저자 인정 소스는 영국 공학 및 물리 과학 연구 협의회 (부여 심판 등의 다양 한 금융 지원. EP/K011685/1, EP/K024485/1)와 JH;에 대 한 대학원 재학 Leverhulme 트러스트 (롤플레잉-2014-292); Wellcome 신뢰 기관 전략적 지원 기금 (105610/Z/14/Z); 영국 문화원 (216196834); 그리고 맨체스터 대학의 맨체스터 연구소 (하루 펌프 못쓰게 기금)와 박사 안드레아스 리브 (Nanosurf AG)에 의해 남서 기술 원조에 대통령 박사 장학금 대학에 대 한 또한 기꺼이 인정 했다.

<ol>
	<li>Saavedra, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+Strategies+in+Nanolithography.">Hybrid Strategies in Nanolithography.</a> Rep. Prog. Phys. 73, 036501 (2010).</li><li>Gates, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Approaches+to+Nanofabrication:+Molding,+Printing,+and+Other+Techniques.">New Approaches to Nanofabrication: Molding, Printing, and Other Techniques.</a> Chem. Rev. 105, 1171-1196 (2005).</li><li>Garcia, R., Knoll, A. W., Riedo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+Scanning+Probe+Lithography.">Advanced Scanning Probe Lithography.</a> Nat. Nanotechnol. 9, 577-587 (2014).</li><li>Piner, R. D., Zhu, J., Xu, F., Hong, S., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Dip-Pen"+Nanolithography.">"Dip-Pen" Nanolithography.</a> Science. 283, 661-663 (1999).</li><li>Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+Dip-Pen+Nanolithography.">Applications of Dip-Pen Nanolithography.</a> Nat. Nanotechnol. 2, 145-155 (2007).</li><li>Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fountain+Pen+Nanochemistry:+Atomic+Force+Control+of+Chrome+Etching.">Fountain Pen Nanochemistry: Atomic Force Control of Chrome Etching.</a> Appl. Phys. Lett. 75, 2689-2691 (1999).</li><li>Kim, K. -. H., Moldovan, N., Espinosa, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Nanofountain+Probe+with+Sub-100+Molecular+Writing+Resolution.">A Nanofountain Probe with Sub-100 Molecular Writing Resolution.</a> Small. 1, 632-635 (2005).</li><li>Gruter, R. R., Voros, J., Zambelli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FluidFM+as+a+Lithography+Tool+in+Liquid:+Spatially+Controlled+Deposition+of+Fluorescent+Nanoparticles.">FluidFM as a Lithography Tool in Liquid: Spatially Controlled Deposition of Fluorescent Nanoparticles.</a> Nanoscale. 5, 1097-1104 (2013).</li><li>Salaita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+Parallel+Dip-Pen+Nanolithography+with+55+000-Pen+Two-Dimensional+Arrays.">Massively Parallel Dip-Pen Nanolithography with 55 000-Pen Two-Dimensional Arrays.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7220-7223 (2006).</li><li>Huo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+Pen+Lithography.">Polymer Pen Lithography.</a> Science. 321, 1658-1660 (2008).</li><li>Shim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hard-Tip,+Soft-Spring+Lithography.">Hard-Tip, Soft-Spring Lithography.</a> Nature. 469, 516-520 (2011).</li><li>Liao, X., Braunschweig, A. B., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Force-Feedback"+Leveling+of+Massively+Parallel+Arrays+in+Polymer+Pen+Lithography.">"Force-Feedback" Leveling of Massively Parallel Arrays in Polymer Pen Lithography.</a> Nano Lett. 10, 1335-1340 (2010).</li><li>Wang, S., Hosford, J., Heath, W. P., Wong, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Area+Scanning+Probe+Nanolithography+Facilitated+by+Automated+Alignment+of+Probe+Arrays.">Large-Area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment of Probe Arrays.</a> RSC Adv. 5, 61402-61409 (2015).</li><li>Noh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Multipoint+Force+Feedback"+Leveling+of+Massively+Parallel+Tip+Arrays+in+Scanning+Probe+Lithography.">"Multipoint Force Feedback" Leveling of Massively Parallel Tip Arrays in Scanning Probe Lithography.</a> Small. 11, 4526-4531 (2015).</li><li>Dalby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Control+of+Human+Mesenchymal+Cell+Differentiation+Using+Nanoscale+Symmetry+and+Disorder.">The Control of Human Mesenchymal Cell Differentiation Using Nanoscale Symmetry and Disorder.</a> Nat. Mater. 6, 997-1003 (2007).</li><li>Connell, C. D., Higgins, M. J., Moulton, S. E., Wallace, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-Bioelectronics+via+Dip-Pen+Nanolithography.">Nano-Bioelectronics via Dip-Pen Nanolithography.</a> J. Mater. Chem. C. 3, 6431-6444 (2015).</li><li>Giam, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Probe-Enabled+Nanocombinatorics+Define+the+Relationship+Between+Fibronectin+Feature+Size+and+Stem+Cell+Fate.">Scanning Probe-Enabled Nanocombinatorics Define the Relationship Between Fibronectin Feature Size and Stem Cell Fate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 4377-4382 (2012).</li><li>Eichelsdoerfer, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Area+Molecular+Patterning+with+Polymer+Pen+Lithography.">Large-Area Molecular Patterning with Polymer Pen Lithography.</a> Nat. Protoc. 8, 2548-2560 (2013).</li><li>Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irreversible,+Direct+Bonding+of+Nanoporous+Polymer+Membranes+to+PDMS+or+Glass+Microdevices.">Irreversible, Direct Bonding of Nanoporous Polymer Membranes to PDMS or Glass Microdevices.</a> Lab Chip. 10, 548-552 (2010).</li><li>Liao, X., Braunschweig, A. B., Zheng, Z., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-+and+Time-Dependent+Feature+Size+and+Shape+Control+in+Molecular+Printing+via+Polymer-Pen+Lithography.">Force- and Time-Dependent Feature Size and Shape Control in Molecular Printing via Polymer-Pen Lithography.</a> Small. 6, 1082-1086 (2010).</li><li>Sheehan, P. E., Whitman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol+Diffusion+and+The+Role+of+Humidity+in+"Dip+Pen+Nanolithography".">Thiol Diffusion and The Role of Humidity in "Dip Pen Nanolithography".</a> Phys. Rev. Lett. 88, 156104 (2002).</li><li>Geissler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+Metal+Nanowires+Using+Microcontact+Printing.">Fabrication of Metal Nanowires Using Microcontact Printing.</a> Langmuir. 19, 6301-6311 (2003).</li><li>Gmeiner, B., Leibl, H., Zerlauth, G., Seelos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+Binding+of+Distinct+Functional+Fibronectin+Domains+to+Immobilized+Metal+Chelates.">Affinity Binding of Distinct Functional Fibronectin Domains to Immobilized Metal Chelates.</a> Arch. Biochem. Biophys. 321, 40-42 (1995).</li><li>Curran, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introducing+Dip+Pen+Nanolithography+as+a+Tool+for+Controlling+Stem+Cell+Behaviour:+Unlocking+the+Potential+of+the+Next+Generation+of+Smart+Materials+in+Regenerative+Medicine.">Introducing Dip Pen Nanolithography as a Tool for Controlling Stem Cell Behaviour: Unlocking the Potential of the Next Generation of Smart Materials in Regenerative Medicine.</a> Lab Chip. 10, 1662-1670 (2010).</li><li>Davey, M. R., Anthony, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Cell Culture: Essential Methods. , 153-172 (2010).</li><li>Brinkmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdigitated+Multicolored+Bioink+Micropatterns+by+Multiplexed+Polymer+Pen+Lithography.">Interdigitated Multicolored Bioink Micropatterns by Multiplexed Polymer Pen Lithography.</a> Small. 9, 3266-3275 (2013).</li><li>Senesi, A. J., Rozkiewicz, D. I., Reinhoudt, D. N., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose-Assisted+Dip-Pen+Nanolithography+of+Oligonucleotides+and+Proteins.">Agarose-Assisted Dip-Pen Nanolithography of Oligonucleotides and Proteins.</a> ACS Nano. 3, 2394-2402 (2009).</li><li>Carnally, S. A. M., Wong, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+Catalysis+to+Enhance+Scanning+Probe+Nanolithography.">Harnessing Catalysis to Enhance Scanning Probe Nanolithography.</a> Nanoscale. 6, 4998-5007 (2014).</li></ol>

