O. 쿠 르툴​​ 루스와 D. Dimlioglu는 캘리포니아 대학 실험실 비용 연구 프로그램 상 12 LR-237197에 의해 지원됩니다. P. Daggumati는 과학 및 엔지니어링 (RISE) 상에있는 캘리포니아 대학교 데이비스 연구 투자의 대학에 의해 지원됩니다. CA 채프먼은 국립 필요 원정대의 교육 대학원 지원 분야의 부서에 의해 지원됩니다. 이 작품은 UC 랩 수수료 연구 프로그램, UC 데이비스 상승 및 엔지니어링 창업 자금 UC 데이비스 대학에 의해 지원되었다.

1. 나노 다공성 골드의 제조 <ol><li> 피라 냐가 솔루션 깨끗한 기판 <ol><li> 결정화 접시와 열 ° C 열판에 65 혼합물의 100 ML 황산 (96 %)로 25 ML의 과산화수소 (30 %)를 추가합니다. 주의 : 액체 부식성하고주의하여 취급해야합니다. 그것이 폭발의 위험이 있으므로 소비 솔루션은 밀폐 용기에 저장하지 않아야합니다. </li><li> 장소 내산성 집게 10 분으로 청소를 사용하여 혼합물로 3 인치 현미경 슬라이드 1 인치. 작은 coverslips는을 배치 청소를 위해 자기 면역 염색 보트를 사용합니다. 전에 용액에 침지 ~ 30 초 10 W에서 공기 플라즈마 작은 coverslips를 처리합니다. </li><li> 3 분 동안 탈 이온수 (DI) 흐르는 물에 결정화 요리 청소 샘플을 씻어. 보풀이없는 수건에 질소 총 타격 - 건조 시료. </li></ol></li><li> 스텐실 마스크 (미리 미터 스케일 패턴을 만들기 위해 이것을 사용 방법 1) 준비 <ol><li> 생검 펀치 및 / 또는 함께 펀치 250 μm의 두께의 실리콘 엘라스토머 시트는 반 경질 플라스틱 표면에 메스 지역을 절개. 질소 총 이소프로판올 건조 70 %의 가공 엘라스토머 시트를 청소합니다. </li><li> 보풀이없는 클린 수건에 구멍을 뚫은 시트를 배치하고 스텐실에 직면 시료 표면에 스텐실을 통해 피 세정 coverslips를 맞 춥니 다. </li></ol></li><li> 본 리프트 오프 레지스트 (방법 2 : 서브 밀리미터 스케일의 패턴을 만들기 위해이 옵션을 사용) <ol><li> 척 회전에 피 세정 현미경 슬라이드를 삽입하고 질소 총을 가진 모든 입자를 날려. 플라스틱 피펫을 사용하여 유리 슬라이드에 접착 촉진제 (헥사 메틸 디실 아젠)의 1.5 ML을 분배. 30 초 동안 5 초 1,500 rpm을 위해 500 rpm에서 연속적으로 슬라이드를 회전하여 발기인을 확산. 7 분 동안 115 ° C에서 열판에 슬라이드를 구워 5 분 동안 식히십시오. </li><li> 유리 슬라이드 위에 포토 레지스트 4 ML (3 인치 B 분배Y 1 인치). 접착 촉진제와 동일한 프로토콜을 사용하여 슬라이드를 회전시켜 포토 레지스트를 확산. 1.5 분 동안 115 ° C에서 열판에 포토 레지스트를 구워 10 분 동안 식히십시오. </li><li> 15 초 동안 투명 마스크를 통해 : UV 빛을 가진 포토 레지스트 코팅 된 슬라이드 (22 mW의 / cm 2 세기)를 노출합니다. 1.5 분 동안 115 ° C에서 열판에 포토 레지스트를 구워 45 분 동안 기다립니다. 최소 3.5 분 동안 개발자에 노출 된 포토 레지스트를 용해. DI의 물로 씻어. 광학 현미경 개발 패턴을 검사합니다. </li></ol></li><li> NP-오 얇은 필름을 생산하기 위해 보증금 전구체 금속 <ol><li> 독립적으로 금,은, 크롬을 증착 할 수있는 스퍼터링 기계로 샘플을로드합니다. 금속 증착을 시작하기 전에 25 mTorr의 아르곤 처리 분위기 하에서 50 W에서 90 초 동안 샘플을 스퍼터 - 청소합니다. </li><li> 10 mTorr의 아르곤 하에서 300 W에서 10 분 동안 크롬 스퍼터. 400 W UN에서 90 초 동안 금 스퍼터데르 10 mTorr의 아르곤. 금은을 끄기 전에 소스를 약 10 초 스퍼터 끄고 100 W. 200 W와 오 전력에서 실버 10 분 동안 금과은을 공동 스퍼터 소스를 스퍼터. </li></ol></li><li> 전구체의 금속 micropatterns에를 얻을 <ol><li> 20 초 초음파의 10주기와주기 사이에 2 분 정지를위한 포토 레지스트 스트리퍼 ~ 180 ㎖에 포토 레지스트 코팅 샘플을 초음파 처리. DI 물과 샘플을 씻어 질소 총을 건조. 현미경 금속 패턴을 검사합니다. </li><li> 용착 금속을 나타 내기 위해 두 개의 핀셋을 사용하여 비 포토 레지스트 코팅 샘플에서 탄성 스텐실 껍질. </li></ol></li><li> 열처리를 통해 Dealloy 전구체 금속 및 수정 나노 <ol><li> 질산 (70 %) 170 ml의 200 ML 유리 비커를 입력하고 열판에 55 ° C에서 용액의 온도를 유지합니다. 주의 : 질산 매우 부식성이 적절한 보호 장비를 처리해야한다. </lI&gt; <li> 이전의 질산으로 침수 30 초 10 W에서 공기 플라즈마 작은 coverslips를 처리합니다. 내산성 집게를 사용하여 비커에 3 인치 현미경 슬라이드로 장소 1 인치 dealloy 그 15 분. 작은 coverslips는을 배치 마크로에 대한 자기 면역 염색 보트를 사용합니다. </li><li> 연속적으로 신선한 탈 이온수로 3 회 채워진 두 개의 비커에서 그들을 담가 dealloyed 샘플을 씻어. DI 물에 샘플을 보관하고 적어도 일주일 동안 매일 신선한 DI 물과 물을 교체합니다. 사용하기 전에 보풀이없는 수건에 질소 총 타격 - 건조 시료. </li><li> 급속 열처리 장비 깨끗한 실리콘 웨이퍼에 샘플을로드합니다. 200 ° C와 450 ° C와 램프 속도 사이에 온도를 조정 ~ 10 ° C / 초. 