이 작품은 박사 Ungrin에 대한 새로운 조사 시동 부여에서 캘거리 대학에 의해 투자되었다.

주 : 마이크로 웰 플레이트는 원하는 결과에 따라 다른 형식으로 사용할 수 있습니다. 사양뿐만 아니라 각 형식으로 표기 세포의 최소 및 최대 숫자에 대한 대략적인 지침을 표 1에 나타낸다. 작은 마이크로 웰은 날카로운 점에 테이퍼와 상체 사이의 변화는 작은 크기에 더 중요한되고 있지만, 따라서 더 낮은 크기 제한은 없다. 적은 20 세포 각각의 평균에서 상체의 일상적인 생산은 간단 8입니다. 큰 마이크로 웰의 크기가 가늘어되지 않으며, 따라서 각각의 마이크로 웰에있는 여러 개의 작은 상체가 발생할 수 있습니다 세포의 작은 숫자에서 상체를 형성하려고 시도합니다. AggreWell 400Ex 플레이트를 사용하는 경우로 인해 표면 특성에 약간의 차이, 계면 활성제 용액 (단계 1.2)와 준비는 선택 사항이 아닙니다. 이 프로토콜은 AggreWell 400 판의 사용을 기반으로합니다 - 다른 형식의 죄수ULT 표 1. 각 웰에로드 할 셀의 수는 각 회전 타원체 클러스터 화하는 세포의 숫자로 포함 마이크로 웰의 수를 곱함으로써 결정된다. 예를 들어, 개당 1,000 세포에서 상체를 생성하기 위해, 각 웰은 (1,200 상체 1,000 배 세포 각 =) 1.2 × 10 6 세포로로드해야합니다. 세포 밀도가 세포 0.4 ㎖를로드 할 것을 관련 계산해야한다. 그래서 1000 셀 각각 형성 상체의 예를 들면, 0.4 ml의 1.2 X 10 6 세포 밀리리터 당 3 × 10 6 세포의 밀도로 변환합니다. 1. 세포를 수신 할 준비 마이크로 웰 <ol><li> 마이크로 웰 플레이트를 제공 한 멸균하고, 그러한 층류 흐름 생물 안전 캐비닛 등의 무균 환경에서 자신의 포장에서 제거해야합니다. 불임 프로토콜에 걸쳐 유지되어야한다. 불임은 우물 물을 사용하여 70 % 에탄올을 사용하여 resterilized하는, 타협해야한다옵션 단계를 수행. <ol><li> 사용되지 않는 각 웰에 70 % 에탄올 0.5 ㎖를 추가합니다. 일부 마이크로 웰 것이다 트랩 기포, 이것은 일측에 액체를 첨가하고, 오히려 표면 상에 수직으로 떨어지는 것보다 표면에 걸쳐 확산하도록함으로써 감소 될 수 있지만. 뚜껑을 교체합니다. </li><li> 에탄올 증기는 신속하게 거품을 투과해야하는 동안 다수가 있으면이를 제거하는 것이 바람직 할 수있다. 2,000 X g에서 2 분간 원심 분리기. 는 로터가 제대로이 속도로 균형을 보장하는 것이 중요합니다. </li><li> 낮은 배율 거꾸로 현미경을 사용하여 확인 기포가 마이크로 웰에서 제거되었습니다. </li><li> 실온에서 뚜껑으로 5 분 동안 배양한다. </li><li> 기음 에탄올. 플레이트는 지금 즉시 사용할 수 있도록 멸균 또는 PBS로 세척, 또는 저장을 위해 공기 건조 할 수있다. </li></ol></li><li> 세포를 마이크로 웰의 표면과 상호 작용하지 않도록하기 위해서는, 계면 활성제를 사용하여 제조 될 수있다. 일반적으로 그것은이다이후에 처음이 단계를 수행하는 것이 바람직하고, 함께 계면 활성제 코팅 된 마이크로 웰없이 생성 상체를 비교합니다. <ol><li> 각 웰에 세정 용액 0.5 ㎖를 추가합니다. 