이 프로토콜은 스페로이드의 3차원 종양을 구성하는 표준화된 방법을 보여주었습니다. 그리고 이 방법론은 3D 종양 구축물의 높은 회로 및 높은 함량 분석을 제공했습니다. 표준 종양 스페로이드 구성 방법과 고처리량 이미징 및 분석 시스템을 사용하여 3차원 스페로이드에서 형성된 약물 테스트의 효과와 정확성을 크게 높일 수 있습니다.
이 프로토콜에서는 NCI-H23 스페로이드를 예로 처리하기 위해 AMG510을 사용했습니다. 실험에서 우리는 종양 스페로이드에 대한 암 표적 약물의 유의미한 효과를 관찰할 수 있었습니다. 먼저, 100마이크로리터의 유착방지 시약을 U자형 웰 바닥이 있는 48웰 플레이트의 각 웰에 피펫팅하고 10분 동안 유지합니다.
10분 후, 코팅 시약을 흡인하고 멸균된 PBS로 2회 세척한다. 섭씨 37도의 인큐베이터에 배양 접시를 넣고 5% 이산화탄소가 함유된 가습된 공기에서 사용할 때까지 넣습니다. 현미경으로 세포를 관찰하십시오.
그 후, T25 플라스크에서 배양된 세포를 PBS로 2회 세척하여 배양액을 제거하고, 팽창된 세포를 섭씨 37도의 배양기에서 1 내지 2분 동안 0.25% 트립신 EDTA로 1 밀리리터, 5% 이산화탄소로 처리하였다. 현미경으로 세포 모양을 확인합니다. 사용된 트립신 EDTA 현탁액을 T25 플라스크에 흡인하여 트립신 처리를 중단한 후 4밀리리터의 신선한 배지로 세포를 세척한다.
모든 현탁액을 15 밀리리터 튜브로 옮기고 1 밀리리터의 신선한 배지를 사용하여 잔류 세포를 씻어 내고 튜브에 첨가하십시오. 세포를 실온에서 5분 동안 186.48G에서 원심분리하고 상층액을 버립니다. 세포 펠릿에 10 밀리리터의 신선한 배지를 첨가하고 세포가 균질 한 현탁액이 될 때까지 부드럽게 피펫팅합니다.
0.1 밀리리터의 세포 현탁액을 새로운 원심분리기 튜브로 흡인한다. 0.9 밀리리터의 신선한 배지를 첨가 한 다음 현탁액을 잘 피펫팅하십시오. 세포 계수를 위해 10 마이크로리터의 세포 현탁액을 추출한다.
이 과정을 한두 번 반복하고 평균값을 구합니다. 현탁액을 희석하여 밀리리터 당 50, 000 세포의 최종 파종 밀도에 도달하십시오. 다음으로, 200 마이크로리터의 세포 현탁액을 48 웰 U자형 바닥판의 각 웰에 첨가한다.
플레이트 주위에 밀봉 필름을 감싸고 실온에서 5분 동안 119.35G에서 원심분리합니다. 원심 분리 후 보호 필름을 떼어 내고 5-8 밀리리터의 멸균 된 물을 우물을 둘러싼 수로에 첨가하십시오. 플레이트를 섭씨 37도에서 5일 동안 배양합니다.
이 기간 동안 수로에 물을 바꾸거나 보충하지 말고 다음 5일 동안 세포 응집을 관찰하십시오. 젤 임베딩의 경우 섭씨 영하 20도의 냉장고에서 얼린 젤을 꺼낸 후 실험 중 내내 아이스박스에 올려 놓는다. 현미경으로 세포 스페로이드를 관찰합니다.
젤 임베딩이 시작되기 전에 스페로이드의 상태를 다시 확인해야 합니다. 150마이크로리터의 배지를 조심스럽게 제거하고 미리 냉각된 피펫 팁을 웰 주변과 내부로 이동하면서 웰의 벽 쪽에서 액체 젤을 천천히 추가하여 각 스페로이드를 젤에 삽입합니다. 5분 동안 기다렸다가 젤이 고르게 퍼지지 않으면 10마이크로리터 피펫 팁으로 젤을 부드럽게 피펫팅합니다.
각 웰에는 종양 스페로이드, 밀리리터 겔당 3.5밀리그램의 25마이크로리터 및 50마이크로리터의 완전한 배양 배지가 들어 있습니다. 컨트롤에 75마이크로리터의 매체도 추가합니다. 하이드로겔화가 완전히 완료될 때까지 플레이트를 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.