질소 대기 하에서 10 분 동안 소정의 온도로 시료를 노출합니다. 챔버 식지 (&lt;100 ° C) 및 샘플을 제거합니다. 또한, 천천히 열 트리트 위해 열판에서 샘플을 배치천만에. </li></ol></li></ol> 2. 세포 배양 <ol><li> 세포 배양을위한 NP-오 샘플을 준비 <ol><li> 장소는 NP-오 폴리스티렌 요리 샘플 및 30 초 10 W에서 공기 플라즈마 처리 24 잘 조직 배양 플레이트에 샘플을 전송합니다. </li><li> 각 well에 500 ㎕의 완전한 문화 미디어 (10 % 태아 소 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신과 Dulbecco의 수정 된 이글 매체)를 추가합니다. 37 가습 배양기에서 저장 ° C와 세포를 (&lt;1 시간) 파종까지 5 % CO 2. </li></ol></li><li> 유지 관리 통로, 그리고 종자 세포 <ol><li> 문화 미디어 세포가 70 %의 합류이다 통로 T75 플라스크에 관심 세포를 (이 경우 3T3-NIH의 섬유 아세포 또는 생쥐 성상)을 유지한다. </li><li> 셀과 Passaging를 들어, 술병에서 미디어를 제거하고, 10 ㎖ 인산로 두 번 세척 식염수 (PBS)는, 세포 분리 (~ 10 분)까지 1X 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 부화 2 ㎖를 추가 버퍼. 3 ML 신선한 매체를 추가하고3 분 동안 1,200 rpm으로 원심 분리기. 뜨는을 대기음 2 ML 매체에서 펠렛을 일시 중지합니다. </li><li> 우물과 씨앗 25,000 세포 / 1 ML의 최종 볼륨 cm 2의 밀도에 유리 coverslips를 끌어 세포에서 보냈다 용지를 제거합니다. 샘플을 통해 세포의 균일 한 코팅을 보장하기 위해 앞으로 뒤로 좌우 문화 판을 흔들어. 매일 검사하는 동안 분석 될 때까지 세포를 품어. </li></ol></li></ol> 3. 셀 및 재료 분석 <ol><li> 골격과 핵을 시각화하는 세포를 얼룩 <ol><li> 우물에서 보낸 미디어를 제거하고 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 15 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정합니다. </li><li> 1 % 소 혈청 알부민 PBS에서 300 nm의 알렉사 플 루어 488 Phalloidin의의 얼룩 솔루션을 준비합니다. </li><li> PBS로 두 번 세포를 씻으, 5 분 동안 500 ㎕의 0.1 % 트리톤 PBS에서 X-100에서 그들을 permeabilize. </li><li> PBS로 두 번 세포를 씻으 우물을 청소하도록 전송합니다. 오점 50-20 분 샘플과 어둠에 보관 상 200 μL 염색 솔루션입니다. </li><li> PBS 5 분 동안 PBS에서 DAPI 3 m로 카운터 얼룩 세포를 씻으십시오. </li><li> PBS로 세포를 씻어 투명 매니큐어와 설치 미디어 및 인감 커버 유리 슬라이드에 장착하기 전에 증류수에 담근다. </li></ol></li><li> NP-의 Au 표면에 NP-오 샘플 및 세포 배양의 이미지를 얻기 <ol><li> 이미지 NP-오의 이차 전자 검출기를 사용하여 10 kV의 전자 에너지에서 50,000 X 배율과 전자 현미경 (SEM)을 스캐닝 표면. </li><li> 적절한 필터 큐브 10X 배율에서 거꾸로 형광 현미경을 사용하여 샘​​플에 다른 장소에서 복합 세포의 이미지를 캡처합니다. </li></ol></li><li> 프로세스 이미지는 모공 세포 형태를 결정 <ol><li> ImageJ에와 해당하는 경우 각각의 채널로 분할 이미​​지 열기. 8 비트 이미지를 변환, 배경 빼기 및 중간 filteri하여 그들을 부드럽게NG. 수동으로 또는 기공 (빈 공간)와 세포 기관 / 핵을 강조하기 위해 알고리즘을 thresholding을 내장하여 임계 값을 조정합니다. </li><li> 병합 모공이나 세포를 분리하는 유역 명령을 사용합니다. 입자 분석 매개 변수를 설정하고 입자 입자의 평균 영역 및 백분율 범위의 번호를 추출하는 명령을 실행합니다. %의 커버리지를 정량화 세포 계수 및 Phalloidin의 스테인드 세포의 이미지를 DAPI 염색 세포의 이미지를 사용합니다. </li><li> 여러 이미지를 일괄 분석을 수행하기 위해 포함 된 매크로 파일을 수정합니다. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Arico, A. S., Bruce, P., Scrosati, B., Tarascon, J. M., Van Schalkwijk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructured+materials+for+advanced+energy+conversion+and+storage+devices.">Nanostructured materials for advanced energy conversion and storage devices.</a> Nature Materials. 4, 366-377 (2005).</li><li>Roy, S., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructure-based+electrical+biosensors.">Nanostructure-based electrical biosensors.</a> Nano Today. 4, 318-334 (2009).</li><li>Chen, C. 