of gene expression in order to determine gene function or its effect on a metabolic pathway. Small interfering RNAs (siRNAs) are the effector molecules of the RNAi pathway that is initiated by double-stranded RNA (dsRNA) and results in a potent sequence-specific degradation of cytoplasmic mRNAs containing the same sequence as the dsRNA trigger7-9. Post-transcriptional gene silencing mechanisms initiated by dsRNA have been discovered in all eukaryotes studied thus far, and RNAi has been rapidly developed in a variety of organisms as a tool for functional genomics studies and other applications10.
RNAi has become the most widely used gene-silencing technique in ticks and other organisms where alternative approaches for genetic manipulation are not available or are unreliable5,11. The genetic characterization of ticks has been limited until the recent application of RNAi12,13. In the short time that RNAi has been available, it has proved to be a valuable tool for studying tick gene function, the characterization of the tick-pathogen interface and the screening and characterization of tick protective antigens14. Herein, a method for RNAi through injection of dsRNA into unfed ticks is described. It is likely that the knowledge gained from this experimental approach will contribute markedly to the understanding of basic biological systems and the development of vaccines to control tick infestations and prevent transmission of tick-borne pathogens15-19.

A method for RNA interference (RNAi) by injection of dsRNA into unfed ticks is described. RNAi is the most widely used gene-silencing technique in ticks where the use of other methods of genetic manipulation has been limited.

진드기의 RNA 간섭

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

연구

면역학 및 감염병학

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1. A tick-borne murine model 2 has been developed to study Lyme disease in the laboratory. While na&iacute;ve ticks can be infected with B. burgdorferi by feeding them on infected mice, the molting process takes several weeks to months to complete. Therefore, development of more rapid and efficient tick infection techniques, such as a microinjection-based procedure, is an important tool for the study of Lyme disease 3,4. The procedure requires only hours to generate infected ticks and allows control over the delivery of equal quantities of spirochetes in a cohort of ticks. This is particularly important as the generation of B. burgdorferi infected ticks by the natural feeding process using mice fails to ensure 100% infection rate and potentially results in variation of pathogen burden amongst fed ticks. Furthermore, microinjection can be used to infect ticks with B. burgdorferi isolates in cases where an attenuated strain is unable to establish infection in mice and thus can not be naturally acquired by ticks 5. This technique can also be used to deliver a variety of other biological materials into ticks, for example, specific antibodies or double stranded RNA 6. In this article, we will demonstrate the microinjection of nymphal ticks with in vitro-grown B. burgdorferi. We will also describe a method for localization of Lyme disease pathogens in the tick gut using confocal immunofluorescence microscopy.

Lyme disease research studies often require generation of ticks infected with the pathogen Borrelia burgdorferi, a process that typically takes several weeks. Here we demonstrate a microinjection-based tick infection procedure that can be accomplished within hours. We also demonstrate an immunofluorescence method for in situ localization of B. burgdorferi within ticks.

틱 굿 내에서 빠른 전송과 라임 질병 병원균의 현지화을위한 방법

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

Ixodes Scapularis 진드기의 타액, 침샘 및 Hemolymph 컬렉션

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

표면에 인간의 노로 바이러스의 검출을위한 면봉 표본 추출 방법

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), in a lepidopteran species, the cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Hubner). Here, we describe the protocols that are currently used to study the effect of HaDV2 on its host. First, we establish a HaDV2-free cotton bollworm colony from a single breeding pair. Then, we orally inoculate some neonate larval offspring with HaDV2-containing filtered liquid to produce two colonies with the same genetic background: one HaDV2-infected, the other uninfected. A protocol to compare life table parameters (e.g., larval, pupal, and adult periods and fecundity) between the HaDV2-infected and -uninfected individuals is also presented, as are the protocols for determining the host-tissue distribution and transmission efficiency of HaDV2. These protocols would also be suitable for investigating the effects of other orally transmitted viruses on their insect hosts, lepidopteran hosts in particular.

Here, we present a protocol to investigate the host-tissue distribution, transmission mode, and effect on the host fitness of a densovirus within a lepidopteran species, the cotton bollworm. This protocol can also be used for studying the interaction between other orally-transmitted viruses and their insect hosts.

코튼 면화씨 벌레의 Densovirus의 호스트 피트니스에 호스트 조직 배포, 전송 모드 및 효과 조사를위한 프로토콜

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

세포 독성의 평가 인간의 정밀 컷 폐 분할 영역에서 물질의 Immunomodulatory 효과

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and E. coli, and are useful for the study of pathogenesis and/or spread of the bacteria in natural hosts. With the key function of lymph nodes in the host immune response, lymph node tissues serve as a potential source of RNA for downstream transcriptomic analyses, in order to assess the temporal changes in gene expression in cells over the course of an infection. This article presents an overview of the process of lymph node collection, tissue sampling, and downstream RNA processing in livestock, using cattle (Bos taurus) as a model, with additional examples provided from the American bison (Bison bison). The protocol includes information about the location, identification, and removal of lymph nodes from multiple key sites in the body. Additionally, a biopsy sampling methodology is presented that allows for a consistency of sampling across multiple animals. Several considerations for sample preservation are discussed, including the generation of RNA suitable for downstream methodologies like RNA-sequencing and RT-PCR. Due to the long delays inherent in large animal vs. mouse time course studies, representative results from bison and bovine lymph node tissues are presented to describe the time course of the degradation in this tissue type, in the context of a review of previous methodological work on RNA degradation in other tissues. Overall, this protocol will be useful to both veterinary researchers beginning transcriptome projects on large animal samples and to molecular biologists interested in learning techniques for in vivo tissue sampling and in vitro processing.

