우리는 유용한 논의 위해 우리의 동료를 감사합니다. 우리 또한 단백질 복합물을 제공 하기 위한 Ilme Schlichting 그리고 칼 피터 Hopfner을 감사 합니다. 우리는 교육 및 연구를 위한 연방 내각에서 자금을 인정 (BMBF, ZIK 프로그램, 03Z22HN22), 유럽 지역 개발 기금 (EFRE, ZS/2016/04/78115)와 MLU C.S. 및 Wellcome 트러스트 (109854/658에서에서 자금 할레 비 텐 베르크 Z/15/Z) 하 되

저자는 공개 없다.

프로토콜은 다 소 단위 단백질 복합물의 질량 분석 기반 구조 분석을 위해 제공 됩니다. 프로토콜에 설명 된 두 가지 기술을 대부분 보완 결과 제공 하 고 단백질에서 구조적 배열에 대 한 통찰력을 얻을 수 있다 (-ligand) 단지 기존의 구조 기술을 하 여 공부 하기 어려운. 네이티브 질량 분석 subcomplexes 및 안정적인 상호 작용 모듈을 분석 하 여 상호 작용 단백질으로 서 단백질 stoichiometries에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 교차 연결, 다른 한편으로, 직접 접촉 사이트에 대 한 정보를 얻을 수 있습니다. 사용 cross-linker 따라 특정 유연성 수 또는 분석에 포함 되어야 합니다.
제공 된 프로토콜 수행 하기 쉽고 하지 시간이 일반에 있습니다. 전체 프로토콜 일주일 내에서 실행 될 수 있습니다 하 고 있지만, 복잡 한 단백질의 일정 금액은 성공적인 분석에 필요한 거의 모든 단백질 복합물에 적용할 수 있습니다. 샘플 준비 간단 하 고 구체적으로 순화 된 단백질 복합물을 필요 하지 않습니다. 그러나, 하나의 범하기 오염 샘플의 질량 분석 기반 단백질 식별에 대 한 샘플 준비 중입니다. 대부분의 경우에서 이러한 오염 먼지, 피부, 또는 머리에서 기인 하는 keratins를 포함 합니다. 따라서, 장갑 및 실험실 외 투를 입고 같은 여분 배려, 수성 버퍼도 고 순도 용 매를 사용 하 여 취해야 한다 질량 분석 기반 단백질 식별에 대 한 샘플 준비 중. 선호도 태그를 사용 하는 경우 보호자 등 다른 오염 단백질은 일반적으로 단백질 정화, 예를 들면, 동안 소개 합니다. 이러한 경우에 단백질 정화 개선 되어야 합니다, 예를 들어 세척 단계를 증가 시켜. 어떤 경우에, 단백질 오염 샘플에는 쉽게 식별 데이터베이스 검색 동안 분류 필터를 생략 하 여 (즉, 모든 종에서 단백질에 대 한 검색). 경우에 몇 가지 펩 티 드 관찰 된다 (즉, 낮은 단백질 범위 얻어질 수), 비록 충분 한 샘플을 사용할 수 있는 그것은 다른 성분을 사용 하 여 소화 하는 동안 해야 할 수도 있습니다. 트립 신 펩 티 드;의 충분 한 번호를 생성 하는 일반적 그러나, 경우에 따라 막 단백질 또는 단백질의 막 도메인 등 tryptic 분열 사이트의 수는 감소 하 고 소수 성 아미노산을 대상으로 하는 다른 효소는 더 나은 선택 키를 누릅니다.
계측, 측면에서 특히 수정 된 악기는 가스 상으로 전송 하는 동안 공유 비 상호 작용을 유지 하는 기본 질량 분석에 대 한 필요 합니다. 여러 악기 종류, Q ToF orbitrap 악기를 포함 하 여 도입 되었습니다. 수정된 Q ToF 질량 분석기를 상업적으로 사용할 수 있는 기본 질량 분석에 대 한 몇 년 이후 후자 최근에 소개한 고 대부분의 경우에서 특수 수정45필요. 그러나, 고해상도 악기의 응용 프로그램 공부 하는 여러 개의 ligands 및 그들의 부 량46,47 바인딩을 허용 하 고 미래의 어플리케이션을 위해 유망.
액체 크로마토그래피 결합 질량 분석에 의해 상호 연결 된 디 펩 티 드를 식별 하기 위해 몇 가지 수정 된 표준 절차를 적용할 수 있습니다. 그러나, 데이터베이스 검색 제한 하는 요인이 전문된 소프트웨어는 거의 큰 데이터베이스를 다룰 수 있는 그리고 감소 된 데이터베이스는 복합물의 단백질 소 단위를 포함 하는 필요 이다. 최근 연구 질량 분석 쪼갤 cross-linkers 사용 전체 세포 lysates48,49상호 작용 단백질을 대상으로. 탠덤 질량 분석 실험에서 주로 조각 화학 cross-linkers 사용 하 여 선형 펩 티 드 (는 cross-linker에 의해 수정), 추가 조각화로 식별 될 수 및 데이터베이스 검색 선형 펩 티 드, 그리고이 감소 검색 시간과 전산 검색 공간입니다. 그러나, 이러한 실험을 수행 하는 이온 트랩 질량 분석기 또는 이온 함정으로 하이브리드 질량 분석기가 필요 합니다. 일반적으로, 거짓인 중요 한 문제는, 교차 결합 된 펩 티 드의 질량 스펙트럼 종종 유효성이 검사 됩니다 수동으로 데이터 분석 시간을 엄청나게 확장 그들의 조각 스펙트럼의 품질에 의해. 추가 유효성 검사 단계는 그러므로 잠재적인 미래의 응용 프로그램 없이 적용 될 수 있는 강력한 득점 시스템을 개발. 데이터 분석을 개선 하 고 가양성의 수를 줄이는 한 가지 방법은 틀린 발견 비율 계산 및 그들의 응용 프로그램 데이터 세트50cross-linking를 소개 했다.
일반적으로, 여기서 설명 질량 분석 기술을 더 보충 될 수 있다 (예를 들어, 공유 라벨) 분석에서 출력을 높일. 다른 수정 및 프로토콜의 개선 쉽게 구현할 수 있습니다. 같은 비교 가교34 단백질 조립에 구조적 변화를 unravels. 네이티브 질량 분석에서 더 개발 요즘 막 단백질51,52 의 분석 및 지질28,,5253,54 와 그들의 상호 작용 허용 . 기본 질량 분석에 대 한 고해상도 질량 분석기의 새로운 개발 응용 프로그램 및 ligand 바인딩 예, 지질 막 단백질의 바인딩 확장, 지금 분석45, 에 포함 될 수 있습니다. 46. 전산 모델링 접근법과 함께, 이러한 기술을 다양 한 해상도55의 구조 모델을 제공할 수 있습니다. 없는 크리스탈 구조 그대로 복잡 한 또는 단일 하위 단위에 사용할 수 있는 경우에, 질량 분석 단백질 상호 작용 및 알 수 없는 복잡 한 토폴로지에 첫 번째 통찰력을 제공할 수 있습니다. 사용 하는 기법에 따라 얻은 결과, 알 수 없는 복잡 한 저해상도 모델56,,5758얻어질 수 있다. 크리스탈 구조 또는 상 동 모델을 사용할 수 경우 질량 분석에서 받은 구조 정보도 근처 기본 모델59를 얻을 수 있습니다.
다른 구조 기법을 비교 하 여 질량 분석 장점이 낮은 샘플 금액 필요, 그것은 이기종 샘플을 취급할 수 있다 하 고 무제한 크기의 단백질 복합물에 적용 됩니다. 또한, 질량 분석 동적인 단백질 시스템의 조사 수 있습니다. 솔루션에 존재 하는 단백질 또는 단백질 복합물의 다른 인구 일반적으로 함께 분석 하 고 따라서 달리 특정 집단의 선택이 필요한 다른 구조 기술로 모든 conformations 유지 됩니다 동안 분석 하 고 한 실험에서 평가할 수 있는 있습니다. 정량적 상호 접근 최근에 소개 된34,,6061 고 다른 조건 하에서 구조적 변화를 설명 하는 미래의 응용 프로그램에 대 한 약속.