정렬 알고리즘 및 소프트웨어에 의해, 개발 되었다 고 독점, 맨체스터 대학. 그것은 http://www.click2go.umip.com/에서 다운로드할 수 있습니다.

이 프로토콜 nanolithographic 대형에 높은 균일성 및 제어 기능 크기 패턴화 빠르게 수행 하기 위해 편리한 방법을 사용자에 게 제공 하는 역할 (cm2) 지역. 이러한 큰 지역 nanopatterns 베어링 기판 다양 한 응용 프로그램에 대 한 더 정교 수 다음. 이 기술의 주요 응용 프로그램 세포 표면 상호 작용 연구에 대 한 nanofabricated 표면에의 세대입니다. 이 보고서는 nanofabricated 기판에 의해 hMSC 형태학의 제어를 보여주는 이러한 자료에 세포 배양의 몇 가지 설명을 예를 보여줍니다.
이 프로토콜의 주요 원동력은 허용 매우 균일 하 고 높은 처리량 생산 기능의 표면, 세포 배양 실험의 급속 한 회전율을 가능 하 게 나노 해상도 아래에 정렬 절차 (4 단계)의 자동화. 이 정렬 알고리즘을 사용 하 여 실시 하는 폴리머 펜 리소 약 30 분 이내 나노 기능을 생성 할 수 있다. 그러나 재현성 및 자동된 정렬의 정확도 그리고 이렇게 꽃무늬 기능의 균일성은 프로브 배열의 품질에 따라 (단계 1 및 2)를 생산 하는 비판적 이다. 무딘, 손상 또는 누락 된 프로브; 귀착되는 그들의 준비에 어떤 결함 갇힌된 공기 등 거품 (1.5 단계) 또는 마스터 (단계 1.8)에서 프로브의 부적절 한 분리는 부정확 한 정렬 및 품질이 리소 그래피에서 발생할 수 있습니다.
이 포스 피드백에 의존 하는 다른 정렬 방법 함께 제한을 공유 하는 방법 보고. 표면 접촉 프로브는 때의 정확한 결정은 주변 환경 및 샘플 무대의 움직임으로 인 한 배경 진동에 대 한 계정이 필요에 의해 제한 됩니다. 일반적으로 센서 µN 정권 (이 경우 2 µN)에 있는 힘 감도 있지만 정렬 알고리즘은만 어떤 '오판' resul 피하기 위해 프로브, 표면 사이의 확실 한 접촉으로 적어도 490 µN의 힘을 등록 하도록 배경 잡음 으로부터 ting 보통. 13 따라서,이 메서드는 큰 특징 (1-2 µ m)를 생산 하 경향이 있다. 프로브 z에 큰 거리를 확장 해야 합니다 이후-축 (결과 높은 힘)와 연락처를 등록 하기 위하여. 보상 하기 위하여 더 작은 기능 z를 줄임으로써 생성 될 수 있습니다-축 거리 여행 단계에서 리소 그래피 (예를 들어, 5 µ m 대신 3 µ m로 '검은' 설정 단계 5.2.3.2에서에서 입력).
그럼에도 불구 하 고, 심지어이 제한 자동화 알고리즘은 병렬화 스캐닝 프로브 리소 그래피 방법의 응용 프로그램에서 중요 한 측면을 해결할 수 정렬 가장 시간을 요구 하 고 부정 확 한 단계에 이전 되면서는 이러한 기술 구현 합니다. 지금이 자동화 석판 작성 자체는 정렬에서 제조 프로세스의 속도 제한 단계를 이동 합니다. 이 프로토콜은 ppl이 정렬 절차의 응용 프로그램을 보여 줍니다, 하는 동안 프레임 워크 다양 한 지질 DPN26 매트릭스를 이용한 리소 그래피27 뿐만 아니라 잠재적인 미래 촉매 SPL 기법에 적용 될 수 있습니다. 프로브 시스템입니다. 28