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Biotechnol. 24, 1211-1218 (2006).</li><li>Weissm&#252;ller, J., Newman, R., Jin, H., Hodge, A., Kysar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theme+Article+-+Nanoporous+Metals+by+Alloy+Corrosion:+Formation+and+Mechanical+Properties.">Theme Article - Nanoporous Metals by Alloy Corrosion: Formation and Mechanical Properties.</a> Materials Research Society Bulletin. 34, 577-586 (2009).</li><li>Erlebacher, J., Aziz, M., Karma, A., Dimitrov, N., Sieradzki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+nanoporosity+in+dealloying.">Evolution of nanoporosity in dealloying.</a> Nature. 410, 450-453 (2001).</li><li>Okman, O., Lee, D., Kysar, J. 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Mater. 19, 3902 (2007).</li><li>Shulga, O., Zhou, D., Demchenko, A., Stine, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+free+prostate+specific+antigen+(fPSA)+on+a+nanoporous+gold+platform.">Detection of free prostate specific antigen (fPSA) on a nanoporous gold platform.</a> The Analyst. 133, 319-322 (2008).</li><li>Seker, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fabrication+of+low-impedance+nanoporous+gold+multiple-electrode+arrays+for+neural+electrophysiology+studies.">The fabrication of low-impedance nanoporous gold multiple-electrode arrays for neural electrophysiology studies.</a> Nanotechnology. 21, 125504 (2010).</li><li>Seker, E., Berdichevsky, Y., Staley, K. J., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication-Compatible+Nanoporous+Gold+Foams+as+Biomaterials+for+Drug+Delivery.">Microfabrication-Compatible Nanoporous Gold Foams as Biomaterials for Drug Delivery.</a> Advanced Healthcare Materials. 1, 172-176 (2012).</li><li>Okman, O., Kysar, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+Nanoporous+Gold.">Microfabrication of Nanoporous Gold.</a> Nanoporous Gold: From an Ancient Technology to a High-Tech Material. 22, 69 (2012).</li><li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+and+mechanical+properties+of+nanoporous+gold+at+the+nanoscale.">Microfabrication and mechanical properties of nanoporous gold at the nanoscale.</a> Scripta Mater. 56, 437-440 (2007).</li><li>Seker, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+post-fabrication+annealing+on+the+mechanical+properties+of+freestanding+nanoporous+gold+structures.">The effects of post-fabrication annealing on the mechanical properties of freestanding nanoporous gold structures.</a> Acta Mater. 55, 4593-4602 (2007).</li><li>Parida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+change+during+the+formation+of+nanoporous+gold+by+dealloying.">Volume change during the formation of nanoporous gold by dealloying.</a> Phys. Rev. Lett. 97, 35504-35506 (2006).</li></ol>