단백질 어셈블리의 구조 조사 세포질 과정의 이해에 대 한 특히 중요 되고있다. 따라서, 많은 기술을 개발 하 고 되었습니다 구조 생물학1에 향상. 그러나, 이러한 기술은 때로는 크기, 유연성, 또는 조사를 받고 단백질 복합물의이 그들의 응용 프로그램에 제한 됩니다. 질량 분석 이러한 문제를 해결할 수 있습니다 그리고, 따라서, 구조 생물학2,3,,45에 강력한 도구로 등장. 그러나 질량 분석의 가장 큰 장점은, 복잡 하 고 이질적인 혼합물6에 단백질을 명확 하 게 식별 하는 기능입니다. 이 위해 단백질은 일반적으로 endoproteinases로 소화 하 고 결과 펩 티 드 혼합물은 액체 크로마토그래피에 의해 분리 및 질량 분 서 계에 직접 eluted. 펩 티 드 질량 결정 이후에 고 선구자 이온은 펩 티 드의 추가 조각화에 대 한 선택 됩니다. 단백질 다음 검색 펩 티 드 및 알려진된 데이터베이스에 대해 해당 조각 대 중에 의해 식별 됩니다. 이 절차는 뿐만 아니라 전조 펩 티 드 및 수정7운반 조각 이온의 질량 변화를 일으킬 그들의 포스트 번역 상 수정 단백질/펩 티 드의 id를 허용 한다. 구조 질량 분석에 많은 기술 중 일부는이 원리4,8을 기반으로 합니다. 예를 들어, 수소 중수소 교환9,10등 기법 라벨, 화학 라벨 전략11,12또는 수 산 기 과격 한 발 인쇄13,14 , 특정 조건 하에서 단백질의 표면 접근에 통찰력을 제공.
또 다른 기술은 이다 (화학) 그들의 기능 그룹을 통해 가까운 근접에서 아미노산의 공유 결합을 포함 하는 교차 연결. 이 위해, 화학 시 약, UV 활성화 시 약, 또는 아미노산 고용된15,16이다. Cross-linking, 후 단백질은 프로 테아 제와 분해 일반적으로 하 고 상호 연결 된 디 펩 티 드 액체 크로마토그래피 결합 질량 분석에 의해 분석 된다. 그러나 데이터베이스 검색, 상호 상품의 식별은, 전문된 소프트웨어는 다양 한 단백질과 이질적인 지역17,,1819의 펩 티 드 시퀀스를 연결 하 여 사용을 해야 합니다. 화학 cross-linkers 사용 하 여 장점이 그것의 거의 모든 단백질 복합물을 채택 될 수 있다 하 고 호스트 세포의 단백질을 표현 하는 때에 달성 될 수 있는 UV 가능한 아미노산의 결합을 필요로 하지 않습니다. 이와 같이, cross-linking는 다양 한 도구 및 대형 단백질 어셈블리20의 많은 구조 연구에 성공적으로 고용 되었다.
그대로 단백질 복합물 ('기본' 질량 분석), 다른 한편으로의 질량 분석 펩 티 드에 그대로 단백질이 수 분해 없이 단백질 복합물의 분석을 포함 한다. 그것은 구성,이 질, 산출할, 토폴로지 및 소 단위 단백질 단지21,22의 상호 작용을 보여준다. 함께 이온 이동성, 네이티브 질량 분석 추가 그들의 구조23,24의 결정을 허용 한다. 이것은 기존의 구조적 기법으로 평가 하기 어려운 단백질 복합물의 구조상 조사를 위한 강력한 도구. 그러나, 네이티브 질량 분석 분석 버퍼를 분무 이온화 동안 비 공유 단백질 상호 작용을 유지 하는 필요 합니다. 이것은 일반적으로 암모늄 아세테이트25같은 수성, 휘발성 버퍼를 사용 하 여 달성 된다. 또한, 악기 수정 질량 분 서 계26의 가스 단계에 전송 하는 동안 분리를 방지 하기 위해 필요 하다. 이 방법으로 적용, 많은 (큰) 단백질 복합물 분석 되었다. 인상적인 그대로 리보솜27, ATP synthases28또는 바이러스29의 연구는 있습니다.
네이티브 질량 분석 그리고 cross-linking의 조합 이전 연구에서 특히 성공적 이었다. 예를 들어, 예기치 않은 Hsp70 이합체를 포함 한 보호자 단지의 stoichiometries 얻을 수 그대로 단백질 복합물의 질량 분석 실험에서 화학 cross-linking 공개에 단백질의 준비 하는 동안은 어셈블리30,31 다른 연구에서의 복잡 한 그대로 ATP synthase에 포스트 번역 상 수정 결과 공부 했다. 네이티브 질량 분석 인 산화 또는 acetylation32,33의 유무에서 단백질 복잡 한 안정성에 대 한 통찰력을 제공합니다. 비교 상호 전략34 는 다음 다른 조건 하에서 복잡 한 단백질의 구조적 변화를 밝혔다.
여기, 우리가 질량 분석, (화학) cross-linking 및 네이티브 질량 분석, 데이터 분석 및 해석 (그림 1)를 포함 하 여 단백질 식별 프로토콜 제공 합니다. 두 잘 특징이 단백질 복합물의 도움으로이 방법에서 얻은 보완 결과의 조합은 시연된35입니다. 우리의 프로토콜 특정 순도 농도에 순화 될 수 있는 어떤 단백질 어셈블리에 적용할 수 있습니다. 접근은 데이터 분석의 cross-linking 데이터, 즉, 데이터베이스의 크기에 의해 제한 하는 어떤 경우에 고용, 필요한 검색 공간 및 시간을 결정 하. 또한, 확인된 상호 링크의 수동 유효성 검사 자주 필수 이며 출력 줄어듭니다. 네이티브 질량 분석 샘플 품질, 예를 들어, 버퍼에 의해 주로 제한 됩니다 및 adducts 수성 및 휘발성 버퍼에 의해 교환 하 정화 가능성 중에 사용 된. 그러나, 일반적으로 구조 분석을 위해 순화 하는 단백질 복합물은 우리의 프로토콜 성공적인 분석에 필요한 품질을가지고.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Reagents, Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695092</td>
			<td>pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile Optima LC/MS</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A955-1</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra centrifugal devices (different MWCO)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>i.e. UFC500396</td>
			<td>buffer exchange, concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2706</td>
			<td>native MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9859</td>
			<td>pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d0 (BS3-d0)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21590</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis(Sulfosuccinimidyl)suberate-d4 (BS3-d4)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21595</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caesium iodide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>203033</td>
			<td>calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries (1.0 OD &#215; 0.78 ID &#215; 100 L mm)</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>30-0038</td>
			<td>native MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disuccinimidyl suberate (DSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21655</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5545</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>BP2818</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid Optima LC/MS</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>solvent supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Blue Coomassie staining solution</td>
			<td>expedeon</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td>staining solution for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen NuPAGE 4-12% Bis-Tris gels (1 mm, 10 well)</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td>In-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol, HPLC grade</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>P750717</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemicals</td>
			<td>A456-212</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BioSpin 6 columns</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>732-6222</td>