나노기술에서 발전 기술 효율적이 고 안정적으로 표면에 나노 기능 조작 능력의 개발에 따라 달라 집니다. 1 , 그러나 2 , 등을 생성 하는 것은 큰 지역 (여러 cm2) 안정적으로 기능과에서 상대적으로 저가 아닌 사소한 것은 노력 이다. 대부분 기존 기술, 반도체 산업에서 파생 된 '하드' 자료 조작 하 절제 사진 평판에 의존 합니다. 더 최근에, 스캐닝 프로브 현미경 (SPM)에서 파생 된 석판 기법 나노 디자인의 신속한 프로토 타입에 대 한 편리 하 고 다양 한 방법으로 떠오르고 있다. 3 SPM 기반 기술을 편리 하 고 빠르게 '쓰기' 어떤 사용자 정의 패턴 수 있습니다. 이들 중 가장 유명한 딥 펜 나노리 (DPN) Mirkin 외.,4 스캐닝 프로브 패션 글을 유사한 기능을 생산 하는 표면에 분자 '잉크'를 전송 하는 '펜'으로 사용 됩니다 어디에 의해 개척 이다. 주위 조건 하에서 조사는 표면에 걸쳐 스캔으로 '잉크' 분자는 표면를 통해 에 전송 됩니다 프로브 및 표면 (그림 1) 사이 형성 하는 물 초승달 모양. DPN 따라서 다양 한 자료를 포함 한 '부드러운' 생체 고분자 등의 nanolithographic 증 착을 수 있습니다. 5 관련된 기술 공학 유체 배달 채널 프로브를 사용 하 여 각종 라고도 'nanopipettes'와 '나노-만년필' 또한 보고 되었습니다. 6 , 7 , 8
SPM 파생 리소 그래피의 광범위 한 응용 프로그램에 주요 장애물은 처리량, 단일 프로브 패턴 센티미터 규모 영역에 지나치게 오랜 시간이 필요 합니다. 이 문제를 해결 하려면 초기 노력 ' 한-차원 '과 '2 차원' (2D) 프로브 배열 센티미터 크기의 지역의 리소 그래피에 대 한 보고 되 고 캔틸레버 기반 DPN의 병렬화에 집중 했다. 5 , 그러나 9 , 이러한 캔틸레버 어레이 상대적으로 복잡 한 다단계 제조 방법을 통해 생산 되며 상대적으로 깨지기 쉬운. 폴리머 펜 리소 그래피 (PPL)의 발명 소프트 실록 탄성 프로브는 유리 슬라이드에 보 세의 2D 배열 표준 SPM 캔틸레버를 대체 하 여이 문제를 해결. 10 비용 및 나노리 애플 리 케이 션의 넓은 범위를 개방, 넓은 영역을 패턴화의 복잡성이 간단한 프로브 설치는 크게 감소 합니다. 이 외팔보 무료 아키텍처 또한 하드 팁 소프트 봄 리소 그래피,11 하드 실리콘 팁 주는 소프트를 사용 하 여 생산 하는 패턴에 비해 향상 된 해상도와 부드러운 탄성 지지의 하이브리드를 제공 하도록 확장 되었습니다. 고무 팁입니다.
이러한 2D 배열 기술의 실행에 중요 한 요소는 프로브 배열 정확 하 게 평행 해야 표면 기판 리소 그래피를 활용 하면 모든 프로브 표면 접촉 되도록 동시에입니다. 심지어 작은 오차 발생할 수 있습니다 기능 크기에서 큰 차이 배열의 1 개의 측에서 다른, 이후 일부 프로브 것 이다 접촉 표면 배열, 하강 하는 동안 이전 이후 또는 전혀 다른 접촉으로 올 것 이다 하는 동안. 12 이전 표면 접촉 프로브 압축 될 정확한 맞춤 부드러운 탄성 중합체 프로브 deformability 때문 PPL로 특히 중요 하다 표면에 큰 발자국을 떠나.
PPL에 대 한 초기 작업 정렬 프로세스, 그들은 표면에 접촉으로 주어졌다 피라미드 프로브 변형의 관찰을 배열 위에 장착 된 카메라를 사용 하 여 순전히 시각적인 검사를 고용. 10 맞춤 프로브의 측면을 먼저, 표면 접촉으로 온 관찰 하 고 다음 각도 조정 하 고 접촉 프로브 양쪽에 차이 때까지 반복 방식으로 절차를 반복 하 여 판단 했다 눈에 구별. 이 정렬 프로시저 연산자에서 주관적인 육안 검사에 의존, 재현성이 낮습니다.
그 후, 좀 더 객관적인 접근 개발 되었습니다, 기판의 표면에 프로브 접촉 시 적용 되는 힘 측정 아래 장착 힘 센서의 구성. 12 맞춤 따라서 모든 프로브 동시에 접촉에 지적 발휘, 힘을 최대화 하기 위해 경사 각도 조정 하 여 달성 되었다. 이 방법은 표면 병렬의 0.004 ° 이내에 맞춤 가능 했다 보여주었다. 이 '힘 피드백 평등 화'는 지금 두 개의 독립적인 보고서에 완전 자동화 된 시스템으로 구현 되었습니다. 13 , 14 모두 탑재 기판 아래 또는 위에 배열 하는 힘 센서의 트라이 어 드를 사용 하 고 프로브 배열 및 표면 사이의 접촉 시가 해지는 힘의 양을 측정. 이러한 시스템 제공 높은 정밀도, 1cm 길이 규모,14 또는 ≤ 0.0003 ° 1.4 cm.13 이러한 자동된 맞춤 시스템 제공을 통해 주요 절감 연산자 시간과 완료에 소요 된 전체 시간 ≤0.001 °의 부정합을 보고는 리소 그래피 과정입니다.
이 기술에 의해 사용 하는 높은 처리량 표면 제조의 주요 응용 프로그램은 셀 문화 기판의 세대입니다. 지금은 잘 설립 초기 세포 표면 기능, 상호작용을 제어 하 여 그 세포 표현 형을 조작할 수 있습니다 그리고이 나노 크기에서 강화 될 수 있다. 15 특히 스캐닝 프로브 리소 그래피 방법은 표시 되었습니다 다양 한 nanofabricated 표면 같은 세포 배양 실험에 대 한 생산 하는 손쉬운 방법. 16 예를 들어 자기 조립된 monolayers와 세포 외 기질 단백질 PPL와 DPN 템플릿 소재 나노 수정 자료의 가능성을 공부 하 사용 되었습니다의 나노 패턴을 제시 하는 표면 유도의 차별화 줄기 세포입니다. 17
이 프로토콜 수정된 원자 힘 현미경 (AFM) 시스템입니다 큰 지역 PPL의 활용을 설명 합니다. 우리 선발 프로브 표면 접촉, 반복적인 정렬 프로세스를 자동화 하는 함께 결정 하는 수단으로 여러 힘 센서를 사용 하 여 힘의 탐지. 세포 외 기질 단백질 fibronectin 이러한 패턴의 후속 기능화와 인간 중간 엽 줄기 세포 (hMSC)의 문화는 설명, PPL 조작 표면 세포 배양에 대 한 적용의 데모.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexAFM mounted on a motorised 5-axis (XYZ&#920;&#934;) translation and goniometer stage</td>
			<td>NanoSurf</td>
			<td>P40008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM control software</td>
			<td>NanoSurf</td>
			<td>C3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Engraving pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z225568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick plasma</td>
			<td>PDC-32G-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasmaFlo</td>
			<td>Harrick plasma</td>
			<td>PDC-FMG-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Economy Dry Oxygen Service Pump</td>
			<td>Harrick plasma</td>
			<td>PDC-OPE-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>SB3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5311-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water Purification System</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>ZRXQ015WW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modular Humidity Generator</td>
			<td>proUmid</td>
			<td>MHG32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proline Plus Pipette 100-1000 &#181;L</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>728070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon masters</td>