저자는 충돌하는 재무 적 이해 관계를 가질 수 없습니다.

우리는 마이크로 시스템즈 생물학 연구에서이 영화의 사용을 확장하는 micropattern과 NP-오 필름에 두 가지 방법을 보여줍니다. 스퍼터 코팅 금은 스퍼터링은 기존의 미세 공정과 합금 조성 및 두께는 쉽게 각 스퍼터링 건 힘의 변화에​​ 의해 제어 (금과은 대상에 대한) 될 수 있습니다와 호환이기 때문에, NP-오 패턴을 생성하는 다양한 방법 각각 증착 시간입니다. 전형적인 NP-오 필름은 200 nm의에?...

<p class="jove_content"나노 스케일 기능&gt; 재료 연료 전지 등 다양한 응용 프로그램을 향상에 약속을 보여 주었다<sup&gt; 1</sup&gt; 센서<sup&gt; 2,3</sup&gt; 생물 의학 장치<sup&gt; 4,5</sup&gt;. 비교적 새로운 재료는 나노 크기의 자기 조립 공정에 의해 생산되는 나노 기공 금 (NP-오)입니다. NP-AU에 선구자는 가장 일반적으로 원자의 비율이 60 %에서 80 %로 은색으로 구성된 금 합금이다. 짧게 특성을 오픈 기공 나노 실버가 강한 산에 의해 용해되는 클러스터의 금 원자의 재 배열 결과입니다 (<em&gt; 예를 들어,</em&gt; 질산 70 %) 또는 전기 전위에 따라<sup&gt; 6-8</sup&gt;. 큰 유효 면적 등 여러 가지 바람직한 특성, 높은 전기 전도성, 잘 확립 된 표면 기능화 기술 및 생체 적합성에서 NP-오 혜택<sup&gt; 9</sup&gt;. NP-오에 대한 연구의 급속한 확장, NP-오의 기계적 특성에 초점을 맞출 대부분이있다하더라도<sup&gt; 10,11</sup&gt; 촉매<sup&gt; 12</sup&gt;, 그리고 생명 감지 성능<sup&gt; 13-15</sup&gt;. 바람직한 특성은 여러 가지 생물로 이용하실 매우 유용하지만<sup&gt; 16, 17</sup&gt;이 영역에있는 응용 프로그램이 제한되었습니다. 이것에 대한 한 가지 가능한 이유는 대부분의 연구는 주로 매크로 스케일의 표본을 사용하고있다 (<em&gt; 예를 들어,</em&gt; 시트, 포일 및 잉곳)와 소형 시스템에서 NP-오를 통합하는 기술은 부적당 남아있다. 사실 NP-오 영화를 채용 기존의 미세 기술을 사용하여 예제의 소수에 불과있다<sup&gt; 16-20</sup&gt;. 소형화 기술과 새로운 생물 의학 도구에 대한 필요성의 출현으로, 그것은 장치에 새로운 자료를 통합 할 수있을 중요한되고있다. 이는 일반적으로 물질이 퇴적 기존의 미세 기술을 모방 할 수 있어야합니다. 또한, 세포 물질의 상호 작용의 신속한 정량은 새로운 재료의 생체 적합성을 평가하기 위해 일반적으로 필요합니다. 본 논문의 목적은 micropattern과 NP-오 영화에 대한 기본적인 기술을 설명하고 나노 구조 및 디지털 이미지 프로세싱을 통해 세포 물질의 상호 작용을 모두 정량화하는 것입니다.</p