일부 마이크로 웰 것이다 트랩 기포, 이것은 일측에 액체를 첨가하고, 오히려 표면 상에 수직으로 떨어지는 것보다 표면에 걸쳐 확산하도록함으로써 감소 될 수 있지만. 뚜껑을 교체합니다. </li><li> 거품을 제거하기 위해 2,000 XG에서 2 분 동안 원심 분리기. 는 로터가 제대로이 속도로 균형을 보장하는 것이 중요합니다. </li><li> 낮은 배율 거꾸로 현미경을 사용하여 확인 기포가 마이크로 웰에서 제거되었습니다. </li><li> 실온에서 뚜껑에 적어도 삼십분 동안 품어, 또는 4 박 ° C에서 제대로 건조 방지하기 위해 밀봉하면 필요할 때까지 플레이트는 우물에서 계면 활성제 용액에 네 개의도에 저장 될 수있다. </li><li> 멸균 또는 사용하는 PBS 직전에 접시를 씻으십시오. 판에게 허용하지 않습니다코팅 후 건조합니다. </li></ol></li></ol> 2. 셀 준비 참고 : 셀 준비의 세부 사항은 특정 세포 유형이 연구되고와 다소 다를 수 있습니다. 그러나 우리는 여기서 설명 줄뿐만 아니라 인간 및 뮤린 배아 줄기 세포 (ESC), 사람의 유도 된 다 능성 줄기 세포 (IPSC), 섬유 아세포, 추정 원시 내배엽 포함한 세포의 광범위한 범위를 갖는 효과가 이러한 조건을 관찰 와 기질 세포. 다른 그룹은 중간 엽 줄기 세포 9 연골을 포함한 광범위한 애플리케이션에 성공적으로 시스템을 채용 한, 다 능성 줄기 세포 (10)로부터 신경 전구체의 표준화 된 세대는 독성이 간세포 (11)와 도롱뇽 12 척수 재생의 평가에서 분석한다. HT29 세포를 사용하기위한 특정 프로토콜은 다음과 같습니다. <ol><li> DMEM에서 배양 HT29 세포를 T75 플라스크로 시작+ 10 % FBS </li><li> 대기음 성장 플라스크 매체와 트립신 3 ㎖를 추가합니다. </li><li> 37 ℃에서 5 분 동안 세포를 품어 </li><li> 성장 배지 3 ㎖를 추가하여 트립신 소화를 중지합니다. 셀 카운팅 나누어지는을하고 15 ML의 원심 분리기 튜브에 나머지를 전송합니다. </li><li> 200 X g에서 5 분 원심 분리기. </li><li> 원심 분리가 진행되는 동안, 세포를 센다. </li><li> 대기음 트립신 / 중간 혼합물 위의 계산으로 필요한 세포 밀도에 의해 결정 신선한 성장 매체, 볼륨 교체합니다. </li><li> (선택 사항) 어떤 덩어리를 제거하기 위해 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 전달합니다. 참고 : 셀 수확 조건이 줄 사이에 다소 차이가 있습니다. 예는 또한 세포를 계대 대한 해리 프로토콜을 사용할 수있는 경우, 그 출발점으로 사용되어야한다. 트립신의 민감한 세포 라인의 사용으로 과도한 세포의 죽음의 원인이 될 수 있습니다. 이러한 경우에 우리는 대안 dissociati로 TrypLE을 사용하여 좋은 결과를 관찰시약 8. 세포를 분리하는 동안 응집되어 생존을 분실 한 경우, 효소 용액에 DNA 분해 효소를 첨가하면이 문제를 해결할 수 있습니다. 해리 시간을 줄이고 세포 덩어리를 분쇄하는 분쇄 단계를 사용하면 생존 가능성을 높일 수 있습니다. </li></ol> 3. 