			<td>NIL Technology</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright snapshot fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope objectives</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>10x and 60x UPlan FLN &#8734;/-/FN 26.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright bright field microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM 2500M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonicator</td>
			<td>Ultrawave Ltd.</td>
			<td>U95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet for recording and intepreting automated alignment results</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34863</td>
			<td>FLAMMABLE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Sildes, Clear, Ground</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>451000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(7&#8211;8% vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxy-terminated</td>
			<td>Gelest</td>
			<td>VDT-731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane</td>
			<td>Gelest</td>
			<td>SIT7900.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum(0)-1,3-divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane complex solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>479527</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(25&#8211;35% methylhydrosiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxane-terminated</td>
			<td>Gelest</td>
			<td>HMS-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh Boat 100 mL</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>BALI828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Appleton Woods</td>
			<td>KS230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>82.1473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ST10-031T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Carbon Tape</td>
			<td>Agar scientific</td>
			<td>AGG3939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16-Mercaptohexadecanoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>448303-1G</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34852</td>
			<td>FLAMMABLE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold coated microscope slide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>643203</td>
			<td>Once opened gold will remain reactive to thiols for at least 1 month</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron(III) nitrate nonahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>529303</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84415</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(11-Mercaptoundecyl)hexa(ethylene glycol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>675105</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt(II) nitrate hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203106</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium</td>
			<td>Lonza UK</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>Lonza UK</td>
			<td>PT-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Multifuge X1 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR Centrifuge Tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P/0840/53</td>
			<td>HARMFUL, TOXIC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>&#34;Detergent&#34; in manuscript</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-fibronectin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab2413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10253041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 tissue culture flask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10790113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cantilever</td>
			<td>BudgetSensor</td>
			<td>ContAl-G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-area scanning probe nanolithography facilitated by automated alignment and its application to substrate fabrication for cell culture studies