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gold target</td>
 <td>Lesker</td>
 <td>EJTAUXX403A2</td>
 <td >Precursor to alloy for producing np-Au</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chrome target</td>
 <td>Lesker</td>
 <td>EJTCRXX353A2</td>
 <td >Adhesive layer</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silver target</td>
 <td>Lesker</td>
 <td>EJTAGXX403A2</td>
 <td >Precursor to alloy for producing np-Au</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Porcelain boat</td>
 <td>Thomas Scientific </td>
 <td>8542E40</td>
 <td >Used for processing small samples</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nitric acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>43873</td>
 <td >Used at 70% for dealloying</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sulfuric acid</td>
 <td>J.T Baker </td>
 <td>7664-93-9</td>
 <td >Used at 96% for piranha cleaning</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrogen peroxide</td>
 <td>J.T Baker </td>
 <td>7722-84-1</td>
 <td >Used at 30% for piranha cleaning</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biopsy punches</td>
 <td>Ted Pella</td>
 <td>150xx</td>
 <td >Available in several sizes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicone elastomer sheets</td>
 <td>Rogers Corporation </td>
 <td>HT 6240</td>
 <td >Available in several thicknesses</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hexamethyldisilazane</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>440191-100ML</td>
 <td >Used as adhesion promoter for positive resist</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microposit MF CD26</td>
 <td>Shipley</td>
 <td>38490</td>
 <td >Positive photoresist developer</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PRS 3000</td>
 <td>J.T Baker</td>
 <td>JT6403-5</td>
 <td >Positive photoresist stripper</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Circular glass coverslips (12 mm)</td>
 <td>Ted Pella</td>
 <td>26023</td>
 <td >Used as substrate for metal patterns and cell culture</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass slides (1 x 3 inch)</td>
 <td>Ted Pella</td>
 <td>26007</td>
 <td >Used as substrate for metal patterns</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kapton polyimide tape</td>
 <td>VWR</td>
 <td>82030-950</td>
 <td >Used for securing elastomer</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Transparency masks</td>
 <td>Output City</td>
 <td></td>
 <td>Used in photolithography <a href="http://www.outputcity.com/" target="_blank">http://www.outputcity.com/</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plasma cleaner</td>
 <td>Harrick Plasma</td>
 <td>PDC-32G</td>
 <td >Used for activating glass surfaces</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sputtering machine</td>
 <td>Kurt J. Lesker</td>
 <td>LAB18</td>
 <td >Used for depositing metals</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

microfabrication of nanoporous gold patterns for cell-material interaction studies

수십 나노 미터의 기능 크기를 가진 나노 구조 재료는 연료 전지, 바이오 센서, 생물 의학 장치 코팅 및 약물 전달 도구를 포함한 여러 기술의 성능을 강화했다. 나노 크기의 자기 조립 공정에 의해 생산 된 나노 기공 금 (NP-오)는 큰 효과 표면적, 높은 전기 전도도와 촉매 활성을 보여 비교적 새로운 소재입니다. 이러한 속성은 NP-오에게 과학 사회 매력적인 소재를 만들었습니다. NP-오에 대한 대부분의 연구는 거시적 규모의 표본을 고용하고 물질과 촉매, 센서 응용 프로그램의 기초 과학에 초점을 맞 춥니 다. 매크로 스케일의 표본은 생물 의학 장치를 포함하여 소형 시스템에서 NP-오의 잠재력을 제한 할 수 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 처음에 딱딱한 기판 micropattern과 NP-오 박막의 두 가지 방법을 설명합니다. 첫 번째 방법은, 간편하게 조절할를 밀리미터 규모의 NP-오 패턴을 만들기 위해 직접 제작 한 스텐실 마스크를 고용E는 두 번째 방법은 본 서브 밀리미터 스케일 패턴 리프트 오프 리소그래피를 사용합니다. NP-오 박막 스퍼터링 증착 공정에 의해 얻을 수있다, 그들은 마이크로에 손쉬운 통합함으로써 의무가 기존의 미세 기술과 호환됩니다. 이러한 시스템은 높은 효과적인 표면적, 전기 전도도, 및 금 - 싸이 기반 표면의 바이오 콘쥬 게이션에서 해당 혜택을 전기적 주소 바이오 센서 플랫폼 (가) 있습니다. 우리는 몇 가지 바이오 센서에 대한 중요한 성능 매개 변수 포유 동물 세포와 NP-오의 상호 작용을 정량화 세포 배양, 면역 염색, 및 이미지 처리 기술을 설명합니다. 우리는 여기에 설명 된 기술은 다양한 길이 비늘 및 바이오 센서, 에너지 저장 시스템, 촉매 등 다양한 애플리케이션의 플랫폼에서 NP-오의 통합을 지원할 것으로 기대합니다.

