우리는 원고의 비판적 평가를위한 유용한 토론을위한, IBS 박사 크리스토프 Masselon (iRTV, CEA, 그르노블) 및 바이러스 성 감염의 회원들과 암 그룹 감사합니다. 우리는 단백질 Crm1의 종류 선물을위한 시릴 다이애나에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 과학적인 연구는 그르노블에 지시 센터 (; UMS 3518 CNRS-CEA-UJF-EMBL ISBG)의 질량 분석 시설에서 일어났다. 그것은 경제적으로 통합 된 구조 생물학 이니셔티브 (FRISBI, ANR-10-된 InSb-05-02)에 대한 프랑스의 인프라에 의해 지원되었다, GRAL (ANR-10-LabX에-49-01) [그르노블 공동체 내에서 구조 생물학]와로 과학 연구에 대한 프랑스의 국립 센터 (CNRS).

1. 단백질 시료 준비 : 버퍼 거래소 (선택 사항) 단백질 (1 ~ 20 μM)의 마이크로 몰 농도의 5-25 μL가 필요합니다. 버퍼 교환은 원심 한외 여과 장치 (예 Vivaspin,는 Sartorius) 또는 마이크로 원심 겔 여과 컬럼 (예를 들면, 마이크로 바이오 스핀 6 컬럼 크로마토 그래피, 바이오 라드) 29, 30을 사용하여 수행 될 수있다. 완충액 교환 단계는 2 - 3 회 반복 될 수있다. 버퍼 교환의 자세한 설명은 이전에 (29, 30)를 발표했다. 예를 들어, 우리는 20 mM의 최종 트리스 버퍼 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄 (즉 트리스) pH가 8을 이용한다. 참고 :이 단계는 대부분의 경우에 생략 할 수있다. 단백질 시료는 강하게 MS 검출을 방해 할 수있는 분자 또는 버퍼 포함 때 수행되어야한다 [예 : 글리세롤, 4 - (2 - 히드 록시 에틸) -1 - 피페 라진 에탄 술폰산, HEPES]. 그것은 한때를 개선하기 위해 유용합니다스펙트럼의 ality. 2. 행렬의 재결정 이들의 순도 (선택 사항)을 개선하기 위해 <ol><li> 파이렉스 플라스크에 40 % 에탄올 (EtOH로) 10 ㎖를 붓는다. </li><li> 매트릭스의 600 밀리그램을 추가합니다. </li><li> 수조 및 저항 히터를 사용하여, 매트릭스 용액을 따뜻하게 행렬이 완전 유리로드 또는 자석 교반기를 사용하여 용해 될 때까지 교반. </li><li> 당신이 포화 용액이 될 때까지 2 단계를 반복합니다. </li></ol> 참고 : 용매의 너무 큰 볼륨을 사용하거나 작게 용액의 비점 이하 행렬 일절 결정 또는 결정 없음 나쁨 수율 발생할 용해. <ol start="5"><li> 용액을 천천히 냉각 할 수 있습니다. 당신은 4 ° C에서 하룻밤 후 몇 시간 동안 실온에두고 할 수 있습니다. 주 : 결정이 형성되어 있지 않은 경우, 결정화 유리 교반 막대를 사용하여 (저스트 인 솔루션면 아래) 비이커 내를 긁기에 의해 유도 될 수있다. </li><li> 여과에 의해 매트릭스 결정을 수집합니다. </li><li> 빙냉 용매의 최소량을 결정 헹구고 그들을 여과. </li><li> 결정이 건조하도록 허용합니다. 이 단계 진공을 사용할 수 있습니다. </li></ol> 3. MALDI 스테인리스 대상의 청소 <ol><li> 메탄올 (메탄올)와 MALDI 플레이트를 씻어 특수 실험실 응용 프로그램 (예를 들어, 킴 와이프)을 위해 만든 세정 티슈로 가볍게 닦아냅니다. </li><li> H 2 O와 대상을 씻어 청소 티슈로 닦아냅니다. </li><li> 600 ㎖의 비이커에 MALDI 플레이트를 삽입하고 50 % EtOH로 커버. </li><li> 초음파 욕조에서 10 분 동안의 EtOH 솔루션에서 대상을 초음파 처리. </li><li> 접시에 남은 잔여 물이있는 경우에, 다시 한번 1-4 단계를 반복한다. </li><li> 마지막으로, (또는 물과 함께 아래의 메모를 참조) 메탄올과 목표를 씻어, 모든 액체가 청소 조직에 수집되는 방법으로 그것을 기울이십시오. 실온 또는 사용하여 질소 -에 목표를 건조 시키가스 흐름. </li></ol> 참고 : 유사한 절차는 이전 15 설명했다. 참고 : 대상의 마지막 헹굼에 사용되는 용매 (메탄올 또는 물) 일부 대상 기능을 결정합니다. 목표는 메탄올로 세정하는 경우, 샘플은 물을 사용하는 경우보다 훨씬 더 많은 대상에 퍼집니다. 4. α-CHCA 얇은 레이어 솔루션 : MALDI 대상에 대한 준비 및 증착 <ol><li> 포화 용액을 만들기 위해 아세톤에 α-CHCA을 녹입니다. </li><li> 손으로 (모든 피펫없이) α-CHCA 포화 용액에 10 ㎕의 팁 (예 : GELoader 팁, 에펜 도르프)을 찍어 : 용액의 소량 (때문에 모세관 현상에) 끝으로 흐를 것이다. </li><li> 피펫 팁으로 매우 빠르게 (즉, 1 초) MALDI 대상을 터치 MALDI 대상에 α-CHCA의 아세톤 용액을 예금. 이것은 매트릭스 박막, 단백질을 구성 할 것이다샘플 적립됩니다. 가능한 한 작은 얇은 층의 자리를 생성하려고합니다. </li></ol> 주 : 매트릭스로서 SA를 사용하는 경우, 우리는 아세톤 SA의 포화 용액을 사용하여 박막을 제조. 5. SA, α-CHCA, DHB 및 CHCA_DHB 혼합물 25 : Natrix 솔루션의 제조 <ol><li> , ACN에서 0.1 % TFA (70:30 권 / 권)을 20 ㎎ / ㎖ SA 솔루션을 준비합니다. </li><li> 20 ACN의 ㎎ / ㎖ α-CHCA 솔루션 및 5 % 포름산 [ &quot;α-CHCA 솔루션&quot;으로 명명 (70:30 권 / 권)을 준비합니다. </li><li> ACN 20 ㎎ / ㎖ DHB 용액 [ &quot;DHB 솔루션&quot;으로 명명 된 0.1 % 트리 플루오로 아세트산 (TFA) (70:30 권 / 권)을 준비합니다. </li><li> &quot;CHCA_DHB 솔루션&quot;을 얻기 위해 1:1 비율 (권 / 권)의 &quot;α-CHCA 솔루션&quot;과 &quot;DHB 솔루션&quot;을 섞는다. </li></ol> 참고 : 대량 미만 100 kDa의 단백질의 발현을 분석 할 때 하나는 서로 다른 비율로 &quot;α-CHCA 솔루션&quot;과 &quot;DHB 솔루션&quot;을 혼합 할 수 있습니다. EXA에 대한엠플 α-CHCA과 DHB (권 / 권) 사이에 40:60의 비율이 더 나은 해상도, 그러나 더 적은 감도 (설명 참조) 산출합니다. 6. MALDI 대상에 샘플 증착 <ol><li> 이전에 제조 된 α-CHCA 얇은 층의 단백질 샘플의 예금 0.5 μL. 즉시 그 후, 매트릭스 솔루션 (즉, SA 용액 또는 α-CHCA 솔루션 또는 &quot;CHCA_DHB 믹스&quot;)의 0.5 μl를 추가합니다. 이것은 대상 시료와 매트릭스를 혼합하는 것을 의미한다. </li></ol> 참고 : 보통 사람은 1:1의 비율로 매트릭스 단백질 샘플을 혼합. 이 비율은 MALDI 스펙트럼의 좋은 품질에 대한 중요합니다. 서로 다른 샘플의 농도를 테스트하려는 경우, 당신은 샘플을 희석 ACN_formic 산 용액 (전술)를 사용할 수 있습니다. 