회전 타원체의 형성 NOTE : 상체 그러나 초기 실험은 세포 배지 조성을 변화의 결과로부터 3 차원 배양 시스템으로 전환의 결과를 구별하기 위해, 배양 된 배지를 이용하여 수행되어야 매체 제형 다양한 생성 될 수있다. <ol><li> 각 웰 성장 매체의 0.4 ML을 추가합니다. </li><li> 거품을 제거하기 위해 2,000 XG에서 2 분 동안 원심 분리기. 는 회 전자 사전에 원심이 속도로 균형을 보장하는 것이 중요합니다. </li><li> 낮은 배율 거꾸로 현미경을 사용하여 확인 기포가 마이크로 웰에서 제거되었습니다. </li><li> 0.4 ML을 추가합니다(위의 계산)에 필요한 밀도로 세포 현탁액. 조심스럽게 마이크로 웰에 공기 방울을 도입하지 않고, 아래로 피펫 팅에 의해 혼합. 이것은 세포가 균일 일관된 상체를 얻기 위해, 우물에 걸쳐 분산되는 것을 보장하기 위해 중요하다. </li><li> 200 X g에서 5 분 원심 분리기. 판을 원심 분리하는 동안 자기 수준을하지 않는 경우, 대류 전류는 마이크로 웰을 통해 세포의 편재에 그 결과를 발생할 수 있습니다. 가중치 플레이트 캐리어의 양면에 균일하게 분포되도록 따라서 판은 다른 플레이트에 대하여뿐만 아니라 내부적으로 균형을 이루어야한다. </li></ol> 참고 : 고르지 세포 분포의 기록을 볼 수있는 경우,이 플레이트 캐리어의 피벗 포인트에 윤활의 작은 금액을 적용 할 필요가있다 - 지침은 원심 분리기 제조 업체에 문의하십시오. 참고 : 세포가 마이크로 웰에 원심 분리되고 나면, 그들은 합리적으로 RESIS 있습니다판의 작은 움직임에서 세척하기에 TANT. 매체의 슬로 싱 결과 급격한 운동은 피해야하지만, 현미경 원심 분리기 판 또는 보육의 전송이 중요한 세포의 변위가 발생하지 않아야합니다. <ol start="6"><li> 거꾸로 현미경을 사용하여, 세포가 마이크로 웰 내에 클러스터, 그들이 균일하게 잘 분산되어 있다는 것을 확인합니다. </li><li> 37 ℃에서 하룻밤 배양한다 </li><li> 도립 현미경을 사용하여, 회전 타원체의 형성 과정을 관찰. 일부 세포 라인은 다른 사람들이 더 오래 걸릴 수 있습니다, 24 시간 내 소형 상체를 형성 할 것이다. HT29 세포 집계 클러스터에서의 진행은도 2에 도시된다. </li><li> 마이크로 웰에서 상체를 복구하고 부드럽게 피펫을 분출에 의해 현탁 배양에 전송할 수 있습니다. 대안 적으로, 중간 여분 8 시튜 상체를 유지 - 기간은 초기 크기와 성장 속도에 의존하는 DEF그들은이 형성되는 마이크로 웰을 빨리 성장할 때까지의 시간을 이네. <ol><li> 파스퇴르 피펫을 사용하여 우물의 가장자리에 상체, 대기음 매체를 잃지 않고 매체를 교체하십시오. 천천히가 메 니스 커스 (meniscus)에서 액체를 그리기 시작 때까지 끝을 가지고, 그리고 인하로 메 니스 커스 (meniscus)을 따릅니다. 그 후 같은 장소에서 잘 벽에 신선한 매체를 추가 할 수 있습니다. 몇 상체는 매체가 항상 흡입과 같은 위치에 치환​​ 된 경우에는,이 숫자가 잘 다수에 비해 작은 남아 손실 될 수있다. </li></ol></li></ol>