스캐닝 프로브 현미경 다양 한 나노미터 스케일 기능 건설 ('첨가제') 하향식 제조 방법의 창조를 수 있게 되었습니다. 역사적으로, 스캐닝 프로브 리소 그래피의 주요 단점은 단일 프로브 시스템의 본질적으로 낮은 처리량 되었습니다. 이 배열의 증가 나노리 처리량 수 있도록 여러 개의 프로브를 사용 하 여 태 클 되어 있다. 이러한 병렬된 나노리를 구현 하기 위해 기판 표면 프로브 배열의 정확한 줄 맞춤은 중요 한, 모든 프로브 있도록 리소 그래피 패터 닝 시작 하는 때에 동시에 표면에 접촉. 이 프로토콜 센티미터 크기의 지역, 프로브 배열, 정확, 신속 하 고 자동 맞춤 알고리즘의 사용에 의해 촉진 된 나노미터 스케일 기능을 생산 하기 위해 폴리머 펜 리소 그래피의 활용을 설명 합니다. 여기, 나노리 골드 기판에 thiols의 높은 균등 성에 생성 기능을 보여 줍니다. 이러한 패턴은 다음 기능성 표면 감독 셀 형태학 연구의 맥락에서 사용 하기 위해 fibronectin 함께.

자동된 맞춤 성공 했다 여부 확인, (단계 4.8에서에서 스프레드시트)의 맞춤 데이터에서 플롯 그래프 시험 되었다. 맞춤 과정 성공 했다 어디에 해당 하는 샘플 단계 θ와 φ 축 따라 기울어져 되었습니다 있다 각도 두 개의 플롯 일련의 상승 및 하강 하는 데이터 요소를 보여주었다. 음모의 각 데이터 포인트의 2 개의 선형 맞는 보였다 "피크" 최대 z를 나타내는 잘 정의 된 교차-확장 및 해당 각도를 맞춤은 달성 (그림 4A 및 4B). 이 과정은 반복된 4 시간 (즉, 각 축에 대 한 두 번)와 4 개의 좌표 집합으로 꾸몄다. 좌표의 각 쌍의 교차로 따라서 전반적으로 최적의 각도 (그림 4C)을 보여 줍니다. 13 경우 맞춤은 성공 하지, 그것은 관찰할 수 있습니다 그들의 해당 θ와 φ 각도 플롯 좋은 품질 선형 적합에 영향을 주지 않는다 또는 (그림 5) 교차 하지 않습니다. 같은 실패 한 정렬 잘못 손질 또는 프로브 홀더 (단계 1.7, 1.8, 2.2)에 장착 되 고 배열 결과로 일반적으로 있다. 이 경우 배열 삭제 된 새로운 하나를 준비 하 고 (단계 1 및 2)를 탑재, 그리고 맞춤 과정 (4 단계)를 반복.
성공적인 정렬 및 ppl MHA와 리소 그래피, 패턴된 골드 기판 했다 다음 측면 힘 현미경 검사 법을 사용 하 여 증 착 했다 자리를 차지 하 고 있다 여부를 확인할 하 몇 군데. 인쇄 표면의 더 큰 지역 시험 또한 입금된 thiol (그림 6 및 그림 7)에 의해 보호 되지 골드의 에칭 후는 기판의 광학 현미경에 의해 실시 되었다. 그러나, 에칭된 패턴 추가 기능화에 사용할 수 없습니다 그리고만 인쇄 표면 기판의 배치의 대표 샘플에 패턴을 확인 하는 데 사용 한다. 에칭된 패턴 개별 펜 (그림 8)에 해당 하는 빈 영역을 표시,이 결과 프로브 배열의 생산 성공적으로 완료 하지 않은 그리고 몇몇 프로브는 손상 되거나 손실 된 나타냅니다. 프로브의이 이질성이 어디 perfluorinated 코팅은 마모 (1.3 단계)는 옛 마스터의 사용 될 수 있습니다 일부 프로브 배열 마스터에서 분리 될 때 멀리 찢어진 되 고 그 결과. 이러한 경우에는 새 마스터를 사용 해야 합니다. 거품 유리 백업 및 마스터 (1.5), 단계 사이 갇혀 또는 경우 프로브 배열 하지 완전히 분리 된 마스터에서 (단계 1.8) 치료 후 결과 공기의 존재로 인해 수도 있습니다.
Fibronectin 기능성된 표면 incubated hMSCs는 또한의 형광 현미경 이미지 수집 (그림 9). 일반적으로, 모든 기판 했다 생체 외에서 문화 환경 내에서 안정 하 고 셀 준수 작은 고립 된 20 x 20 배열 기능의 경우 인쇄 패턴에 그들의 형태를 적응.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig1.jpg"> 그림 1입니다. 프로브 팁에 물 초승달 모양 분자 잉크 전송 통해 보여주는 폴리머 펜 리소 그래피의 도식 대표. (A) 측면도 및 (B) 고분자 펜 배열 평면도 프로브 배열 및 표면 기판 완벽 하 게 정렬 하 고 때 모든 프로브 접촉 표면 동시에 병렬된 리소 그래피 결과 나타냅니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig2.jpg"> 그림 2입니다. 