			<td>buffer exchange</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Antioxidant</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td>running buffer, gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4 &#215;)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>sample loading buffer (non-reducing) for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MES SDS Running buffer</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>NP0001</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MOPS SDS Running buffer</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>NP0001</td>
			<td>gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10 &#215;)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0004</td>
			<td>reducing Agent for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS - phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeeBlue Plus2 Prestained Standard Protein Marker</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>LC5925</td>
			<td>prestained Protein Marker for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>ethanol precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>TRYPSEQ-RO (11418475001)</td>
			<td>in-gel digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin centrifugal devices (different MWCO)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>i.e. VS0101</td>
			<td>buffer exchange, concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water for HPLC</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>270733-2.5L-M</td>
			<td>solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Heraeus Fresco 21, bench-top centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming / Brown Micropipette puller Model P-1000</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelelectrophoresis chamber Xcell SureLock MiniCell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Coater Quorum Q150R S</td>
			<td>Quorum Technologies Ltd.</td>
			<td>Q150RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal gel shaker Rotamax 120 T</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>544-41200-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-TOF Ultima mass spectrometer, MS Vision high mass upgrade</td>
			<td>Waters (Micromass)</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversed-phase C18 analytical column Acclaim PepMap (C18, 75 mm I.D., 50 cm, 3 mm pore size)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reversed-phase C18 pre-column (C18, 150 mm I.D., 2 cm, 5 mm pore size)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scalpel</td>
			<td>Fisher Scientifc</td>
			<td>10463989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac SPD121P vacuum centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SPD121DP-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers AA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z680184-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner USC-TH, sonication bath</td>
			<td>VWR</td>
			<td>142-0084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate Dionex 3000 nano-LC system, coupled to Q-Exactive plus hybrid mass spectrometer (nano-ESI source)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>0726030+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software, Software Tools, Database search</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mascot</td>
			<td>www.matrixscience.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Massign</td>
			<td>http://massign.chem.ox.ac.uk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx</td>
			<td>Micromass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassMatrix</td>
			<td>Xu, H. J Proteome Res. 9 (2010)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant</td>
			<td>Cox, J. Nat. Biotechn. 26 (2008)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLink</td>
			<td>Yang, B. Nat Methods 9 (2012)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pXtract conversion tool</td>
			<td>http://pfind.ict.ac.cn/downloads.html</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UniDec</td>
			<td>Marty, M.T. Anal. Chem. 87 (2015)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCalibur</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XiNET</td>
			<td>http://crosslinkviewer.org</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLinkX</td>
			<td>Liu, F. Curr Op Struct Biol 35 (2015)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xQuest</td>
			<td>Rinner, O. Nat Methods 5 (2008)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xvis</td>
			<td>https://xvis.genzentrum.lmu.de</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining chemical cross-linking and mass spectrometry of intact protein complexes to study the architecture of multi-subunit protein assemblies