현미경으로 겔화 상태를 확인합니다. 각 샘플에 125마이크로리터의 신선한 배지를 오버레이하고 스페로이드를 7-10일 동안 추가로 배양합니다. 각각 4-6개의 웰이 있는 스페로이드 그룹을 준비하고 분석을 위해 그 중 최소 3개를 선택합니다.
제조업체의 지침에 따라 약물을 용해시키고 DMSO로 100 배 작업 용액을 준비하십시오. 0.1%DMSO를 양성 대조군으로 사용하고 125마이크로리터의 약물 처리 배지를 각 웰에 추가합니다. 접시를 섭씨 37도의 인큐베이터에 다시 넣고 5%이산화탄소가 함유된 가습 공기에 넣습니다.
이 단계에서, 각 웰은 종양 스페로이드, 밀리리터 겔 당 3.5 밀리그램의 25 마이크로리터, 및 175 마이크로리터의 배지를 함유한다. 대조군에는 200마이크로리터의 매체가 포함되어 있습니다. 제조업체의 지침에 따라 alamarBlue 분석 키트를 사용하여 스페로이드 생존력을 측정합니다.
각 웰로부터 100 마이크로리터의 상청액 배지를 새로운 시험 플레이트로 흡인한다. 그 후, 마이크로플레이트 광도계를 이용하여 생존율을 측정하였다. 1일차, 4일차, 7일차, 10일차에 스페로이드를 젤에 삽입한 후 측정합니다.
80 마이크로리터의 신선한 배지를 배양 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 그런 다음 약물 처리 배지 100 마이크로 리터를 교체하십시오. 우물에 alamarBlue의 잔해가 없는지 확인하십시오.
이미징 전에 100마이크로리터의 배지를 흡인하고 플레이트를 스테이지에 놓습니다. 10배 대물렌즈를 가진 자동 현미경을 사용하여 스페로이드의 디지털 이미지를 얻을 수 있습니다. 현미경은 이러한 스페로이드에 자동으로 초점을 맞추고 중앙 집중화할 수 있습니다.
자동 이미징을 기다립니다. 각 스페로이드에 대해 4개의 이미지가 획득됩니다. 통합 이미지는 High Content Imaging System에 연결된 소프트웨어로 형성되고 처리됩니다.
이미지 패치 프로세스 버튼을 클릭하고 소프트웨어에서 통합 이미지를 선택합니다. U net model을 선택하고 전환율을 입력합니다. 화면 하단의 을 클릭하여 이미지 처리를 시작합니다.
지름, 둘레 및 거칠기 데이터를 스프레드시트 소프트웨어에 저장합니다. 마지막으로, 약물과 함께 100 마이크로 리터의 신선한 배지를 첨가하고 5 % 이산화탄소로 가습 된 공기에서 섭씨 37 도의 인큐베이터에 플레이트를 다시 넣습니다. 이 그림에는 다양한 농도의 AMG510으로 처리되고 고함량 현미경으로 자동 캡처된 NCI-H23 세포 스페로이드의 명시야 이미지가 나와 있습니다.
열은 서로 다른 요일을 나타내고 행은 서로 다른 약물 농도를 나타냅니다. 결과에는 각 조건에 대한 3개의 스페로이드가 포함됩니다. AMG510 처리된 샘플 그룹의 종양 스페로이드 생존율은 1일, 4일, 7일 및 10일에 측정되었습니다.
농도 구배가 있는 샘플의 말단 세포 생존율이 이 그림에 나와 있습니다. 종양 스페로이드 직경은 1일차, 4일차, 7일차 및 10일차에 측정되었습니다. 스페로이드 성장 비율은 원래 부피에 대한 말단 부피로 정의되었으며 스페로이드 직경을 사용하여 계산되었습니다.
스페로이드 성장 억제 비율은 부피를 기준으로 정의하고 스페로이드 직경을 사용하여 계산했습니다. 종양 거칠기는 1일차, 4일차, 7일차 및 10일차에 소프트웨어로 측정되었으며, 이는 종양 스페로이드의 침습성을 나타냅니다. 스페로이드의 둘레는 딥 러닝 알고리즘을 사용하여 소프트웨어에 의해 위치되고 그려졌습니다.
그런 다음 초점면의 스페로이드 영역을 이미지 J로 측정하고 이러한 데이터를 기반으로 초과 주변 지수를 계산했습니다. 이 메시지는 따르기 쉽지만 샘플은 여전히 신중하게 처리해야 합니다.