This protocol provides an overview of procedures for the isolation of RNA for the transcriptomic profiling of lymph node tissues from large animals, including steps in the identification and excision of lymph nodes from livestock and wildlife, sampling approaches to provide consistency across multiple animals, and considerations plus representative results for the post-collection preservation and processing for RNA analysis.

수집 및 RNA 분석에 대 한 큰 동물에서 림프절의 처리: 큰 동물 종의 림프 노드 Transcriptomic 연구에 대 한 준비

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

Sexual Transmission of American Trypanosomes from Males and Females to Naive Mates

American trypanosomiasis is transmitted to humans by triatomine bugs through the ingestion of contaminated food, by blood transfusions or accidently in hospitals and research laboratories. In addition, the Trypanosoma cruzi infection is transmitted congenitally from a&#160;chagasic mother to her offspring, but the male partner&#39;s contribution to in utero contamination is unknown. The findings of nests and clumps of amastigotes and of trypomastigotes in the theca cells of the ovary, in the goniablasts and in the lumen of seminiferous tubules suggest that T. cruzi infections are sexually transmitted. The research protocol herein presents the results of a family study population showing parasite nuclear DNA in the diploid blood mononuclear cells and in the haploid gametes of human subjects. Thus, three independent biological samples collected one year apart confirmed that T. cruzi infections were sexually transmitted to progeny. Interestingly, the specific T. cruzi antibody was absent in the majority of family progeny that bore immune tolerance to the parasite antigen. Immune tolerance was demonstrated in chicken refractory to T. cruzi after the first week of embryonic growth, and chicks hatched from the flagellate-inoculated eggs were unable to produce the specific antibody.&#160;Moreover, the instillation of the human semen ejaculates intraperitoneally or into the vagina of naive mice yielded T. cruzi amastigotes in the epididymis, seminiferous tubule, vas deferens and uterine tube with an absence of inflammatory reactions in the immune privileged organs of reproduction. The breeding of T. cruzi-infected male and female mice with naive mates resulted in acquisition of the infections, which were later transmitted to the progeny. Therefore, a robust education, information and communication program that involves the population and social organizations is deemed necessary to prevent Chagas disease.

The Trypanosoma cruzi agent of Chagas disease produces long-lasting asymptomatic infections that abruptly develop into clinically recognized pathology. The following research protocol describes a short-run family-based epidemiological study to unravel the T. cruzi infection transmitted sexually from parent to progeny.

치 메이 트 남성 및 여성에서 미국의 Trypanosomes의 성적인 전송

American trypanosomiasis is transmitted to humans by triatomine bugs through the ingestion of contaminated food, by blood transfusions or accidently in ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern recognition receptors (PRRs). Unfortunately, this also makes macrophages particularly challenging to transfect as the transfection reagent and the transfected nucleic acids are often recognized by the PRRs as non-self. Therefore, transfection often results in macrophage activation and degradation of the transfected nucleic acids or even in suicide of the macrophages. Here, we describe a protocol that allows highly efficient transfection of murine primary macrophages such as peritoneal macrophages (PM) and bone marrow-derived macrophages (BMDM) with mRNA in vitro transcribed from DNA templates such as plasmids. With this simple protocol, transfection rates of about 50-65% for PM and about 85% for BMDM are achieved without cytotoxicity or immunogenicity observed. We describe in detail the generation of mRNA for transfection from DNA constructs such as plasmids and the transfection procedure.

Macrophages, especially primary macrophages, are challenging to transfect as they specialize in detecting molecules of non-self origin. We describe a protocol that allows highly efficient transfection of primary macrophages with mRNA generated from DNA templates such as plasmids.

체외 전사 mRNA를 가진 1 차적인 대식세포의 고효율 형질감염

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This parasitic disease requires a protozoan parasite, an Anopheles mosquito vector, and a vertebrate host. The Anopheles genus comprises more than 500 species, of which 60 are known as vectors of the parasite. The Plasmodium parasite genus consists of 250 species, and 48 of these are involved in disease transmission. Furthermore, the Plasmodium falciparum parasite has contributed toward an estimated 99.7% of malaria cases in sub-Saharan Africa in recent years. 
Gametocytes form part of the sexual stage of the parasite and are ingested by the female mosquito upon feeding on an infected human host. Further development of the parasite within the mosquito is enhanced by favorable environmental conditions in the midgut of the mosquito. Here, the fusion of the female and male gametes takes place, and the motile ookinetes originate. The ookinetes enter the midgut epithelium of the mosquito, and mature ookinetes form oocysts, which, in turn, produce motile sporozoites. These sporozoites migrate to the mosquito's salivary glands and are injected as a mosquito takes a blood meal. 
For drug discovery purposes, mosquitoes were artificially infected with gametocyte-infected blood in the standard membrane feeding assay (SMFA). To detect infection within the mosquito and/or to assess the efficacy of antimalarial compounds, the midguts of the female mosquitoes were removed post infection and were stained with mercurochrome. This method was used to enhance the visual detection of oocysts under the microscope for the accurate determination of oocyst prevalence and intensity.

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

The standard membrane feeding assay (SMFA) is regarded as the gold standard for the assessment and identification of potential antimalarial compounds. This artificial feeding system is used to infect mosquitoes to further evaluate the effects of such compounds on the intensity and prevalence of the Plasmodium falciparum parasite.

Anopheles 모기 벡터에서 플라스모듐 팔시파룸 감염 검출을 위한 표준 막 공급 분석

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...