단백질은 다양 한 세포 기능을 수행 하는 형태로 활성 및 동적 어셈블리에 그들의 ligands와 상호 작용. 이러한 상호 작용을 elucidating 따라서 세포질 과정의 이해에 대 한 근본 이다. 그러나, 많은 단백질 복합물 동적 어셈블리 이며 기존의 구조적 기법에 의해 액세스할 수 있습니다. 이러한 어셈블리의 구조 조사에 기여 하는 질량 분석 그리고 특히 다양 한 대량 spectrometric 기술의 조합 그들의 구조 배열에 대 한 귀중 한 통찰력을 제공 합니다.
이 문서에서는, 우리는 응용 프로그램 및 두 개의 상호 보완적인 대량 spectrometric 기술의 조합 설명, 즉 화학 cross-linking 및 결합 된 질량 분석 기본 질량 분석. 화학 cross-linking 화학 시 약을 사용 하 여 근접에서 아미노산의 공유 결합을 포함 한다. 프로 테아 제, 소화 후 복사해올된 디 펩 티 드 질량 분석에 의해 식별 하 고 단백질 상호 작용 사이트 적용 되지 않습니다. 네이티브 질량 분석은 다른 한편으로 질량 분석기의 가스 단계에서 그대로 단백질 어셈블리의 분석 이다. 그것은 단백질과 리간드 상호 작용으로 단백질 stoichiometries를 보여준다. 두 기술을 따라서 단백질-리간드 어셈블리 및 그들의 조합 이전 연구에서 강력한 입증의 구조에 대 한 보완 정보를 제공 합니다.