그림 1은 배양 세포를 NP-오 패턴을 만드는 나노 구조를 정량화하고, 세포의 형태학의 특성을 포함하여 주요 절차 단계를 설명합니다. 그림 2a에서와 같이 탄성 스텐실 (TOP) 아래 이미지에서와 같이 NP-오 패턴을 만드는 데 사용됩니다. 그림 2B는 일괄 처리 시편 도자기 보트의 사진입니다. 그림 2C는 용착 금속 패턴의 색 변화를 표시 이전과 마크로 ?...

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Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

우리는 스텐실 인쇄 및 석판뿐만 아니라 미세하게 패턴에 대한 배양 세포에 방법을 통해 micropattern과 나노 다공성 금 박막에 대한 기술을보고합니다. 또한, 우리는 물질과 주사 전자 및 형광 현미경 기술을 이용하여 배양 된 세포의 형태를 특성화하는 이미지 분석 방법을 설명합니다.

세포 물질의 상호 작용 연구를위한 나노 기공 골드 패턴의 미세

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.3K 조회수.  University of California, Davis. 우리는 스텐실 인쇄 및 석판뿐만 아니라 미세하게 패턴에 대한 배양 세포에 방법을 통해 micropattern과 나노 다공성 금 박막에 대한 기술을보고합니다. 또한, 우리는 물질과 주사 전자 및 형광 현미경 기술을 이용하여 배양 된 세포의 형태를 특성화하는 이미지 분석 방법을 설명합니다.

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Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new devices for label-free separation and analysis of cells1. Such devices may use lateral displacement for continuous-flow separation, or receptor patterns that modulate adhesion to distinguish between different cell phenotypes or levels of receptor expression. Understanding the nature of cell rolling trajectories on receptor-patterned substrates is necessary for engineering of the substrates and design of such devices.
Here, we demonstrate a protocol for studying cell rolling trajectories on asymmetric receptor patterns that support cell rolling adhesion2. Well-defined, &mu;m-scale patterns of P-selectin receptors were fabricated using microcontact printing on gold-coated slides that were incorporated in a flow chamber. HL60 cells expressing the PSGL-1 ligand 3were flowed across a field of patterned lines and visualized on an inverted bright field microscope. The cells rolled and tracked along the inclined edges of the patterns, resulting in lateral deflection1. Each cell typically rolled for a certain distance along the pattern edges (defined as the edge tracking length), detached from the edge, and reattached to a downstream pattern. Although this detachment makes it difficult to track the entire trajectory of a cell from entrance to exit in the flow chamber, particle-tracking software was used to analyze and yield the rolling trajectories of the cells during the time when they were moving on a single receptor-patterned line. The trajectories were then examined to obtain distributions of cell rolling velocities and the edge tracking lengths for each cell for different patterns.
This protocol is useful for quantifying cell rolling trajectories on receptor patterns and relating these to engineering parameters such as pattern angle and shear stress. Such data will be useful for design of microfluidic devices for label-free cell separation and analysis.

We describe a protocol to observe and analyze cell rolling trajectories on asymmetric receptor-patterned substrates. The resulting data are useful for engineering of receptor-patterned substrates for label-free cell separation and analysis.

비대칭 수용체 패턴에 셀 롤링의 탄도를 공부

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new ...