참고 : 원하는 경우, 당신은 튜브에 시료와 매트릭스를 혼합 한 후 혼합 &quot;sample_matrix 솔루션을 입금 할 수 있습니다얇은 층에 기 &quot;. 참고 : 우리는 샘플을 희석하는 것은 당신이 오염 물질의 간섭을 줄일 수 있기 때문에 다양한 샘플의 농도를 테스트하는 것이 좋습니다. 샘플을 희석하기 위해 샘플을 희석 ACN_formic 산 용액 (전술)를 사용할 수 있습니다. 7. Calibrant 증착 <ol><li> 예금 calibrant 표준의 0.5 μL (예 : &quot;단백질 표준 II&quot;, 브루 커 달 토닉, 브레멘) 다음 매트릭스 솔루션의 0.5 μl를 추가합니다. </li></ol> 참고 : 단백질 샘플 반점 옆에 MALDI 플레이트 (설명 참조)에 calibrant을로드합니다. 8. Calibrant의 MALDI 스펙트럼 수집 및 단백질 샘플 샘플 및 calibrant 건조 후에는 현미경으로 &quot;장소&quot;를 관찰 할 수 있습니다. 이 관찰은 선택 사항이며, 초보자에 주로 관심있는 내용 일 수. 샘플의 스펙트럼을 획득하려면 일을 삽입전자 MALDI-TOF 악기의 대상 및 장비의 각 유형에 대해 다른 적절한 수단이 매개 변수를 선택합니다. 가장 적절한 셋업을 얻으려면 하나는 제조 업체의 권장 사항을 따라야합니다. 그대로 단백질을 분석 할 때 일반적 고려 사항으로, 하나는 (펩티드 분석에 적합하지 반사 모드) 선형 모드에서 기기를 사용한다. 일반적으로 우리는 긍정적 인 이온 모드에서 우리의 악기를 사용합니다. 또한, 키 매개 변수는 쓸모 해상도 31 향상 &quot;펄스 이온 추출&quot;입니다. 간단히 말하면, &quot;펄스 화 이온 추출은&quot;샘플 이온의 생성과 이온이 검출기를 향해 가속된다 시간 사이 일시 정지로 정의 될 수있다. 본래 단백질을 분석 할 때, 하나의 펩티드를 관찰 할 때보다 큰 &quot;펄스 화 이온 추출&quot;(예를 들어 500 나노초)을 이용 (예, 80 나노초).해야 해당 M / Z의 범위를 선택, 스펙트럼 (을)를 취득F calibrant, 악기를 보정합니다. 당신은 당신의 샘플의 스펙트럼을 획득 할 때, 적절한 레이저 강도를 (설명 참조)를 사용합니다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 MALDI-TOF 악기를 사용하여, 100 kDa의보다 큰 분자량에 큰 손상 단백질의 높은 품질의 질량 스펙트럼을 얻기 위해 세부 프로토콜을 제시했다. 샘플 준비에 관한 중요한 측면의 개수 정중 질량 스펙트럼의 품질을 개선하기 위해 고려되어야한다. 행렬 및 용매에있는 모든 오염 물질이 용매를 증발시킨 후 MALDI 대상에 집중되어 있기 때문에 행렬 및 고순도 용매는 매우 중요하다. MALDI 행렬의 순도를 향상시키기 위해 그것 (상기 참조) 고전 재결정 방법을 사용하여 정제 할 수있다. 우리는 또한 갓 매트릭스 결정을 개선하고 매트릭스 저하를 방지하기 위해 (적어도 일주일에 한 번) 매트릭스 솔루션을 준비하는 것이 좋습니다. 매트릭스 증착 방식은 스펙트럼의 최종 품질에 매우 중요하다. 전술 한 바와 같이, 박막 법은 우리의 방법이다 OF 선택 12. 더욱이, 우리는 첫 번째 층을 증착하기위한 방법을 최적화. 매트릭스가 포화 용액을 수득 아세톤되면 파논은 용매의 빠른 증발을 허용하지만, 또한 제어하는​​ 제 1 층의 크기가 매우 어렵게 만든다. 우리는 당신이 신속하게 대상에 입금 최소한의 볼륨을 얻을 수있는 matrix_acetone 용액에 담그는 작은 브러시로 GELoader 팁을 사용하는 것이 좋습니다. 제 1 층의 크기는 어떻게 든 MALDI 스팟의 최종 크기를 제어한다 :이 경우 시료 농도가 큰 곳의 경우보다 높기 때문에 작은 스폿 (지름 즉 0.5-0.75 mm)가 바람직하다. 작은 자리를 얻기 이전에 조브 비디오 15에서 제안 된 매우 얇은 층의 접근 방식과 다릅니다. Fenyo에서는 외. 박층 용액 모두 피펫 팁의 측면을 이용하여 MALDI 표적 퍼진다. 이 접근법은 특정 기준을 만족해야 박층 테스트 필요(용매 증발의 예를 들어 속도). 기준이 충족되지 않으면, MALDI 대상은 세정되어야하고, 새로운 얇은 층을 제조한다. 이것은 초보자를위한 준비는 매우 힘든합니다. 또한, 접시에 샘플 / 매트릭스 혼합물의 증착 Fenyo 등. 준비 우리의 접근 방식보다 조금 더 어렵게, 진공 라인 및 TFA (15)를 사용하여 세척 단계를 사용하여 여분의 용매의 흡입을 필요가 필요합니다. 매트릭스 및 샘플 간의 용적비는 MALDI-TOF에 의한 손상 단백질의 성공적인 분석에 매우 중요하다. 다른 비율을 테스트 한 후 우리는 1:1 비율을 사용하는 것이 좋습니다. 다른 매트릭스 : 표본 비율은 아마 동질이 아닌 이유로 결정화, 스펙트럼의 품질을 손상시킬 수 있습니다. 매트릭스 및 샘플이 증착되는 순서는 중요하다. 매트릭스 박막을 증착 한 후, 샘플은 증착되고 바로 SAMP 이전 (이후르 지점)이 건조되고 CHCA_DHB 혼합물을 첨가한다. 이 절차는 단독으로 샘플이 매트릭스 층 사이에 침착된다 &quot;샌드위치 법&quot;(27)로 정의되었다. 대안으로 CHCA_DHB 용액 및 시료 0.5 ㎖ 튜브에 혼합 될 수 있으며, 다음 CHCA 얇은 층 (12) 상에 발견. 이것은 고품질 스펙트럼에서 생성 된 결정의 균질 층으로 자리를 산출한다. 이 예리한 피크를 생성 할 수 있지만, 측정 감도 (즉, 덜 강한 피크)를 손상시킬 수; 질량보다 낮은 100 kDa의, DHB의 농도로 단백질을 분석 할 때 (CHCA 예 60:40 DHB)을 증가시킬 수있다. 정확한 계측기 교정의 경우, 하나보다 질량 정확도를 얻을 수 있도록 시료 스폿에 매우 근접 calibrant 표준을 증착하는 것이 필수적이다. &quot;의사 내부 교정 절차는&quot;이전에 15를 제안했다 : 샘플의 스펙트럼, calibrant 자리 나 인수 후calibrant의의 레이저 샷 신호는 샘플의 스펙트럼에 추가됩니다. 이것은 당신에 내부적으로 calibrant 피크를 사용하여 샘​​플의 스펙트럼을 보정 할 수 있습니다. 레이저 에너지는 신중 스펙트럼 획득 동안 제어되어야한다. 대부분의 경우에, 높은 에너지는 감도를 증가 시키지만 해상도를 낮춘다. 우리는 인수의 감도를 저하시키지 않고 가능한 최소 레이저 에너지를 사용하여 제안한다. 또한, 스펙트럼의 품질을 개선하기 위해, 하나는 각각의 샘플에 대한 추가 스폿 발포를 획득 할 수있다. 일반적으로 더 명중하면 (1,000-2,000 발포)을 취득, 신호의 강도 높은. 레이저로 자리를 타격하는 경우, 하나의 샘플이 균일하게 분산되지 않기 때문에, 올바른 위치 (예 : &quot;스위트 스팟&quot;)를 찾을 필요가있다. 당신은 신호가 증가 될 때까지 같은 지역에서 촬영 한 다음 샘플을 포함하는 또 다른 영역을 찾기 위해 시도 할 수 있습니다. 행렬과 SOLV의 결론, 고순도엔트 샘플 및 대상 행렬 증착에 사용되는 방법은, 교정, 레이저 에너지의 강도, 취득 시간 (발포 / 스팟의 개수)에 사용되는 표준의 위치는 하나의 고려해야 할 중요한 요인 MALDI-TOF MS에 의해 손상 단백질을 분석. 저자 포스트 LS 및 EBE는 실험 설계 질량 분석 실험을 수행하여 데이터를 분석하고, 원고를 썼다.