단백질 및 그들은 단지의 구조 분석은 그들의 기능을 이해 하기 위한 기본적 이다. 질량 분석에 그것의 크기에 관계 없이 거의 모든 단지에 적용 될 수 또는 샘플 구조 조사에 상당히 기여 합니다. 우리 두 잘 특징이 단백질 복합물;를 사용 하 여 프로토콜을 예증 첫째, C. thermophilum 및 두 번째, 대장균에서 복잡 한 이종 octameric CPS hetero-dodecamer RvB1/B2.
첫째, 우리는 두 단지의 단백질 구성 요소 식별. 이 단백질은 SDS 페이지 (그림 2) 구분 및 젤 밴드는 젤에서 삭감. 젤 소화 단백질의, 후에 펩 티 드 혼합물은 액체 크로마토그래피 결합 질량 분석에 의해 분석 하 고 펩 티 드 및 조각 대 중 데이터베이스 검색 대상이 됐다. 이 워크플로 따라 우리는 자신감과 높은, 즉, 두 단지의 모든 단백질 소 단위 식별 합리적인 펩 티 드와 펩 티 드의 높은 수 저조한 모든 단백질 소 단위 (표 1에 대 한 높은 시퀀스 범위 관찰 되었다 ).
우리는 다음 기본 질량 분석 (그림 3A)으로 그대로 RvB1/b 2 복잡 한 분석. 질량 스펙트럼 밝혀 두 종, 약 8000 m/z 에 한 약 11000-12000 m/z에서 또 다른 종. 이 종족에 대 한 계산된 대 중 hexameric (RvB1)3(RvB2)3 링 (약 310 kDa)와 dodecameric 더블 반지 (RvB1)6(RvB2)6 (약 620 kDa)에 해당합니다. 두 피크 시리즈 보기 두 인구; 이 단지에서 그의 태그 및 태그 RvB2 subunits의 혼합물에서 유래. RvB1/B2 복잡 한에 대 한 결정 구조36 얻은 이전 하 고 더블 반지 (그림 3B)의 배치를 보여줍니다. 네이티브 질량 스펙트럼 따라서 그대로 dodecamer의 산출할 확인 하 고 또한 안정적인 하위 복잡 한을 계시 한다. 또한, 공동 기존의 인구 식별 됩니다.
RvB1/b 2의 복잡 한 단백질 상호 작용 사이트를 식별 하려면 우리는 화학적 BS3 cross-linker와 순화 된 복잡 한 십자가. 우리는 먼저 가교 반응 최적 농도 결정 하는 동안 BS3 양의 적정. BS3은 아민 전용 및 covalently 링크 리 사이드 체인으로 단백질의 N termini. 가교 반응 SDS 페이지 (그림 2A)으로 뒤를 이었다. 교차 연결 된 복잡 한 RvB1 및 RvB2 소 단위를 보였다. 높은 분자량에서 단백질 밴드의 결과로 단백질의 공유 결합을 발생 BS3 반응 혼합물에 추가 합니다. SDS 젤 크로스 연결 비 단백질 소 단위는 감소 하는 동안 증가 양의 BS3 복사해올 종의 더 높은 금액을 얻을 보여줍니다. 우리는 다음 젤에서 단백질 밴드를 잘라 고 단백질 상호 작용 사이트를 식별 하려면 위에 제공 된 프로토콜을 따 랐 다. 교차 연결 된 디 펩타이드의 예제 스펙트럼 (그림 3C) 표시 됩니다. 스펙트럼 표시 두 펩 티 드를 확인 하는이 단백질 상호 작용의 y 이온 시리즈 합니다. 전체에서 우리가 얻은 subunits RvB1 및 RvB2 및 RvB2의 두 복사본 간의 두 크로스 링크 사이 4 개의 크로스 링크를 포함 하 여 14 단백질 상호 작용, (표 2). Cross-linking BS3에서 결과 다른 소 단위 사이 상호 작용 분자 내 상호 작용을 보여주는 상호 작용 네트워크 (그림 3D)에서 시각화 됩니다. 내부 분자 상호 링크 RvB1 및 RvB2 소 단위 N와 C 맨끝 도메인 가까이 있는 방식으로 이동 것이 좋습니다. 참고, 그 내부 분자 상호 작용 수 없습니다 구분할 수 같은 소 단위의 간 분자 상호 작용에서이 경우에. 2 개의 소 단위 사이 분자 간의 상호 링크 또한 관찰 되었다. 이들의 RvB1와 RvB2 사이 두 분자 간의 상호 링크 상호 접근의 유효성을 검사 하는 구조에서 구상 될 수 있습니다. 다른 간 분자 상호 링크는 결정 구조에 포함 되지 않은 유연한 루프에 있습니다. 우리는 또한 포함 하는 동일한 펩 티 드 순서 RvB2에 두 상호 링크 확인. 이 크로스 링크 명확 하 게 분류할 수 있습니다으로 간 분자 같은 단백질 (그림 3D)의 두 복사본에서 발생 해야 합니다. 우리의 상호 실험 또한 기존 결정 구조 (그림 3B)에 의해 확인 될 수 있는 그들의 구조 배열에 대 한 통찰력을 제공 하는 단백질 소 단위 내에서 뿐만 아니라 단지 내에 단백질 상호 작용 사이트 공개.