<ol>
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박사 Ungrin 발명가로 AggreWell 기술 금융 관심을 가지고 있습니다.

우리는 균일 한 회전 타원체 많은 수의 서로 다른 소스에서 여러 개의 세포주에서 생성되도록하는 시스템을 구축했다. 우리는이 상태에서 상체를 형성하지 않는 부착 세포주가 발생할 못하고있다. 우리는 이전하지만 현재까지이 문제가 종양 라인을 제기하지 않은, anoikis 5,8하는 경향이 인구의 세포 손실을 관찰했다. 이 시스템은 24 웰과 6 자 형식뿐만 아니라 현재 개발중인 50,000 마이크로 웰을 각각 포함 된 프로토 타입의 생물 반응기에서 마이크로 웰 일관된 행동, 표면적 임의로 확장 성이다. 비대칭 우려 타원체 있으면, 단계 4.8에서 배양 시간은 2-3 일까지 증가 될 수있다. 구 상체는 또한 그러나이 경우 치료가 서로 WI 접촉 상체로서, 충분히 낮은 배양 밀도를 유지하기 위해 취해야, 대칭성을 증가시키는 마이크로 웰로부터 추출 후 기간 동안 배양 될 수있다LL 종종 더 큰 구조로 융합. 이러한 이유로, 우리는 이전에 골재가 일차 제한 타원체의 크기되는, 형성되는 마이크로 웰 내에 배양을 유지하고있다. 이것은 차례로 성장 속도 및 초기 크기 (8)의 함수이며, 마이크로 웰 플레이트 내에서 연장 배양 계획되는 경우, 이것은 사전에 고려되어야한다. 증식을 방지하는 옵션이 발생한다은 작은 상체로 시작하는, 또는 AggreWell 800 판의 큰 마이크로 웰을 사용 하나 있습니다. 상체가 시간이 지남에 일관성이 증가하지 않을 경우, 하나의 잠재적 원인은 세포의 죽음이 될 수있다. 특히 고도의 대사 활성 세포의 큰 집계에 산소와 필수 영양소의 전달에 대량 전송 제한이 괴사 코어 2 발생할 수 있습니다 - 따라서 비 응집 ​​된 구형은 단순히 과도한 세포 죽음의 결과 일 수있다. 대안으로, 기계적 COHE 잼상체의 시온은 주어진 셀 라인 (13)의 전이 가능성의 관계에서, 세포 간 결합력을 평가하는 데 사용되었습니다. 이는 아마도 이러한 면적비 진원도 및 경계로 형태 학적 파라미터를 사용하여, 회전 타원체 형상 및 전이성 전위 사이의 관계를 조사하기 위해 흥미로울 것이다. 상체의 기계적 및 형태 학적 특성을 조사하는 것 외에도, 마이크로 웰 시스템 어셈블리는 여러 세포 유형 및 / 또는 6,7 생체 재료의 조합으로 이루어지는 혼합 조성물 상체의 대규모 생산을 허용한다. 다른 세포 유형의 종양 세포의 상호 작용에 따라서는 예를 들어, 섬유 아세포 및 내피 세포와 함께 종양 세포에서 상체를 생성하는 데 관심이있을 수 있으며, 더 자세히 생체 (14)에서 종양의 동작을 모델링하는 것이 중요하다. 각종 생체 물질의 미립자도 혼입 될 수 있고, SPH 영향을 미칠 수있다직접 세포 7,15, 또한 회전 타원체 (16)의 내부로 성장 인자 및 사이토 카인의 방출 제어를위한 저수지로와의 상호 작용을 통해 모두 eroid 속성. 불임에 대한 우려가있는 경우 이전 실험의 일환으로 인큐베이터에 약간의 시간을 보냈습니다 수있는 몇 가지 우물이 이전에 사용되어있는 마이크로 웰 플레이트, 작업을 할 때, 예를 들어, 우물 70 % 에탄올로 resterilized 할 수있다 물. 상체가 형성되고 나면, 이들은 또한 셀 스트레이너 위에 현탁액을 통과시켜 잔류 비법 세포로부터 분리 될 수있다. 상체가 유지됩니다 동안 개별 세포를 통해 전달합니다. 구형이 배양 과정 동안 잠재적 전이성 세포를 흘리는 것으로 의심되는 경우,이 절차를 여러 번 수행하는 것이 바람직 할 수있다 - 처음 비법 세포를 제거하고,이어서 purifie을 격리세포의 D 인구는 상체으로 해제가 없습니다.

종양 세포가 더 생리 학적으로 관련 시스템 1로 전환하면 기존의 조직 문화 플랫폼에서 확인 된 치료제가 효능을 잃을 수 있다는 것을 그들이 때 플라스틱 배양보다 입체 문화에서 다르게 행동하고, 증거의 증가 몸이있다. 그것은 모두 그들의 내부 생물학에 대한 통찰력을 얻기 위해, 이러한 조건 하에서 암 세포의 거동을 연구하기 위해, 또한 병원에 검사 시설에서 새로운 치료제를 전환의 성공률을 증가시키는 것이 바람직하다. 긴 역사를 가진 하나의 유용한 모델 시스템은 종양 상체 1,2로 알려진 암 세포의 3 차원 클러스터를 사용합니다. 이상적으로, 구형 형성 기술은 크기와 구성 실험자에 의해 제어되는 균일 한 상체의 큰 숫자의 생산을 허용하는 것입니다. 매달려 드롭 잘 플레이트에 접근하는 동안 3,4이 다시 중 일부를 수행 할 수 있습니다요건, 처리는 일반적으로 제한되며, 상체 많은 수의 생성은 노동 집약적 인 작업이됩니다. 우리는 최근에 재생 의학 분야 5 유사한 문제를 해결할 수있는 시스템을 개발했습니다. (도 1 참조) 밀집 마이크론 스케일 웰 시리즈 내의 강제 응집을 이용하는이 방법은 여러 종류의 세포 (6)의 혼합물뿐만 아니라 다양한 생체 물질 (7)의 혼입을 포함한 세포의 임의의 번호로부터 상체의 생성을 허용한다. 수천 이상 수백 수천 - - 상체가 다수 형성되어 즉시 추출하거나 두 (미발표 관찰) 주 적어도 하나 08 배지 교환에 형성되는 마이크로 웰에서 유지 될 수있다. 이 시스템은 따라서 잘 EFFE의 평가를 위해 균일 한 많은 수의 재생 가능한 종양 상체의 생성에 적합새로운 항 종양 제 또는 기본적인 생물학적 조사 ctiveness.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell 400 plate</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>27845/27945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rinsing Solution</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (37 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa3d-bddd-2a36-2ae1901f1604" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">&#181;m)</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12001-676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-Versene (EDTA)</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12001-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12002-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA-95042-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Invitrogen / Life Technologies</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>VWR / Motic</td>
			<td>CA19000-610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates</td>
			<td>VWR / Beckman</td>
			<td>CABKA99465, CABK369704, CABK392806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow biosafety cabinet</td>
			<td>ESBE / Baker</td>
			<td>BKR-SG603AHEUVSP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates

종양 상체 점점 입체적으로 종양 세포의 거동에 대한 중요한 시험 관내 모델로서 인식된다. 더 생리학 관련 기존 접착 시트의 문화에 비해, 그들은 더 정확하게 복잡성과 실제 종양에 존재하는 상호 작용을 요점을 되풀이하다. 나은 종양 생물학, 또는 신규 치료제의 효능을 평가하기 위하여,이 모델을 활용하기 위해서는, 제어 된 방식과 상당수에서 재현성 상체를 생성 할 수있을 것이 필요하다. AggreWell 시스템은 단일 세포 현탁액을 원심으로하는 피라미드 형 마이크​​로 웰의 고밀도 배열로 구성된다. 세포의 숫자는 각 마이크로 웰의 바닥에 클러스터링 및 관련된 뚜렷한 세포 유형의 수와의 비율은 실험에 의해 도입 현탁액의 속성에만 의존한다. 따라서, 우리는 함께 임의의 크기와 구성의 종양 상체를 생성 할 수 있습니다기본 플랫폼 기술을 수정할 필요가 부족합니다. 차례 문화 면적의 제곱 센티미터 당 마이크로 웰의 수백 매우 높은 생산 수준이 간단, nonlabor 많이 사용하는 프로세스를 통해 달성 될 수 있다는 것을 확인합니다. 따라서 우리는이 프로토콜은 종양 구형 분야의 연구자에 크게 도움이 될 것으로 기대합니다.