구조 생물학 고품질 한 단백질의 생산에 의존하고, 따라서 단백질 분석 2,3위한 효율적이고 신뢰성있는 기술로 결합 될 필요가있다. 구조 생물학 연구소 내의 우리의 질량 분석 (MS) 실험실에서 우리는 단백질의 기본 순서를 확인해야합니다, 돌연변이 및 전사 후 변형의 존재를 평가하고, 단백질의 분해, 샘플 균질성, 동위 원소 표지의 질 (예를 들면 중수 소화 핵 자기 공명 연구를위한 단백질 4). 구조 생물학 유연한 부분에서 구조적 강성 도메인을 구분하기 위해 제한된 단백질 분해를 사용하기 때문에, 우리는 안정적으로 MS를 사용하여 이러한 잘린 단백질을 특성화 할 필요가있다. 생체 분자가 MS에 의해 분석되는 경우, 두 가지 접근 방법은 부드럽게 무거운 및 불안정한 분자를 이온화하기 위해 사용된다. 전기 분무 이온화 (ESI)는 직접 분자를 이온화액상 5, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 (MALDI)은 생체 분자가 자외선을 흡수하는 유기 분자 (즉, 매트릭스 분자) 6와 공동 결정화되어 있어야합니다. 그것은 (50 PPM ≤) 고정밀 질량 측정을 가능하게하기 때문에 ESI의 비행 시간 (TOF) MS 액체 크로마토 그래피에 결합하면, 본래의 단백질 분석 용 루틴의 기술이되었다. 그러나, (염 및 세정제에 관한 것이다) 시료 완충액의 조성 및 분석 신호의 억제를 일으키는 때로는 제거하기 어려운 오염 물질 (즉, 중합체)에 매우 민감하다. MALDI-TOF MS는 성능이 적은 버퍼 구성 요소, 세제 및 오염 물질에 의해 영향을 받으므로 ESI-MS에 효과적인 대안을 나타냅니다, 시퀀스 확인을위한 (500 PPM ≤) 충분한 정확도를 그대로 단백질 질량 결정을 할 수 있습니다. PROTEI 후N 소화, MALDI-TOF MS는 또한 소위 &quot;펩티드 질량 지문&quot;에 의해 상기 기본 시퀀스 확인을 얻은 펩타이드를 분석하는 데에 이용 될 수있다. 우리 손에, 100 kDa의보다 크고 (의한 변경 또는 잘림에) 이질적 그대로 단백질의 질량 결정, ESI-MS에 의해보다 MALDI-MS에 의해 쉽습니다. 이 ESI 스펙트럼에 존재하는 중복 충전 상태 분포의 부족 때문이다. 또한, MALDI 프로세스가 분석 크기 7, 이러한 방법의 수율 높은 감도에 의존하지 않기 때문에 생체 분자 질량이 100 kDa의 이상인 경우. 본래 단백질의 현저한 분석은 1980 년대 말과 1990의 8-11 초 사이에 집에서 만든기구를 사용하여 수행 하였다. 이 샘플 준비를위한 시간이 덜 필요하고 interferen에 덜 민감하기 때문에 MALDI-TOF는 단백질 시료의 품질을 평가하는 검사 도구로 사용될 수있다일반적인 불순물 (예를 들면 염)에 의한 CES. MALDI-MS에 의하여 제, 퀵 평가 후, 샘플은 더 높은 정확도로 질량을 결정하기 위해 ESI-TOF로 분석 될 수있다. 또한, MALDI는 ESI보다 적은 비용을 포함하는 이온을 생성하고, 따라서 더 간단 MALDI 데이터를 수집하고 해석한다. 이 구조 생물학에서 일하는 학생들은 그냥 간단한 교육 후 자신의 재조합 단백질을 분석 할 수 있습니다. 매트릭스 및 매트릭스 증착 (예를 들어 건조 된 액적 (8) 및 박층 12-16,17,18)에 사용되는 기술의 두 핵심 요소가 MALDI 스펙트럼의 품질에 영향을 미친다. 하나의 유기 매트릭스 [예 sinapinic 산 (SA) 19 ~ 21 또는 α-시아 노 -4 - 히드 록 산 (α-CHCA) 14,22,23]가 자주 손상 단백질과 가교 단백질 복합체의 MS 시험에 사용되는 . α-CHCA를 사용 Chait 그룹은 이전에 P에 대한 자세한 프로토콜을 제시이전의 가용성 및 막 단백질 (14, 15)의 MALDI 분석에 매우 얇은 층을 reparing를. 최근, 고르 카 등 알. 매트릭스 (24)로 α-CHCA를 사용하여 펩타이드와 단백질의 MALDI 분석을 개선하기 위해 흑연 기반의 대상 코팅을 보여줍니다. 2,5 - 디 히드 록시 벤조산 (DHB)와 α-CHCA 25 : 여기서 우리는 두 행렬의 혼합물을 사용, MALDI-TOF MS에 의한 손상 단백질의 분석을위한 간단한 프로토콜을 제시한다. 우리는 체계적으로 그대로 단백질의 제어, SA 및 α-CHCA 행렬에 비해 DHB-CHCA 믹스의 성능을 평가 하였다. 매트릭스 혼합물을 더 나은 해상도 (단백질 피크가 훨씬 선명 즉)한다. 또한, 강렬한 체류 전하 이온의 존재 (즉, M +2 H 2 +, M +3 H 3 + 등)은 축 MALDI-TOF 계기의 해상도는 전하 위에 낮은 질량으로 높기 때문에 (더 정확한 질량 측정을 가능하게m / z) 26. 이것은 100 kDa의 단백질보다 더 큰 분자량을 결정하는 데 특히 유용하다. 높은 감도는 DHB-CHCA 혼합물 (MALDI 대상에서 발견 단백질의 0.5 pmole의)를 사용하여 도달한다. 위에서 언급 한 바와 같이, MALDI 기기를 사용할 때 고려되어야하는 중요한 요인은 증착 행렬이다. Laugesen 외.는 건조 액체 방울 증착을 이용하여, 처음 25 DHB-CHCA 혼합물의 사용을 제안했다. 우리는 첫 번째 층을 아세톤에 용해 된 α-CHCA 의해 형성되는 박막 법을 이용하면 그러나, 우리는 더 나은 결과 (예, 더 높은 감도)를 관찰했다. 박층 방법 12,27 이전 15 주피터 비디오에서 설명 하였다 MALDI 표적에 매트릭스 결정의 균일 하층의 형성을 의미한다. 그 후, 샘플은 마침내 기질 상에 증착되고,추가 행렬 (아래 참조)에 증착된다. 이 문서에서는, 우리는 또한 MALDI 대상에서 샘플을 입금하는 방법을 보여줍니다뿐만 아니라, 대상 (15)를 청소하는 방법, 재결정하고, 행렬을 준비합니다. 우리 모두가 (특히, 구조 생물 학자) 과학자에 그대로 단백질 분석에 필요한 정보를 신속하고 간단한 방법으로 생산 된 단백질의 품질을 평가해야하고 누구를 제공하는 것을 목표로 결론을하려면 MALDI-TOF MS에 아주 익숙하지 않다. 1990 년대 중반 28에서 예측으로, MS는 생물 학자들과의 접근성이 증가로, 생물학 연구에 증가 영향을 미쳤습니다. 우리는 우리가 제공하는 정보는 질량 분석기를 사용하여 시작하고 싶습니다 생물 학자와 과학자에 MALDI-TOF에 액세스 할 수 있도록하는 것이 유용 할 수 있기를 바랍니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizima</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin 6 chromatography columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-6221</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 500</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0122</td>
			<td>various molecular weight cut off</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>14262</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>02860</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIMTECH SCIENCE Precision Wipes Tissue Wipers</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>05511</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&alpha;-cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8982</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650501</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,5-dihydroxybenzoic acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>39319</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GELoader Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 001.222</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>09676</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>302031</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Standard II</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>207234</td>
			<td>It contains Trypsinogen, Protein A, Serum Albumin-Bovine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunoglobulin G</td>
			<td>ABSciex</td>
			<td>GEN602151</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water purifier PURELAB Ultra Analytic</td>
			<td>ELGA LabWater</td>
			<td>89204-052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex MALDI-TOF instrument</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF target</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (maldi-tof) mass spectrometric analysis of intact proteins larger than 100 kda