우리가 공부 하는 두 번째 단백질 복잡 한 CPS를 했다. 네이티브 질량 스펙트럼 (그림 4A) 6000 그리고 12000 m/z사이 3 개의 단백질 복합물을 계시 했다. 640 kDa의 가장 큰 복잡 한 그대로 hetero octamer에 해당합니다. 작은 단지 대표 두 하위 복합물; 크고 작은 CPS subunits (160 kDa) 및 각 소 단위 (320 kDa)의 두 복사본을 포함 하는 이종 tetramer 이합체. 이 하위 단지 단백질 어셈블리;에 대 한 첫 번째 통찰력 제공 즉, 크고 작은 소 단위에 직접 접촉 (로 hetero-이합체에 의해 밝혀) 있고는 tetramer 두 이합체의 제품일 수도 있습니다. 복잡 한 그대로 CPS에 구조 배열에 대 한 더 많은 정보를 얻으려면, 우리는 이종 octamer와 이종 tetramer 탠덤 질량 분석 (MS/MS) 수행. 두 경우, 작은 소 단위 어셈블리 (그림 4B)의 주변에 위치 하 고 전조 제안에서 해리 작은 소 단위. 실제로, 작은 소 단위는 사용 가능한 크리스탈 구조 (그림 4C)44에서 주변.
화학 cross-linking BS3 cross-linker를 사용 하 여 또한 수행 되었다. 금액 증가 사용 하 여 CPS subunits의 공유 결합 향상 되었습니다. 소화 단백질의 펩 티 드 위에서 설명한 대로의 분석 후에, 큰 소 단위와 작은 소 단위에 1 개의 상호 많은 단백질 상호 작용 (표 2)을 획득 했다. 또한, RvB1/B2 복잡 한 마찬가지로 우리가 큰 CPS 소 단위의 2 개의 사본 사이 2 분자 간의 상호 링크 발견. 이 크로스 링크 그들의 C-터미널 측면에서 서로 마주보 고 두 큰 소 단위를 놓습니다. 이전 연구에서 우리는 가장 가능성이 큰 소 단위에 의해 확인의 2 개의 사본의 인터페이스에서 발생 한 큰 소 단위에서 3 개의 추가 상호 작용을 식별 구조 질량 분석 및 전산 모델링35, 결합 크리스탈 구조와 얻은 모델 (그림 4C 와 표 2). 이러한 상호 작용 CPS 코어의 배열은 4 개의 큰 소 단위 구성 된 복잡 한 수 있습니다. 그러나, 작고 큰 소 단위 사이 아무 간 소 단위 상호 링크 관찰 되었다. 사용 가능한 결정 구조 (그림 4C)를 검사 하 여 큰 소 단위와 주변 작은 소 단위 구성 된 복잡 한의 tetrameric 코어 사이 상호 작용 표면은 매우 작은 어떤 설명할 수 있습니다 명백한 된다 간 소 단위 상호 작용의 부재입니다. 이 작은 소 단위 쉽게 가장 작은 바인딩 인터페이스 때문일 그대로 단지에서 dissociates 보여준 기본 질량 분석에 의해 확인 된다. 그럼에도 불구 하 고, CPS 복잡 한 결합 화학 cross-linking를 기본 질량 분석 상호 작용 단백질 그들의 구조 배열 (그림 4D) 추론 수 있습니다.
함께 찍은, 네이티브 질량 분석 및 화학 cross-linking 복사해올된 펩 티 드 대량 spectrometric 식별과 결합의 조합의 두 예 단지의 구조 배열 재구성을 수 있습니다. 화학 cross-linking 공개 단백질 소 단위, 예를 들어 상호 작용 RvB1와 RvB2 사이 또는 CPS의 tetrameric 코어 내에서 배열 하는 동안 네이티브 질량 분석 전달 단백질 stoichiometries 그대로 단지의 고 유행 subcomplexes입니다. CPS는 두 개의 소 단위 사이 아무 상호 분자 상호 작용은 화학 cross-linking에 의해 관찰 될 수 있었다 경우 네이티브 질량 분석 각 큰 소 단위 하나의 작은 소 단위 (그림 4D)와 상호 작용 하 나왔다. 탠덤 질량 분석 복잡 한에 두 소 단위 사이 작은 인터페이스 작은 소 단위의 주변 위치를 제안 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig1.jpg"> 그림 1: 기본 질량 분석 및 교차 연결의 워크플로. 두 기술을 보완 결과 제공합니다. 네이티브 질량 분석 보여준다 stoichiometries 및 상호 작용 모듈, 동안 복합물 내의 단백질 상호 작용 사이트에 대 한 통찰력 제공 교차 연결 합니다. Note는 바이너리 상호 작용을 보여 화학 cross-linking만. (A) 네이티브 질량 분석의 첫 번째 단계는 필터 또는 젤 여과 열을 사용 하 여 휘발성과 수성 버퍼를 버퍼 교환. 그대로 단백질 복합물의 질량 분석에는 다음 그들의 산출할을 보여준다. 탠덤 질량 분석 실험에서 주변 소 단위는 해리 했다. (B) 화학 cross-linking에 대 한 복잡 한 단백질 incubated 가교 시 약으로. 교차 결합 된 단백질은 액체 착 색 인쇄기 결합 질량 분석에 의해 연속적으로 분석 하는 펩 티 드로 다음 소화 된다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig2.jpg"> 그림 2: SDS-페이지의 RvB1/b 2 (A) 및 CPS (B) 단지 십자가. (A) 2.5 µ M RvB1/B2 젤 레인 당 로드 했다. BS3의 농도 변화 했다. 비 크로스 연결 RvB1/b 2는 약 50 kDa에 두 개의 단백질 소 단위를 보여줍니다. BS3의 추가 단백질 소 단위 단백질 밴드 더 높은 분자량에서 결과의 공유 결합을 발생 합니다. 