폴리머 펜 리소 그래피의 회로도 설정 최대 (A) 확장된 측 준비 조사 배열 홀더 프로브에 연결 되 고 AFM 스캐너에 장착 되 실험 설정 보기 기판에 스테이지에 배치, 위치는 아래 3 개의 힘 센서. (샘플 단계 상대적인 AFM 스캔 헤드를 보여주는 조립된 계측 B) 한 표현입니다. (C) 아래 보기 힘 센서 위치를 보여주는. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig3.jpg"> 그림 3입니다. 회로도 표현을 정렬 절차에 대 한 분광학 프로그램 묘사. AFM 스캐너는 10 µ m 100 ms 이내 250 ms에 대 한 위치에서 개최 100 ms 이내 10 µ m의 철회 및 끌어 넣어진된 위치에서 250 ms에 대 한 개최의 거리에 의해 샘플을 향해 프로브를 이동 하도록 설정 됩니다. 모션 다음 맞춤 과정을 통해 반복 됩니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig4.jpg"> 그림 4입니다. 그래프 보여주는 성공적인 정렬. ● 실제 값 측정 및 + 최고를 나타냅니다을 나타냅니다에 대 한 기울기 각도 (A) θ 그리고 φ (B) 성공적인 정렬에 대 한 z 위치의 그래프 최소 제곱법과 적합. (C) φ θ에 대 한 그래프 장착 각도 4 점 최대 z 위치에 도달 했다. 교차점 표시 두 축에 걸쳐 최종 최적 기울기 각도입니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig5.jpg"> 그림 5입니다. 실패 한 줄 맞춤을 설명 하는 그래프. ● 실제 값 측정 및 + 최고를 나타냅니다을 나타냅니다에 대 한 기울기 각도 (A) θ 그리고 φ (B)는 실패 한 정렬에 대 한 z 위치의 그래프 최소 제곱법과 적합. (C) φ θ에 대 한 그래프 장착 각도 4 점 최대 z 위치에 도달 했다. 아니 분명 옵 티 마 또는 교차점 관찰 되 고 따라서 최적의 정렬 각도 확인 되지 않습니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig6.jpg"> 그림 6입니다. 설명 광학 현미경, 원자 힘 현미경 이미지 MHA 패턴 정렬된 PPL 배열 하 여 되었고 다음 에칭 골드 기판의. (A)와 (B)는 순차적으로 확대 광학 현미경 이미지 에칭 패턴; (C)는 패턴의 단일 격자의 AFM 지형 이미지. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig7.jpg"> 그림 7입니다. MHA 패턴 정렬된 PPL 배열 하 여 되었고 다음 에칭 골드 기판의 설명을 광학 현미경 이미지. (A) (B)는 순차적으로 확대 광학 현미경 에칭된 패턴의 이미지와 (C)는 낮은 확대 이미지 균질 패턴 큰 영역 표시입니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig8.jpg"> 그림 8입니다. 하 여 균등 하지 MHA 패턴 다음 에칭 골드 기판의 설명을 광학 현미경 이미지. (표시는 삽입) 의도 패턴 z증가 제작한 모든 두 라인 20 줄 정렬 20 도트 라인의 격자를 반복 했다-1 µ m (5에서-5 µ m에 배열 되는)에 의해 축 확장. 그것은 그 일부 지역에서 아무 패턴 생성 되, 그 위치에 누락 된 프로브 때문 볼 수 있습니다. 점의 두 라인은 생산 영역에서이 결과 나타냅니다 프로브는 존재 하지만 그것은 완벽 하 게 작동 프로브와 같은 높이의 유일한 예금 배열의 전체 z확장 기능-축 거리. 이 이미지에서 대비 의도적으로 부분적으로 인쇄 영역의 관찰 수 있도록 변경 되었습니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56967/56967fig9.jpg"> 그림 9입니다. PPL에 의해 템플릿 fibronectin 배열에 경작 하는 hMSCs의 Epifluorescence 현미경 이미지. (A)와 (B)는 고배율 이미지 표시 개별 셀. (C) 셀와 (D)은 (인쇄 된 패턴의 회로도 속지에도 표시) 그리드 배열에서 경작 하는 세포의 넓은 필드 이미지를 부착 하지 않고 fibronectin 배열의 예제 패턴 보여준다. 셀은 fibronectin (빨강), F-말라 (녹색)으로 표시 하 여 세포 핵 (블루) 얼룩이 있습니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56967/56967fig9large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies

여기 선물이 광역 스캐닝 프로브 나노리 프로브 배열의 반복 정렬 세포 표면 상호 작용 연구에 대 한 리소 그래피 패턴의 활용에 의해 사용에 대 한 프로토콜.

큰 지역 스캐닝 프로브 나노리 자동된 맞춤 및 셀 문화 연구에 대 한 기판 제작에의 응용에 의해 촉진

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of ...

large-area-scanning-probe-nanolithography-facilitated-automated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.5K 조회수.  University of Manchester. 여기 선물이 광역 스캐닝 프로브 나노리 프로브 배열의 반복 정렬 세포 표면 상호 작용 연구에 대 한 리소 그래피 패턴의 활용에 의해 사용에 대 한 프로토콜.

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Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration and cell-cell interactions. The two key parameters of cellular biomechanics are cellular deformability or stiffness and the ability of the cells to contract and generate force. Here we describe a quick and simple method to estimate cell stiffness by measuring the degree of membrane deformation in response to negative pressure applied by a glass micropipette to the cell surface, a technique that is called Micropipette Aspiration or Microaspiration.
Microaspiration is performed by pulling a glass capillary to create a micropipette with a very small tip (2-50 &mu;m diameter depending on the size of a cell or a tissue sample), which is then connected to a pneumatic pressure transducer and brought to a close vicinity of a cell under a microscope. When the tip of the pipette touches a cell, a step of negative pressure is applied to the pipette by the pneumatic pressure transducer generating well-defined pressure on the cell membrane. In response to pressure, the membrane is aspirated into the pipette and progressive membrane deformation or "membrane projection" into the pipette is measured as a function of time. The basic principle of this experimental approach is that the degree of membrane deformation in response to a defined mechanical force is a function of membrane stiffness. The stiffer the membrane is, the slower the rate of membrane deformation and the shorter the steady-state aspiration length.The technique can be performed on isolated cells, both in suspension and substrate-attached, large organelles, and liposomes.
Analysis is performed by comparing maximal membrane deformations achieved under a given pressure for different cell populations or experimental conditions. A "stiffness coefficient" is estimated by plotting the aspirated length of membrane deformation as a function of the applied pressure. Furthermore, the data can be further analyzed to estimate the Young's modulus of the cells (E), the most common parameter to characterize stiffness of materials. It is important to note that plasma membranes of eukaryotic cells can be viewed as a bi-component system where membrane lipid bilayer is underlied by the sub-membrane cytoskeleton and that it is the cytoskeleton that constitutes the mechanical scaffold of the membrane and dominates the deformability of the cellular envelope. This approach, therefore, allows probing the biomechanical properties of the sub-membrane cytoskeleton.

Here we describe a quick and simple method to measure cell stiffness. The general principle of this approach is to measure membrane deformation in response to well-defined negative pressure applied through a micropipette to the cell surface. This method provides a powerful tool to study biomechanical properties of substrate-attached cells.

기판에 연결된 전지의 Micropipette의 열망은 셀 강성을 추정하기 위해

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

연구

생체공학

Shock Wave Application to Cell Cultures

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to target cells or tissue without any subsequent damage. Therefore, in vitro experiments are of increasing interest. Various methods of applying shock waves onto cell cultures have been described. In general, all existing models focus on how to best apply shock waves onto cells.
However, this question remains: What happens to the waves after passing the cell culture? The difference of the acoustic impedance of the cell culture medium and the ambient air is that high, that more than 99% of shock waves get reflected! We therefore developed a model that mainly consists of a Plexiglas built container that allows the waves to propagate in water after passing the cell culture. This avoids cavitation effects as well as reflection of the waves that would otherwise disturb upcoming ones. With this model we are able to mimic in vivo conditions and thereby gain more and more knowledge about how the physical stimulus of shock waves gets translated into a biological cell signal (&#8220;mechanotransduction&#34;).

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Therefore in vitro experiments are of increasing interest. We therefore developed a model for in vitro shock wave trials (IVSWT) that enables us to mimic in vivo conditions thereby avoiding distracting physical effects.