효과적으로 단백질의 질량을 결정하는 (구조 생물학 조사를 위해 예를 들어) 많은 생물학 연구에 매우 중요합니다. 정확한 질량 판정 한 단백질 일차 서열의 정확성을 평가할 수 있으며, 돌연변이 및 / 또는 번역 후 변형, 가능한 단백질 분해, 샘플 균질성, 및 라벨의 경우 동위 원소 내장의 정도 (예를 들면 13 C 라벨의 존재 ). 전기 분무 이온화 (ESI) 질량 분석법 (MS)가 널리 변성 단백질의 질량 측정을 위해 사용 되나, 그 효율성은 샘플 버퍼의 조성에 의해 영향을 받는다. 특히, 염, 세제 및 오염물의 존재는 심각한 ESI-MS에 의한 단백질 분석의 효율성을 저해. 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI) MS는 그것의 내염성 및 데이터 수집 및 해석에의 단순성, 매력적인 대안기. 또한, 대형 이종 단백질 (보다 큰 100 kDa의)의 질량 판정 인해 ESI 스펙트럼에 존재하는 높은 충전 상태 분포를 중첩의 부재에 MALDI-MS에 의해 용이하다. 여기에서 우리는 비행 (TOF)의 MALDI-시간 100 kDa의보다 큰 단백질을 분석하기위한 접근 방법을 제시한다. 우리는이 행렬 (즉, 2,5 - 디 히드 록시 벤조산 및 α-시아 노 -4 - 히드 록 시신 남산)의 혼합물과 샘플 증착을위한 방법으로서 박막 방식의 유틸리티를 사용할 때의 장점을 설명한다. 또한 레이저 에너지의 교정에 사용되는 표준의 매트릭스 및 용매의 순도가 중요한 역할을 논의하고, 획득 시간. 전반적으로, 우리는 MALDI-MS에 의하여 100 kDa의 단백질보다 더 큰 손상을 분석 초보자에게 필요한 정보를 제공한다.