교차 연결 된 종 양의 높은 BS3 농도 함께 증가 된다. 최적의 상호 조건은 강조 표시 (빨간색)입니다. (B) 10 µ M CPS 젤 레인 당 로드 되었습니다. 대형 (90 kDa)과 소형 (40 kDa) CPS subunits 얻을 수 있습니다. BS3의 추가 단백질 소 단위 단백질 밴드 더 높은 분자량에서 결과의 공유 결합을 발생 합니다. 최적의 상호 조건은 강조 표시 (빨간색)입니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig3.jpg"> 그림 3: 기본 질량 분석 및 복잡 한 RvB1/b 2의 cross-linking 화학. (A) 네이티브 질량 스펙트럼 밝혀 두 종의 RvB1/B2; 약 11000 ~ 12, 000 m/z 와 hexameric에 그대로 dodecamer (즉, (RvB1)6(RvB2)6) 반지 (RvB1)3(RvB2)3 약 8000 m/z. 두 종의 그의 태그 및 태그 RvB2에서 유래 하는 두 개의 인구를 보여줍니다. 스펙트럼은35에서 수정 되었습니다. RvB1/b 2의 (B) 결정 구조 (PDB ID 4WVY) 표시 됩니다. RvB1 그리고 RvB2 소 단위 2 hexameric 반지를 형성 한다. (C)는 상호 연결 된 디 펩 티 드의 조각화 스펙트럼. RvB1의 N terminus는 상호 연결 된 RvB1. K23과 y 이온 시리즈 (빨강과 녹청) 두 펩 티 드에 대 한 가져온. (D) 내부 및 남북 protein 상호 작용 RvB1/b 2 단지에서 얻은. Intra 교차 링크 inter-cross-links 파란색에서 표시는 빨간색으로 표시 됩니다. 삽입 결정 구조 (녹색, 삽입)에 구상 될 수 있는 RvB1 및 RvB2 소 단위 사이 두 분자 간의 상호 링크를 보여 줍니다. 두 개의 RvB2 복사본에서 발생 하는 상호 작용은 파란색 점선으로 표시 됩니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56747/56747fig4.jpg"> 그림 4: 기본 질량 분석 및 CPS의 cross-linking 화학. (A) CPS 쇼의 네이티브 질량 스펙트럼 3 단지. Hetero-이합체 (160 kDa), 이종 tetramer (320 kDa)와 이종 octamer (640 kDa). 스펙트럼은35에서 수정 되었습니다. (B) 협동 tetrameric 및 octameric CPS 복잡 한 계시 분리의 작은 CPS 소 단위의 질량 분석. CPS의 (C) 결정 구조 (PDB ID 1BXR) 표시 됩니다. 큰 소 단위 tetrameric 코어를 형성 하 고 작은 소 단위 복합물의 주변에 있습니다. 큰 소 단위의 두 복사본 간의 간 분자 상호 링크 (녹색)이 표시 됩니다. 크고 작은 CPS subunits의의 (D) 상호 네이티브 질량 분석 subcomplexes 그리고 작은 소 단위의 주변 위치를 건의 한다. 화학 상호 링크는 CPS의 tetrameric 코어에서 준비를 나타냅니다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/56747fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
표 1: 데이터베이스 검색 결과. 단백질은 액체 착 색 인쇄기 결합 질량 분석 및 데이터베이스 검색에 의해 발견 됐다. 단백질 이름, 가입 수, 설명 뿐만 아니라 단백질 질량 주어진 다. 단백질 점수, 단백질, 당 관찰 된 스펙트럼의 수와 관찰 된 펩 티 드 순서의 수 나열 됩니다. 최고의 마스코트 펩 티 드와 5 개의 펩 티 드 각 단백질 소 단위에 대 한 나열 됩니다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table1.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
표 2: 상호 링크 RvB1/b 2와 CPS에서 관찰. 단지와 상호 연결 된 잔류물의 소 단위를 받는다. 상호 연결의 유형 (내부-또는 간 분자) 겹치는 펩 티 드 순서 또는35이전 연구 밝혀졌다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56747/Table2.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Combining Chemical Cross-linking and Mass Spectrometry of Intact Protein Complexes to Study the Architecture of Multi-subunit Protein Assemblies