연구

생체공학

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently incorporated into film assemblies that serve as adsorption platforms for protein monolayer electrochemistry (PME). PME is utilized as the model system for studying electrochemical properties of redox proteins by confining them to an adsorption platform at a modified electrode, which also serves as a redox partner for electron transfer (ET) reactions. Studies have shown that gold nanoparticle film assemblies of this nature provide for a more homogeneous protein adsorption environment and promote ET without distance dependence compared to the more traditional systems modified with alkanethiol self-assembled monolayers (SAM).1-3 In this paper, MPCs functionalized with hexanethiolate ligands are synthesized using a modified Brust reaction4 and characterized with ultraviolet visible (UV-Vis) spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), and proton (1H) nuclear magnetic resonance (NMR). MPC films are assembled on SAM modified gold electrode interfaces by using a "dip cycle" method of alternating MPC layers and dithiol linking molecules. Film growth at gold electrode is tracked electrochemically by measuring changes to the double layer charging current of the system. Analogous films assembled on silane modified glass slides allow for optical monitoring of film growth and cross-sectional TEM analysis provides an estimated film thickness. During film assembly, manipulation of the MPC ligand protection as well as the interparticle linkage mechanism allow for networked films, that are readily adaptable, to interface with redox protein having different adsorption mechanism. For example, Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) can be adsorbed hydrophobically to dithiol-linked films of hexanethiolate MPCs and cytochrome c (cyt c) can be immobilized electrostatically at a carboxylic acid modified MPC interfacial layer. In this report, we focus on the film protocol for the AZ system exclusively. Investigations involving the adsorption of proteins on MPC modified synthetic platforms could further the understanding of interactions between biomolecules and man-made materials, and consequently aid the development of biosensor schemes, ET modeling systems, and synthetic biocompatible materials.5-8

Alkanethiolate stabilized gold colloids known as monolayer protected clusters (MPCs) are synthesized, characterized, and assembled into thin films as an adsorption interface for protein monolayer electrochemistry of simple redox protein like Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) and cytochrome c (cyt c).

Monolayer의 합성, 조립, 그리고 특성화는 단백질 Monolayer의 전기에 대한 골드 Nanoparticle 필름을 보호

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

생리 흐름 조건에서 순환 세포의 케모카인 - 감독 넘쳐을 연구하는 소설 입체 흐름 챔버 장치

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Electronic Tongue Generating Continuous Recognition Patterns for Protein Analysis

In current protocol, a combinatorial approach has been developed to simplify the design and production of sensing materials for the construction of electronic tongues (eT) for protein analysis. By mixing a small number of simple and easily accessible molecules with different physicochemical properties, used as building blocks (BBs), in varying and controlled proportions and allowing the mixtures to self-assemble on the gold surface of a prism, an array of combinatorial surfaces featuring appropriate properties for protein sensing was created. In this way, a great number of cross-reactive receptors can be rapidly and efficiently obtained. By combining such an array of combinatorial cross-reactive receptors (CoCRRs) with an optical detection system such as surface plasmon resonance imaging (SPRi), the obtained eT can monitor the binding events in real-time and generate continuous recognition patterns including 2D continuous evolution profile (CEP) and 3D continuous evolution landscape (CEL) for samples in liquid. Such an eT system is efficient for discrimination of common purified proteins.

A novel approach is described for construction of electronic tongue (eT), which greatly simplifies the design and production of sensing materials, and allows the eT to generate continuous evolution profiles and landscapes for samples in liquid. The obtained eT is efficient for common protein analysis such as discrimination.

단백질 분석을위한 지속적인 인식 패턴을 생성하는 전자 혀

In current protocol, a combinatorial approach has been developed to simplify the design and production of sensing materials for the construction of ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

샌드위치 같은 미세 환경은 셀 / 재료의 상호 작용을 활용하는

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to their intense optical absorbance in the near-infrared window, low cytotoxicity and potential to home into tumors. However, their delivery to tumors still remains an issue. An innovative approach consists of the exploitation of the tropism of tumor-associated macrophages that may be loaded with gold nanorods in vitro. Here, we describe the preparation and the photoacoustic inspection of cellular vehicles containing gold nanorods. PEGylated gold nanorods are modified with quaternary ammonium compounds, in order to achieve a cationic profile. On contact with murine macrophages in ordinary Petri dishes, these particles are found to undergo massive uptake into endocytic vesicles. Then these cells are embedded in biopolymeric hydrogels, which are used to verify that the stability of photoacoustic conversion of the particles is retained in their inclusion into cellular vehicles. We are confident that these results may provide new inspiration for the development of novel strategies to deliver plasmonic particles to tumors.