서로 다른 두 행렬, 두 증착 방법과 동일한 레이저 강도 (그림 1)를 사용하여 :, 우리는 그대로 단백질 (123,386 다 분자량 염색체 영역 유지 보수 1 단백질, Crm1)을 분석 하였다. SA 및 CHCA_DHB 혼합물 행렬로서 이용 하였다. 혼합물 (그림 1A 및 B) 신호 대 잡음 비의 민감도 측면에서 높은 품질의 질량 스펙트럼을 얻었다. 특히, 우리는 MALDI 대상 (그림 1C)에 부착 단백질의 0.5 pmole의를 감지 할 수 있습니다. 단백질의 동량은 SA (도 1D)을 사용하여 거의 검출이었다. 더욱이, 행렬의 혼합물을 사용하여, 행렬 증착을위한 선택의 방법은 &quot;박층&quot;접근 (도 1a)이었다. &quot;건조 액적&quot;방법을 사용하여, 우리는 질량 이상 100 kDa의 (데이터는 미도시)와 함께 임의의 단백질을 검출하지 못했다. CHCA_DHB 혼합물 (그림 1A와 1C)를 이용, 곱셈 PROTEI의 이온 충전N 축 MALDI-TOF 계기에서 최대 해상도는 m / z (26)에 반비례하기 때문에보다 높은 정밀도로 대량 판정을 가능하게 관찰되었다. 우리는 또한 단량체 베타 - 갈 락토시다 아제 (116,300 다) (그림 2)을 분석 하였다. CHCA_DHB 스펙트럼 감도와 해상도 측면에서 SA 스펙트럼보다 더 있었다. 또한, 곱셈으로 하전 된 이온 (M 2 +, 3 + M 및 M 4 +)의 존재는 우리가 더 높은 정확도를 가진 단백질의 질량 (그림 2A와 2C)를 확인 할 수있었습니다. 박층 접근법을 사용하여, 우리는 면역 글로불린, IgG에 대한 분석 (148500 다) (도 3)에 대한 CHCA_DHB 혼합물, SA 단독 α-CHCA의 성능을 비교 하였다. 우리가 다른 데이터를 상관하면 단백질 신호 높았고 CHCA_DHB 스펙트럼에서 더 나은 해상도. 결론적으로 CHCA_DHB 혼합물 및 박막 증착 방법의 사용<html> MALDI TOF 계기를 사용하여 취득한 큰 손상 단백질 질량 스펙트럼의 품질에 상당한 개선을 보였다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50635/50635fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50635/50635fig1.jpg" /> 그림 1. 123,386 다 : 본래 염색체 영역 유지 보수 1 단백질 (Crm1), 분자량의 MALDI-TOF 분석. . Crm1의) 1 pmole는 행렬 B) 양으로 DHB_CHCA 믹스를 사용하여 분석 하였다 : 1 pmole, 매트릭스 :. SA C) 양 : 0.5 pmole, 매트릭스 :. DHB_CHCA D) 양 : 0.5 pmole, 매트릭스 : SA. 피크의 신호는, 임의의 강도 단위 눈금으로 표시 한 각 스펙트럼에서 최대 값으로 정규화 본이다. PG &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/50635/50635fig2.jpg &quot;/&gt; 그림 2. 그대로 베타 - 갈 락토시다 아제 (116,300 다)의 MALDI-TOF 분석. A) 양 : 20 pmole의, 매트릭스 DHB_CHCA B) 양 :. 20 pmole의, 매트릭스 :. SA C) 금액 : 5 pmole의, 매트릭스 :. DHB_CHCA D) 양 : 5 pmole의, 매트릭스 : SA. <img alt="그림 3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50635/50635fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50635/50635fig3.jpg" /> 그림 3. 그대로 면역 글로불린 IgG에 (148,500 다)의 MALDI-TOF 분석, 양 :. 1.7 pmole의 스펙트럼 CHCA_DHB 혼합물을 사용하여 얻은 훨씬 더 강렬했다 (최대 : 8200 임의 단위 AU) SA 스펙트럼 이상 (최대 1,200 AU) 및 α-CHCA 스펙트럼 (최대 : 4500 AU)