: 서로 다른 해부학 적 기원의 여러 종양 라인에서 상체를 쉽게 생성 및 현탁 배양으로 추출 할 수있다. 3 각 조건에서 매우 균일 한 구형의 인구가이 방법을 통해 얻을 수있는 일관성있는 크기의 컨트롤을 보여줍니다 그림. 된 LNCaP 전립선 암 세포는 불규칙한 경계를 덜 일관된 상체에 상승했다 동안 행동의 명확한 라인 사이의 차이 (가능한 이유에 대한 설명을 참조, 선명하게 정의 경계 밀집 상체를 형성 HT29 대장 암 세포와 TE6 식도암 세포로도 볼 수 있습니다 ). 더 일관된 집계에 강한 내부의 힘은 동안에도 여전히이 형성되는 마이크로 웰의 더 대칭 형태로, 특히 큰 사이즈로 된 LNCaP 집계, 눈에 띄게의 사각 피라미드 형상을 유지하는 반면에 붕괴의 결과 마이크로 웰. 입력 셀 번호와 매가 간의 관계<html> 그 결과 회전 타원체의 iCal의 크기는 변수의 수에 따라 달라집니다. 셀당 부피와 사용하는 셀의 수의 곱에 기초하여 이론적 볼륨 차례로 인해 단일 ​​세포 현탁액 단계에서 세포의 손실뿐만 아니라, 지나치게 작은 골재 손실을 포함 할 수있다 세포 손실에 의해 감소​​ 될 수있다 부족한 이웃의 숫자 및 핵심 기술의 제약으로 괴사 수송에 의한 과대 집계에서. 크기는 또한 응집 공정 중에 발생할 수있는 확산에 의해 영향을받을 것이다. 이러한 매개 변수는 세포주에서 세포 라인에 달라집니다대로, 특정한 물리적 차원의 상체가 필요한 경우는 소개하는 세포의 정확한 숫자는 실험적으로 결정해야합니다. 세포 수의 13 배 증가가 구형 직경의 두배 초래한다 예 - 제 근사치로서 구형 직경 혼입 세포 수의 세제곱근으로 증가 할 것으로 예상된다. <html> &quot;FO : 유지 - together.within 페이지 =&quot;_content 항상 &quot;&gt; <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1.jpg" /> 그림 1. 구형 제품의 개략도. 마이크로 웰 시스템은 세포를 원심 분리 될 수있는에 단단히 포장 사각 피라미드 마이크로 웰의 배열 (400 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa35-f9c7-69a1-8c5aa197db53" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">μ M 사이즈 cm 2 당 625)로 구성되어 있습니다. 세포는 경 사진 측벽들에 의해 소집하고, 얻어진 구형의 크기는 사용 된 세포 현탁액의 농도를 변화시킴으로써 제어된다. 50665fig2highres.jpg &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/50665/50665fig2.jpg &quot;/&gt; 그림 2. 상체에 클러스터 세포의 조립. 상체는 칠백 HT29 세포 각각에서 형성되었다. 즉시 원심 분리 한 후 (A), 세포를 느슨하게 각 마이크로 웰의 바닥에 클러스터됩니다. 클러스터가 균일이 경우 오른쪽으로 오프셋합니다. 이 클러스터 크기 배열에 걸쳐 일관성을 유지 제공 허용됩니다. 중요한 클러스터 크기의 차이가 다른 배열의 한 측면에서 본 경우, 단계 3.5의 참고를 참조하십시오. 24 시간 (B) 배양 한 후, 세포 간 접착 힘은 클러스터가 다음 추출 될 수있다 일관된 상체, (C)을 집계하고 형성하는 원인이있다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3.jpg" /><b<html> R /&gt; 그림 3. 마이크로 웰 플레이트에서 발생 상체는. 구 상체를 형성 하였다 칠백 (A, C, E) 또는 천오백 (B, D, F) HT29 결장 암 세포 (A, B), 된 LNCaP 전립선 암 세포 (C, D) 또는 TE6 식도암 세포 (E, F). 더 밀집 HT29 및 TE6 세포에 비해 특히 느슨한 된 LNCaP 응집체 - 제제 내의 구 상체의 일관성, 또한 세포주 간의 편차를 참고. 스케일 바는 200 μm의를 나타냅니다. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> 마이크로 웰 형식 </td></tr><tr><td></td><td> AggreWell (400) </td><td> AggreWell 40EX </td><td> AggreWell 800 </td></tr><tr><td> 마이크로 웰 폭 (al;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;&quot;&gt;µm ) </td><td> (400) </td><td> (400) </td><td> 800 </td></tr><tr><td> cm 2 당 마이크로 웰 </td><td> (625) </td><td> (625) </td><td> 156.25 </td></tr><tr><td> 물론 당 마이크로 웰 </td><td> 1200 </td><td> 4,700 </td><td> (300) </td></tr><tr><td> 마이크로 웰 당 최소 세포 * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 2000 </td></tr><tr><td> 마이크로 웰 당 최대 셀 * </td><td> 2,000 </td><td> 2,000 </td><td> 10,000 </td></tr><tr><td> 물론 당 최소 세포 * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 6 × 10 5 </td></tr><tr><td> 물론 당 최대 셀 * </td><td> 2.4 × 10 6 </td><td> 9.4 × 10 6 </td><td> 3 × 10 6 </td></tr><tr><td> 1.1.1 - 70 % 에탄올의 양 (㎖) </td><td> 0.5 </td><td> 2.0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 1.2.1 - 세척 용액의 양 (㎖) </td><td> 0.5 </td><td> 2.0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 3.2 - 예압 볼륨 (ML) </td><td> 0.4 </td><td> 1.6 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> 3.5 - 셀 로딩 볼륨 (ML) </td><td> 0.4 </td><td> 1.6 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td colspan="4"> 이 값이 사용되는 특정 셀의 크기로 다양하며, 경험적으로 결정되어야한다 *로서 마이크로 웰 당 세포의 숫자는 단지 근사치 </td></tr></tbody></table> 표 1. AggreWell 옵션 및 프로토콜 수정.

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Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

우리는 상업적으로 이용 가능한 마이크로 웰 플레이트를 사용하여 균일 한 크기 및 구성 제어 종양 상체의 (수천 수백 수천) 많은 수의 생성을위한 프로토콜을 소개합니다.

