레이저가 없는 하이드록실 라디칼 단백질 발자국을 통해 단백질 상호 작용 사이트와 확인 변화 영역을 훨씬 쉽게 식별할 수 있으며, 단백질 응집, 구조 및 안정성 연구에 대한 연구를 가속화합니다. 인라인 라디칼 도시메트리를 사용하면 효과적인 하이드록실 라디칼 부하를 실시간으로 조정할 수 있으며, 실시간 급진적 인 dosimetry를 사용하면 라벨링 재현성을 개선하면서 실험 시간과 귀중한 샘플을 절약 할 수 있습니다. 시작하려면 250 마이크로미터 의 내부 직경 실리카 모세관을 실리카 갈라진 돌로 27 인치로 자르고 모세관의 끝을 확인하여 깨끗하고 직선으로 자른다.
약 15밀리미터 길이의 두 개의 창을 만듭니다. 모세관의 하부 끝에서, 폴리이미드 코팅을 90밀리미터까지 태워 광분해 창과 도시계 창용 225밀리미터를 만듭니다. 너트와 페룰의 원추형 끝 너머에 모세관의 하부 끝을 삽입합니다.
모세관을 포트 5에 넣고 렌치로 손가락을 단단히 조이세요. 포토리시스 모듈의 포토리시스 셀 캡을 바로 꺼낸 다음 모세관을 제자리에 고정시키는 자기 장착 금속 마스크를 제거합니다. 왼쪽의 탭을 밀어 서 도시계 셀을 열고 오른쪽에 열린 도지계 셀을 스윙합니다.
모세관을 제자리에 고정시키는 자기 장착 클립을 제거합니다. 그런 다음 모세관을 사진 의 기지에 있는 홈 채널에 배치하고, 모세관 창을 photolysis 세포 창으로 중앙집중합니다. 모세관을 제자리에 고정하고 마그네틱 마스크를 추가합니다.
포토리시스 캡을 다시 배치합니다. 도지계 셀의 베이스에 있는 홈 채널에 모세관을 배치하고, 도시계 셀의 중앙에 있는 작은 조리개에 제2 모세관 창을 중앙에 놓습니다. 모세관을 한 손으로 제자리에 고정하는 동안 두 개의 자기 클립을 위치에 놓아 모세관을 제자리에 고정시하십시오.
도지계 셀이 닫을 때까지 닫습니다. 마지막으로, 모세관을 제품 수집기의 모세관 리프트 위에 있는 크누르 노브를 통해 삽입하여 모세관을 유리병 바닥 바로 위로 확장합니다. 커터를 사용하여 테플론 튜빙의 원하는 길이를 잘라 깨끗한 직선 컷을 위해 끝을 확인합니다.
너트 중 하나를 통해 새 사출 루프의 한쪽 끝을 삽입하고 튜브 의 끝에 새로운 ferrule을 배치합니다. 너트와 페룰을 제자리에 고정시키면서 튜브를 사출 밸브 의 포트 6에 삽입하여 바닥이 나올 때까지 놓습니다. 렌치로 너트를 조인 다음 너트와 ferrule이 제자리에 단단히 고정되어 있는지 확인합니다.
양 끝이 너트와 고정 된 ferrule을 가지고 나면, 느슨하게 포트 세 포트에 한쪽 끝을 나사 다른 끝은 포트 여섯. 일단 위치에, 꽉 손가락에 양쪽을 조인 다음 분기 렌치와 꽉 손가락을 지나 집니다. 유체 모듈을 시작하여 레이저가 없는 HRPF 시스템을 켜고, 포토리미터 모듈, 제품 수집기 및 시스템 컴퓨터다음에 사용됩니다.
시스템 소프트웨어를 실행합니다. 튜빙을 주사기 펌프의 밸브 위치에서 10 밀리리터의 버퍼로 완전히 담급합니다. 쓰레기통에서 튜브를 주사기 포트 2항에서 튜브를 빈 용기로 이동하여 폐기물을 수거합니다.
제품 수집가 회전 목마에 HN6로 표시된 위치에 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기를 놓습니다. 하중 위치로 설정된 밸브로 HPLC 급 수의 25 마이크로리터를 주입하여 주입 루프를 5번 헹구면 주입 루프를 헹구습니다. 사출 밸브를 수동으로 돌려 시스템의 나머지 부분을 플러시합니다.
제어 소프트웨어에서 프로세스를 선택하여 물방울이 형성될 때까지 물이 흐르기 시작합니다. 2개의 밀리몰라 아데닌과 10개의 마이크로몰라 단백질을 포함하는 용액을 만듭니다. 그런 다음 밀리리터 카탈라제 당 0.3 밀리그램과 35 밀리마일러 메티아닌 아마이를 사용하여 담금질 용액을 만듭니다.