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Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

정확한 질량 측정이 단백질의 조사 기간 동안 중요한 단계를 나타냅니다. 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI) 질량 분석 (MS)은 이러한 결정을 위해 사용될 수 있고, 그것의 주요 장점은 염, 세제 및 오염물에 대한 내성이다. 여기에서 우리는 MALDI-MS 100 kDa의보다 큰 단백질의 분석을위한 접근 방법을 보여줍니다.

비행의 레이저 탈착 / 이온화 시간 본래대로 단백질의 (MALDI-TOF) 질량 분광 분석 매트릭스를 이용한 큰 100 kDa의

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass ...

matrix-assisted-laser-desorptionionization-time-flight-maldi-tof-mass

Research

JoVE Journal

Chemistry

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

80.1K 조회수.  Université J. Fourier.  정확한 질량 측정이 단백질의 조사 기간 동안 중요한 단계를 나타냅니다. 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI) 질량 분석 (MS)은 이러한 결정을 위해 사용될 수 있고, 그것의 주요 장점은 염, 세제 및 오염물에 대한 내성이다. 여기에서 우리는 MALDI-MS 100 kDa의보다 큰 단백질의 분석을위한 접근 방법을 보여줍니다. 

비디오: Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry

The mammalian integument includes sebaceous glands that secrete an oily material onto the skin surface. Sebum production is part of the innate immune system that is protective against pathogenic microbes. Abnormal sebum production and chemical composition are also a clinical symptom of specific skin diseases. Sebum contains a complex mixture of lipids, including triacylglycerides, which is species-specific. The broad chemical properties exhibited by diverse lipid classes hinder the specific determination of sebum composition. Analytical techniques for lipids typically require chemical derivatizations that are labor-intensive and increase sample preparation costs. This paper describes how to extract lipids from mammalian integument, separate broad lipid classes by thin-layer chromatography, and profile the triacylglyceride contents using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. This robust method enables a direct determination of the triacylglyceride profiles among species and individuals, and it can be readily applied to any taxonomic group of mammals.

Mammalian integument contains solvent-extractable lipids that can provide chemical compositions characteristic of individual species. This paper presents a routine method for separating broad lipid classes isolated from integumentary tissues using thin layer chromatography and determining the triacylglyceride profile by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.

제조 박층 크로마토 그래피 및 MALDI-TOF 질량 분석에 의해 박쥐 외피 지질의 Triacylglyceride 내용을 프로파일 링

The mammalian integument includes sebaceous glands that secrete an oily material onto the skin surface. Sebum production is part of the innate immune ...