마이크로 웰 플레이트를 사용하여 크기 조절 종양 상체 많은 수의 생산

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.3K 조회수.  University of Calgary.  우리는 상업적으로 이용 가능한 마이크로 웰 플레이트를 사용하여 균일 한 크기 및 구성 제어 종양 상체의 (수천 수백 수천) 많은 수의 생성을위한 프로토콜을 소개합니다. 

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Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

연구

생체공학

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

회전 타원체의 포유 동물 세포의 대규모 확장을위한 지속적인 공급함으로써 영양 규정

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

약물 테스트를위한 수성 2 단계 시스템으로 암 세포 타원체의 로봇 생산

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.

A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.

인간 아데노 바이러스 유형 5를 기반으로 대용량 아데노 바이러스 벡터의 클로닝 및 대규모 생산

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts are first isolated, counted and mixed at desired cell ratios. They are co-cultured in individual wells in ultra-low attachment 96-well plates. Within 3 days, beating spheroids form. These spheroids are then picked up by a nozzle using vacuum suction and assembled on a needle array using a 3D bioprinter. The spheroids are then allowed to fuse on the needle array. Three days after 3D bioprinting, the spheroids are removed as an intact patch, which is already spontaneously beating. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

3D Bioprinting을 이용한 Spheroids의 기계적 통합을 보여주는 심장 조직의 생성

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial distribution and activities of community members. We have developed a microwell array platform that can be used to rapidly assemble and track thousands of bacterial communities in parallel. This protocol highlights the utility of the platform and describes its use for optically monitoring the development of simple, two-member communities within an ensemble of arrays within the platform. This demonstration uses two mutants of Pseudomonas aeruginosa, part of a series of mutants developed to study Type VI secretion pathogenicity. Chromosomal inserts of either mCherry or GFP genes facilitate the constitutive expression of fluorescent proteins with distinct emission wavelengths that can be used to monitor community member abundance and location within each microwell. This protocol describes a detailed method for assembling mixtures of bacteria into the wells of the array and using time-lapse fluorescence imaging and quantitative image analysis to measure the relative growth of each member population over time. The seeding and assembly of the microwell platform, the imaging procedures necessary for the quantitative analysis of microbial communities within the array, and the methods that can be used to reveal interactions between microbial species area all discussed.

The development of microbial communities depends on a combination of factors, including environmental architecture, member abundance, traits, and interactions. This protocol describes a synthetic, microfabricated environment for the simultaneous tracking of thousands of communities contained in femtoliter wells, where key factors such as niche size and confinement can be approximated.

마이크로 웰 어레이 플랫폼 내 미생물 공동체 개발의 구성 및 추적

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was pretreated with NaOH and washed to a neutral pH. Cellulase was added to the pretreated bamboo powder to generate the hydrolysate, which contained 30 g/L glucose and 15 g/L xylose and was used as the carbon source to prepare a medium for chemical production. When cultured in microaerobic conditions, 12.7 g/L 2,3-butanediol was produced by wildtype K. pneumoniae. In aerobic conditions, 13.0 g/L R-acetoin was produced by the budC mutant of K. pneumoniae. A mixture of 25.5 g/L 2-ketogluconic acid and 13.6 g/L xylonic acid was produced by the budA mutant of K. pneumoniae in a two-stage, pH-controlled fermentation with high air supplementation. In the first stage of fermentation, the culture was maintained at a neutral pH; after cell growth, the fermentation proceeded to the second stage, during which the culture was allowed to become acidic.

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Bamboo powder was pretreated with NaOH and enzymatically hydrolyzed. The hydrolysate of bamboo was used as the feedstock for 2,3-butanediol, R-acetoin, 2-ketogluconic acid, and xylonic acid production by Klebsiella pneumoniae.