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

금 나노 막대를 포함하는 세포 차량의 제조 및 광 음향 분석

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting and drug delivery are some of the applications of these AuNPs, but endothelial extracellular matrices&#39; defensive properties hamper particle uptake. To address this issue, we describe a synthesis method for ultrasmall gold nanoparticles to improve vascular delivery, with customizable functional groups and polymer lengths for further adjustments. The protocol yields 2.5 nm AuNPs that are capped with tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC). The replacement of THPC with hetero-functional polyethylene glycol (PEG) on the surface of the AuNP increases the hydrodynamic radius to 10.5 nm while providing various functional groups on the surface. The last part of the protocol includes an optional addition of a fluorophore to allow the AuNPs to be visualized under fluorescence to track nanoparticle uptake. Dialysis and lyophilization were used to purify and isolate the AuNPs. These fluorescent nanoparticles can be visualized in both in vitro and in vivo experiments due to the biocompatible PEG coating and fluorescent probes. Additionally, the size range of these nanoparticles render them an ideal candidate for probing the glycocalyx without disrupting normal vasculature function, which may lead to improved delivery and therapeutics.

We describe a method of synthesizing biocompatible 10-nm gold nanoparticles, functionalized by coating poly-ethylene glycol onto the surface. These particles can be used in vitro and in vivo for delivering therapeutics to nanoscale cellular and extracellular spaces that are difficult to access with conventional nanoparticle sizes.

기능성된 10 nm 폴리머-코팅 된 금 입자 피 대상에 대 한 및 약물 전달의 합성

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

멀티플렉스 인공 세포 MicroEnvironment 배열의 제작

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been devoted to their development. In this protocol, a recently developed, facile method for preparation of water soluble, biocompatible, and colloidally stable near-infrared emitting AuNCs have been described in detail. This room-temperature, bottom-up chemical synthesis provides easily functionalizable AuNCs capped with thioctic acid and thiol-modified polyethylene glycol in aqueous solution. The synthetic approach requires neither organic solvents or additional ligand exchange nor extensive knowledge of synthetic chemistry to reproduce. The resulting AuNCs offer free surface carboxylic acids, which can be functionalized with various biological molecules bearing a free amine group without adversely affecting the photoluminescent properties of the AuNCs. A quick, reliable procedure for flow cytometric quantification and confocal microscopic imaging of AuNC uptake by HeLa cells also been described. Due to the large Stokes shift, proper setting of filters in flow cytometry and confocal microscopy is necessary for efficient detection of near-infrared photoluminescence of AuNCs.

A reliable and easily reproducible method for preparation of functionalizable, near-infrared emitting photoluminescent gold nanoclusters and their direct detection inside HeLa cells by flow cytometry and confocal laser scanning microscopy is described.

생물학적 응용 을 위한 근적외선 방출 금 나노클러스터의 합성

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been ...

Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and size distribution of nanoparticles is of utmost importance for various applications. The size range is also important, as it defines the most &#8220;active&#8221; component of a nanoparticle dose.
Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation (AF4) is a powerful technique for sizing of particles in suspension in the size range of approximately 1&#8211;1000 nm. There are several ways to derive size information from an AF4 experiment. Besides coupling AF4 online with size-sensitive detectors based on the principles of Multi-Angle Light Scattering or Dynamic Light Scattering, there is also the possibility to correlate the size of a sample with its retention time using a well-established theoretical approach (FFF theory) or by comparing it with the retention times of well-defined particle size standards (external size calibration).
We here describe the development and in-house validation of a standard operating procedure (SOP) for sizing of an unknown gold nanoparticle sample by AF4 coupled with UV-vis detection using external size calibration with gold nanoparticle standards in the size range of 20&#8211;100 nm. This procedure provides a detailed description of the developed workflow including sample preparation, AF4 instrument setup and qualification, AF4 method development and fractionation of the unknown gold nanoparticle sample, as well as the correlation of the obtained results with the established external size calibration. The SOP described here was eventually successfully validated in the frame of an interlaboratory comparison study highlighting the excellent robustness and reliability of AF4 for sizing of nanoparticulate samples in suspension.

This protocol describes the use of Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation coupled with UV-vis detection for the determination of the size of an unknown gold nanoparticle sample.

현탁액에서 금 나노 입자의 크기 조정을위한 비대칭 유동 필드 흐름 분획

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and ...