200 마이크로리터 마이크로 튜브에 담금질 용액의 Aliquot 25 마이크로 리터. 과산화수소를 200 밀리몰라로 희석하여 얼음 위에 보관합니다. 제어 소프트웨어의 0볼트에서 플래시 전압을 시작합니다.
이 제로 볼트 제어는 관심있는 단백질에 대한 배경 산화를 결정합니다. 데이터 AutoZero 시작을 선택한 다음 프로세스를 완료합니다. 마지막으로 사출 밸브를 부하 위치로 바꿔 놓습니다.
담금질 용액을 제품 수집기 회전 목마에 배치한 다음 제품 유리병을 시스템 제어 소프트웨어에서 하나로 변경합니다. 주입 직전에 아데닌의 12.5 마이크로리터와 단백질 혼합물을 과산화수소 12.5 마이크로리터와 혼합하십시오. 혼합물을 위아래로 섞은 다음 빠르게 회전합니다.
혼합 후 10초 이내에 사출 포트를 사용하여 이 솔루션의 마이크로리터 25기를 주입합니다. 사출 밸브를 주입 위치로 전환하고 샘플이 처리되는 동안 기다립니다. 제어 소프트웨어에서 플래시 전압을 750볼트로 설정하고 라벨링 단계를 반복합니다.
그런 다음 각 샘플의 흡광도를 기록합니다. 먼저 선택(Select)을 클릭한 다음 피크 흡광도의 시작과 끝을 수동으로 선택합니다. 사용 가능한 공간에서 샘플에 대한 설명에 적는다.
획득한 모든 데이터에 대해 이 작업을 반복합니다. 데이터를 복사하여 스프레드시트에 붙여 넣은 후 각 전압에 대한 아데닌 흡광도의 평균 변화를 계산합니다. 모든 샘플을 채취한 후, 주사 밸브를 하중 위치로 설정하여 주사기 포트 및 샘플 루프를 플러시하고 HPLC 물 25 마이크로리터를 5회 주입한다.
주입 밸브를 주입 위치로 돌려 시스템의 나머지 부분을 HPLC 물로 플러시합니다. 플러시되면 흐름을 멈추고 시스템 제어 소프트웨어를 종료하고 제품 수집기, 체계 모듈, photolysis 모듈 및 마지막으로 유체 모듈로 시작하여 모듈을 끕니다. 산화 시, dosimetry에 사용 되는 아데닌에서 UV 흡광도 감소 265 나노 미터.
버퍼 2에는 버퍼 1에 비해 아데닌 흡광도의 변화를 감소시키는 급진적 스캐빈거가 포함되어 있습니다. 아포묘글로빈은 과산화수소와 아데닌이 있는 상황에서 4개의 플라즈마 램프 전압을 증가시켰다. 6개의 펩타이드가 검출되었고, 265나노미터에서 아데닌 흡광도의 변화에 대하여 산화가 선형으로 증가했습니다.
이 6개의 산화 펩타이드는 myoglobin의 결정 구조에 표지됩니다. 고압 플라즈마 램프로부터 검출된 산화의 정도는 레이저 기반 방법보다 훨씬 높다. 이러한 증가는 고압 플라즈마 램프의 광범위한 스펙트럼 UV 방출 스펙트럼에서 발생합니다.
광범위한 UV 스펙트럼을 생성함으로써, 고압 플라즈마 램프는 과산화수소의 흡광도 영역과 더 잘 겹쳐서, Kr F 엑시머 레이저 및 Nd YAG 레이저에 비해 과산화수소의 광분해를 통해 하이드록실 라디칼의 보다 효율적인 생산을 초래한다. 고압 플라즈마 램프는 Kr F 엑시머 레이저를 사용하여 일반적으로 관찰되는 것 이상으로 하이드록실 라디칼의 생산을 크게 증가시킵니다. 과산화수소 100밀리머를 사용하면 높은 수준의 배경 산화가 발생할 수 있습니다.
단백질 시스템이 과산화수소 유발 산화에 취약하다면 농도를 10 밀리머로 낮춥시다. HRPF의 돌이킬 수 없는 라벨은 긴 프로테아제 소화를 포함한 다운스트림 시료 처리를 허용하고, 멀티플렉싱을 위한 탠덤 질량 태그에 추가하고, 2D 크로마토그래피를 수행하여 펩티드 검출을 개선하고 구조적 정보를 조율할 수 있습니다.