화학 제품의 생산<em&gt; Klebsiella pneumoniae</em&gt; Bamboo 가수 분해물을 공급 원료로 사용

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of bioprocess conditions. One important aspect is the improvement of cultivation medium to provide an optimal environment for microbial formation of the product of interest. It is well accepted that the media composition can dramatically influence overall bioprocess performance. Nutrition medium optimization is known to improve recombinant protein production with microbial systems and thus, this is a rewarding step in bioprocess development. However, very often standard media recipes are taken from literature, since tailor-made design of the cultivation medium is a tedious task that demands microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, fast product analytics, as well as support by lab robotics to enable reliability in liquid handling steps. Furthermore, advanced mathematical methods are required for rationally analyzing measurement data and efficiently designing parallel experiments such as to achieve optimal information content.
The generic nature of the presented protocol allows for easy adaption to different lab equipment, other expression hosts, and target proteins of interest, as well as further bioprocess parameters. Moreover, other optimization objectives like protein production rate, specific yield, or product quality can be chosen to fit the scope of other optimization studies. The applied Kriging Toolbox (KriKit) is a general tool for Design of Experiments (DOE) that contributes to improved holistic bioprocess optimization. It also supports multi-objective optimization which can be important in optimizing both upstream and downstream processes.

This manuscript describes a generic approach for tailor-made design of microbial cultivation media. This is enabled by an iterative workflow combining Kriging-based experimental design and microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, which is supported by lab robotics to increase reliability and speed in liquid handling media preparation.

자동화 된 Microbioreactor 기술을 사용 하 여 분리 단백질 생산의 최적화를 위한 일반 프로토콜

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue recognized as a classical source of mesenchymal stromal/stem cells. Many studies have been published with ASCs for scaffold-based tissue engineering approaches, which mainly explored the behavior of these cells after their seeding on bioactive scaffolds. However, scaffold-free approaches are emerging to engineer tissues in vitro and in vivo, mainly by using spheroids, to overcome the limitations of scaffold-based approaches.
Spheroids are 3D microtissues formed by the self-assembly process. They can better mimic the architecture and microenvironment of native tissues, mainly due to the magnification of cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions. Recently, spheroids are mainly being explored as disease models, drug screening studies, and building blocks for 3D bioprinting. However, for 3D bioprinting approaches, numerous spheroids, homogeneous in size and shape, are necessary to biofabricate complex tissue and organ models. In addition, when spheroids are produced automatically, there is little chance for microbiological contamination, increasing the reproducibility of the method.
The large-scale production of spheroids is considered the first mandatory step for developing a biofabrication line, which continues in the 3D bioprinting process and finishes in the full maturation of the tissue construct in bioreactors. However, the number of studies that explored the large-scale ASC spheroid production are still scarce, together with the number of studies that used ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting. Therefore, this article aims to show the large-scale production of ASC spheroids using a non-adhesive micromolded hydrogel technique spreading ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Here, we describe the large-scale production of adipose-derived stromal/stem cell (ASC) spheroids using an automated pipetting system to seed the cell suspension, thus ensuring homogeneity of spheroid size and shape. These ASC spheroids can be used as building blocks for 3D bioprinting approaches.

3D 바이오프린팅을 위한 지방유래 줄기세포 구상체의 대규모, 자동화 생산

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Fabrication of Size-Controlled and Emulsion-Free Chitosan-Genipin Microgels for Tissue Engineering Applications

Chitosan microgels are of significant interest in tissue engineering due to their wide range of applications, low cost, and immunogenicity. However, chitosan microgels are commonly fabricated using emulsion methods that require organic solvent rinses, which are toxic and harmful to the environment. The present protocol presents a rapid, non-cytotoxic, non-emulsion-based method for fabricating chitosan-genipin microgels without the need for organic solvent rinses. The microgels described herein can be fabricated with precise size control. They exhibit sustained release of biomolecules, making them highly relevant for tissue engineering, biomaterials, and regenerative medicine. Chitosan is crosslinked with genipin to form a hydrogel network, then passed through a syringe filter to produce the microgels. The microgels can be filtered to create a range of sizes, and they show pH-dependent swelling and degrade over time enzymatically. These microgels have been employed in a rat growth plate injury model and were demonstrated to promote increased cartilage tissue repair and to show complete degradation at 28 days in vivo. Due to their low cost, high convenience, and ease of fabrication with cytocompatible materials, these chitosan microgels present an exciting and unique technology in tissue engineering.

The present protocol describes a non-emulsion-based method for the fabrication of chitosan-genipin microgels. The size of these microgels can be precisely controlled, and they can display pH-dependent swelling, degrade in vivo,&#160;and be loaded with therapeutic molecules that release over time in a sustained manner, making them highly relevant for tissue engineering applications.

조직 공학 응용 분야를 위한 크기 조절 및 무유제 키토산-제니핀 마이크로젤 제조

Chitosan microgels are of significant interest in tissue engineering due to their wide range of applications, low cost, and immunogenicity. However, ...