연구

화학

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for characterizing lyophilized formulations of protein therapeutics. Labeling followed by suitable proteolytic digestion allows the protein structure and interactions to be mapped with peptide-level resolution. Since the protein structural elements are stabilized by a network of chemical bonds from the main-chains and side-chains of amino acids, specific labeling of atoms in the amino acid residues provides insight into the structure and conformation of the protein. In contrast to routine methods used to study proteins in lyophilized solids (e.g., FTIR), ssHDX-MS and ssPL-MS provide quantitative and site-specific information. The extent of deuterium incorporation and kinetic parameters can be related to rapidly and slowly exchanging amide pools (Nfast, Nslow) and directly reflects the degree of protein folding and structure in lyophilized formulations. Stable photolytic labeling does not undergo back-exchange, an advantage over ssHDX-MS. Here, we provide detailed protocols for both ssHDX-MS and ssPL-MS, using myoglobin (Mb) as a model protein in lyophilized formulations containing either trehalose or sorbitol.

Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.

질량 분석은 동결 건조 분말에서 단백질의 구조와 상호 작용을 연구하는 접근

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

고 분해능 질량 분석을 결합 하는 보조 Nanoelectrospray 이온화를 사용 하 여 실시간 호흡 분석

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group analysis as matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). This tutorial demonstrates methods for optimization of the sample preparation, spectral acquisition, and data analysis of synthetic polymers using MALDI-TOF MS. Critical parameters during sample preparation include the selection of the matrix, identification of an appropriate cationization salt, and tuning the relative proportions of the matrix, cation, and analyte. The acquisition parameters, such as mode (linear or reflector), polarization (positive or negative), acceleration voltage, and delay time, are also important. Given some knowledge of the chemistry involved to synthesize the polymer and optimizing both the data acquisition parameters and the sample preparation conditions, spectra should be obtained with sufficient resolution and mass accuracy to enable the unambiguous determination of the end groups of most homopolymers (masses below 10,000) in addition to the repeat unit mass and the overall molecular weight distribution. Though demonstrated on a limited set of polymers, these general techniques are applicable to a much wider range of synthetic polymers for determining mass distributions, though end group determination is only possible for homopolymers with narrow dispersity.

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometry

A protocol for the matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) characterization of synthetic polymers is described including the optimization of sample preparation, spectral acquisition, and data analysis.

매트릭스를 통해 합성 고분자의 특성화 지원 레이저 탈 착 이온화 시간의 비행 (TOF MALDI) 질량 분석

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group ...

An Efficient Sample Preparation Method to Enhance Carbohydrate Ion Signals in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Sample preparation is a critical process in mass spectrometry (MS) analysis of carbohydrates. Although matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) MS is the method of choice in carbohydrate analysis, poor ion signal and data reproducibility of carbohydrate samples continue to be severe problems. For quantitative analysis of carbohydrates, an effective analytical protocol providing superior data quality is necessary. This video demonstrates sample preparation protocols to improve signal intensity and minimize data variation of carbohydrates in MALDI-MS. After drying and crystallization of sample droplets, the crystal morphology is reformed by methanol before mass spectrometric analysis. The enhancement in carbohydrate signal is examined with MALDI imaging mass spectrometry (IMS). Experimental results show that crystal reformation adjusts crystalline structures and redistributes carbohydrate analytes. In comparison with the dried droplet preparation method in conventional MALDI-MS, reforming carbohydrate crystal morphologies with methanol shows significantly better signal intensity, ion image distribution, and data stability. Since the protocols demonstrated herein do not involve changes in sample composition, they are generally applicable to various carbohydrates and matrixes.

A protocol for enhancing carbohydrate ion signals in MALDI mass spectrometry by reforming crystalline structures during sample preparation processes is demonstrated.

매트릭스 보조 레이저 탈 착/이온화 질량 분석에서 탄수화물 이온 신호를 강화 하는 효율적인 샘플 준비 방법

Sample preparation is a critical process in mass spectrometry (MS) analysis of carbohydrates. Although matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) ...

Imaging Corrosion at the Metal-Paint Interface Using Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS), illustrating that SIMS is a suitable technique to study the chemical distribution at a metal-paint interface. The painted Al alloy coupons are immersed in a salt solution or exposed to air only. SIMS provides chemical mapping and 2D molecular imaging of the interface, allowing direct visualization of the morphology of the corrosion products formed at the metal-paint interface and mapping of the chemical after corrosion occurs. The experimental procedure of this method is presented to provide technical details to facilitate similar research and highlight pitfalls that may be encountered during such experiments.

Time-of-flight secondary ion mass spectrometry is applied to demonstrate the chemical mapping and corrosion morphology at the metal-paint interface of an aluminum alloy after being exposed to a salt solution compared with a specimen exposed to air.

비행 시간 보조 이온 질량 분석기를 사용 하 여 금속 페인트 인터페이스의 이미징 부식

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass ...

Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass spectrometry (MS) of complex molecules and their reactions on surfaces. DINeC is based on a beam of SO2 clusters impacting on the sample surface at low cluster energy. During cluster-surface impact, some of the surface molecules are desorbed and ionized via dissolvation in the impacting cluster; as a result of this dissolvation-mediated desorption mechanism, low cluster energy is sufficient and the desorption process is extremely soft. Both surface adsorbates and molecules of which the surface is composed of can be analyzed. Clear and fragmentation-free spectra from complex molecules such as peptides and proteins are obtained. DINeC does not require any special sample preparation, in particular no matrix has to be applied. The method yields quantitative information on the composition of the samples; molecules at a surface coverage as low as 0.1 % of a monolayer can be detected. Surface reactions such as H/D exchange or thermal decomposition can be observed in real-time and the kinetics of the reactions can be deduced. Using a pulsed nozzle for cluster beam generation, DINeC can be efficiently combined with ion trap mass spectrometry. The matrix-free and soft nature of the DINeC process in combination with the MSn capabilities of the ion trap allows for very detailed and unambiguous analysis of the chemical composition of complex organic samples and organic adsorbates on surfaces.