단백질 복합물의 건축은 그들의 기능을 위해 필수적입니다. 다양 한 대량 spectrometric 기법을 결합 하 여 그들의 어셈블리를 공부 하는 강력한 입증. 우리 화학 cross-linking 및 네이티브 질량 분석에 대 한 프로토콜을 제공 하 고 어떻게 이러한 상호 보완적인 기술을 다 소 단위 단백질 어셈블리의 구조를 명료 하 게 도움이 보여.

화학 Cross-linking 및 여러 소 단위 단백질 어셈블리의 건축을 그대로 단백질 복합물의 질량 분석

Proteins interact with their ligands to form active and dynamic assemblies which carry out various cellular functions. Elucidating these interactions is ...

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19.5K 조회수.  Martin Luther University Halle-Wittenberg. 단백질 복합물의 건축은 그들의 기능을 위해 필수적입니다. 다양 한 대량 spectrometric 기법을 결합 하 여 그들의 어셈블리를 공부 하는 강력한 입증. 우리 화학 cross-linking 및 네이티브 질량 분석에 대 한 프로토콜을 제공 하 고 어떻게 이러한 상호 보완적인 기술을 다 소 단위 단백질 어셈블리의 구조를 명료 하 게 도움이 보여.

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

연구

생물학

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

액상 복구와 분자량 기반 분류에 대한 GELFREE 8100 분획화 시스템을 사용하여

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

불안 정한 다중 단백질 단지의 분리에 의해 생체내에 제어 세포 간 연결 및 단백질 자기 동질 크로마 토그래피

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

구조 질량 분광법에 의해 큰 단백질 단지 분석

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and abiotic stresses and also regulates water flow from the external environment.1 A biopolyester (cutin) and long-chain fatty acids (waxes) form the principal structural framework of the cuticle; the functional integrity of the cuticular layer depends on the outer 'epicuticular' layer as well as the blend consisting of the cutin biopolymer and 'intracuticular' waxes.2 Herein, we describe a comprehensive protocol to extract waxes exhaustively from commercial tomato (Solanum lycopersicum) fruit cuticles or to remove epicuticular and intracuticular waxes sequentially and selectively from the cuticle composite. The method of Jetter and Sch&auml;ffer (2001) was adapted for the stepwise extraction of epicuticular and intracuticular waxes from the fruit cuticle.3,4 To monitor the process of sequential wax removal, solid-state cross-polarization magic-angle-spinning (CPMAS) 13C NMR spectroscopy was used in parallel with atomic force microscopy (AFM), providing molecular-level structural profiles of the bulk materials complemented by information on the microscale topography and roughness of the cuticular surfaces. To evaluate the cross-linking capabilities of dewaxed cuticles from cultivated wild-type and single-gene mutant tomato fruits, MAS 13C NMR was used to compare the relative proportions of oxygenated aliphatic (CHO and CH2O) chemical moieties.
Exhaustive dewaxing by stepwise Soxhlet extraction with a panel of solvents of varying polarity provides an effective means to isolate wax moieties based on the hydrophobic characteristics of their aliphatic and aromatic constituents, while preserving the chemical structure of the cutin biopolyester. The mechanical extraction of epicuticular waxes and selective removal of intracuticular waxes, when monitored by complementary physical methodologies, provides an unprecedented means to investigate the cuticle assembly: this approach reveals the supramolecular organization and structural integration of various types of waxes, the architecture of the cutin-wax matrix, and the chemical composition of each constituent. In addition, solid-state 13C NMR reveals differences in the relative numbers of CHO and CH2O chemical moieties for wild-type and mutant red ripe tomato fruits. The NMR techniques offer exceptional tools to fingerprint the molecular structure of cuticular materials that are insoluble, amorphous, and chemically heterogeneous. As a noninvasive surface-selective imaging technique, AFM furnishes an effective and direct means to probe the structural organization of the cuticular assembly on the nm-&mu;m length scale.

Aerial plant organs are protected by the cuticle, a supramolecular biopolyester-wax assembly. We present protocols to monitor selective removal of epi- and intracuticular waxes from tomato fruit cuticles on molecular and micro scales by solid-state NMR and atomic force microscopy, respectively, and to assess the cross-linking capacity of engineered cuticular biopolyesters.

분리 및 과일 손톱의 Biophysical 연구

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

의 단백질 단지의 식별<em&gt; 대장균</em&gt; 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

을 바탕으로 단백질 - 단백질 상호 작용의 확인에 프로토콜<sup&gt; 15</sup&gt; N 신진 대사 라벨링, Immunoprecipitation, 수량 질량 분석법 및 선호도 변조

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce informative probes or labels into expressed receptors that do not perturb receptor function. We used amber codon suppression technology to genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine (azF) at various targeted positions in GPCRs heterologously expressed in mammalian cells. The versatility of the azido group is illustrated here in different applications to study GPCRs in their native cellular environment or under detergent solubilized conditions. First, we demonstrate a cell-based targeted photocrosslinking technology to identify the residues in the ligand-binding pocket of GPCR where a tritium-labeled small-molecule ligand is crosslinked to a genetically-encoded azido amino acid. We then demonstrate site-specific modification of GPCRs by the bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligation reaction that targets the azido group using phosphine derivatives. We discuss a general strategy for targeted peptide-epitope tagging of expressed membrane proteins in-culture and its detection using a whole-cell-based ELISA approach. Finally, we show that azF-GPCRs can be selectively tagged with fluorescent probes. The methodologies discussed are general, in that they can in principle be applied to any amino acid position in any expressed GPCR to interrogate active signaling complexes.

We genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine at various targeted positions in GPCRs and show the versatility of the azido group in different applications. These include a targeted photocrosslinking technology to identify residues in the ligand-binding pocket of a GPCR, and site-specific bioorthogonal modification of GPCRs with a peptide-epitope tag or fluorescent probe.

유전자 인코딩 분자 프로브는 G 단백질 결합 수용체를 연구하는

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

식물 단백질 복합체의 번역 후 변형의 확인

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

단백질-DNA 상호 작용의 연구에 대한 단일 분자 조작 및 이미지를 결합

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...