Neutral SO2 clusters of low kinetic energy (&#60; 0.8 eV/constituent) are used to desorb complex surface molecules such as peptides or lipids for further analysis by means of mass spectrometry using an ion trap mass spectrometer. No special sample preparation is required, and real-time observation of reactions is possible.

클러스터 유도 탈착/이온화 질량 분광법에 의한 표면에 대한 복잡한 분자 및 표면의 반응 분석

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass ...

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain using antibiotic induction, and identified by MALDI-TOF-TOF tandem mass spectrometry and top-down proteomic analysis with software developed in-house. The immunity protein of colicin E3 (Im3) and the immunity protein of bacteriocin (Im-Bac) were identified from prominent b- and/or y-type fragment ions generated by the polypeptide backbone cleavage (PBC) on the C-terminal side of aspartic acid, glutamic acid, and asparagine residues by the aspartic acid effect fragmentation mechanism. The software rapidly scans in silico protein sequences derived from the whole genome sequencing of the bacterial strain. The software also iteratively removes amino acid residues of a protein sequence in the event that the mature protein sequence is truncated. A single protein sequence possessed mass and fragment ions consistent with those detected for each immunity protein. The candidate sequence was then manually inspected to confirm that all detected fragment ions could be assigned. The N-terminal methionine of Im3 was post-translationally removed, whereas Im-Bac had the complete sequence. In addition, we found that only two or three non-complementary fragment ions formed by PBC are necessary to identify the correct protein sequence. Finally, a promoter (SOS box) was identified upstream of the antibacterial and immunity genes in a plasmid genome of the bacterial strain.

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

Here we present a protocol for the rapid identification of proteins produced by genomically sequenced pathogenic bacteria using MALDI-TOF-TOF tandem mass spectrometry and top-down proteomic analysis with software developed in-house. Metastable protein ions fragment because of the aspartic acid effect and this specificity is exploited for protein identification.

MALDI-TOF-TOF-MS/MS 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 대장균에 있는 항균 면역 단백질의 식별

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of protein therapeutics and the determination of the conformational transition pathways critical for biological functions, ranging from molecular recognition to enzymatic catalysis. Hydrogen/deuterium exchange (HDX) reaction coupled with top-down mass spectrometric (MS) analysis provides a means to characterize protein higher-order structures and dynamics in a conformer-specific manner. The conformational resolving power of this technique is highly dependent on the efficiencies of separating protein states at the intact protein level and minimizing the residual non-deuterated protic content during the HDX reactions. 
Here we describe a capillary electrophoresis (CE)-based variant of the HDX MS approach that aims to improve the conformational resolution. In this approach, proteins undergo HDX reactions while migrating through a deuterated background electrolyte solution (BGE) during the capillary electrophoretic separation. Different protein states or proteoforms that coexist in solution can be efficiently separated based on their differing charge-to-size ratios. The difference in electrophoretic mobility between proteins and protic solvent molecules minimizes the residual non-deuterated solvent, resulting in a nearly complete deuterating environment during the HDX process. The flow-through microvial CE-MS interface allows efficient electrospray ionization of the eluted protein species following a rapid mixing with the quenching and denaturing modifier solution at the outlet of the sprayer. The online top-down MS analysis measures the global deuteration level of the eluted intact protein species, and subsequently, the deuteration of their gas-phase fragments. This paper demonstrates this approach in differential HDX for systems, including the natural protein variants coexisting in milk.

Presented here is a protocol for a capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange (HDX) approach coupled with top-down mass spectrometry. This approach characterizes the difference in higher-order structures between different protein species, including proteins in different states and different proteoforms, by conducting concurrent differential HDX and electrophoretic separation.

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

Neuropeptides are signaling molecules that regulate almost all physiological and behavioral processes, such as development, reproduction, food intake, and response to external stressors. Yet, the biochemical mechanisms and full complement of neuropeptides and their functional roles remain poorly understood. Characterization of these endogenous peptides is hindered by the immense diversity within this class of signaling molecules. Additionally, neuropeptides are bioactive at concentrations 100x - 1000x lower than that of neurotransmitters and are prone to enzymatic degradation after synaptic release. Mass spectrometry (MS) is a highly sensitive analytical tool that can identify, quantify, and localize analytes without comprehensive a priori knowledge. It is well-suited for globally profiling neuropeptides and aiding in the discovery of novel peptides. Due to the low abundance and high chemical diversity of this class of peptides, several sample preparation methods, MS acquisition parameters, and data analysis strategies have been adapted from proteomics techniques to allow optimal neuropeptide characterization. Here, methods are described for isolating neuropeptides from complex biological tissues for sequence characterization, quantitation, and localization using liquid chromatography (LC)-MS and matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MS. A protocol for preparing a neuropeptide database from the blue crab, Callinectes sapidus, an organism without comprehensive genomic information, is included. These workflows can be adapted to study other classes of endogenous peptides in different species using a variety of instruments.

Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

Mass spectrometric characterization of neuropeptides provides sequence, quantitation, and localization information. This optimized workflow is not only useful for neuropeptide studies, but also other endogenous peptides. The protocols provided here describe sample preparation, MS acquisition, MS analysis, and database generation of neuropeptides using LC-ESI-MS, MALDI-MS spotting, and MALDI-MS imaging.

Callinectes sapidus의 신경 펩티드에 대한 다각적 질량 분광 조사

Neuropeptides are signaling molecules that regulate almost all physiological and behavioral processes, such as development, reproduction, food intake, and ...