문화를 셀에 충격파 응용 프로그램

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

미세 유체 기술은 셀 변형능을 검사 할

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

매트릭스 수정에 의해 유도 된 세포 접착 및 탈 부착의 실시간 변화를 측정 셀 기판 임피던스와 라이브 세포 이미징을 사용하여

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

포토 리소그래피에 의해 고분자 미세 바늘 어레이 제작

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

용매를 이용한 지질 이중층 (SALB) 방법에 의해 생체막 제작

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus of this article is on the methods for fabricating ECM-derived porous foams and microcarriers for use as biologically-relevant substrates in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative scaffolds and cell delivery systems for tissue engineering and regenerative medicine. Using decellularized tissues or purified insoluble collagen as a starting material, the techniques can be applied to synthesize a broad array of tissue-specific bioscaffolds with customizable geometries. The approach involves mechanical processing and mild enzymatic digestion to yield an ECM suspension that is used to fabricate the three-dimensional foams or microcarriers through controlled freezing and lyophilization procedures. These pure ECM-derived scaffolds are highly porous, yet stable without the need for chemical crosslinking agents or other additives that may negatively impact cell function. The scaffold properties can be tuned to some extent by varying factors such as the ECM suspension concentration, mechanical processing methods, or synthesis conditions. In general, the scaffolds are robust and easy to handle, and can be processed as tissues for most standard biological assays, providing a versatile and user-friendly 3D cell culture platform that mimics the native ECM composition. Overall, these straightforward methods for fabricating customized ECM-derived foams and microcarriers may be of interest to both biologists and biomedical engineers as tissue-specific cell-instructive platforms for in vitro and in vivo applications.

The tissue-specific extracellular matrix (ECM) is a key mediator of cell function. This article describes methods for synthesizing pure ECM-derived foams and microcarriers that are stable in culture without the need for chemical crosslinking for applications in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative bioscaffolds.

조직 특이 적 세포 배양 및 전달 플랫폼과 같은 세포 외 기질 유래 거품과 마이크로 담체의 제조

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. Unfortunately, many researchers spend large amounts of time and resources developing and optimizing workflows that are only relevant to their own experiments. In this article, we describe a protocol that can be used by those with access to a widefield high-content analysis system (WHCAS) to image any slide-mounted tissue, with options for customization within pre-built modules found in the associated software. Not originally intended for slide scanning, the steps detailed in this article make it possible to acquire slide scanning images in the WHCAS which can be imported into the associated software. In this example, the automated segmentation of brain tumor slides is demonstrated, but the automated segmentation of any fluorescently-labeled nuclear or cytoplasmic marker is possible. Furthermore, there are a variety of other quantitative software modules including assays for protein localization/translocation, cellular proliferation/viability/apoptosis, and angiogenesis that can be run. This technique will save researchers time and effort and create an automated protocol for slide analysis.

Here we describe a protocol for the automated segmentation of fluorescently labeled tissues on slides using a widefield high-content analysis system (WHCAS). This protocol has wide-ranging applications in any field which involves the quantitation of fluorescent markers in biological tissues including the biological sciences, medical engineering, and health sciences.

자동된 슬라이드 스캔 및 Widefield 하이 콘텐츠 분석 시스템을 사용 하 여 붙일 표시 된 조직에서 시장 세분화

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing

Successful commercialization of gene and cell-based therapies requires manufacturing processes that are cost-effective and scalable. Buffer exchange and product concentration are essential components for most manufacturing processes. However, at the early stages of product development, these steps are often performed manually. Manual dead-end centrifugation for buffer exchange is labor-intensive, costly, and not scalable. A closed automated system can effectively eliminate this laborious step, but implementation can be challenging. Here, we describe a newly developed cell processing device that is suitable for small- to medium-scale cell processing and aims to bridge the gap between manual processing and large-scale automation. This protocol can be easily applied to various cell types and processes by modifying the flow rate and centrifugation speed. Our protocol demonstrated high cell recovery with shorter processing times in comparison to the manual process. Cells recovered from the automated process also maintained their proliferation rates. The device can be applied as a modular component in a closed manufacturing process to accommodate steps such as buffer exchange, cell formulation, and cryopreservation.

Automation is key to upscaling and cost management in cell manufacturing. This manuscript describes the use of a counterflow centrifugal cell processing device for automating the buffer exchange and cell concentration steps for small-scale bioprocessing.

소규모 셀 처리를 위한 자동 카운터플로우 원심 시스템

Successful commercialization of gene and cell-based therapies requires manufacturing processes that are cost-effective and scalable. Buffer exchange and ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, unlike more differentiated progenitors, and enter the cell cycle rapidly after chemotherapy or irradiation to treat bone marrow injury or in vitro culture. By mimicking the bone marrow microenvironment in the presence of abundant fatty acids, cholesterol, low concentration of cytokines, and hypoxia, human HSCs maintain quiescence in vitro. Here, a detailed protocol for maintaining functional HSCs in the quiescent state in vitro is described. This method will enable studies of the behavior of human HSCs under physiological conditions.

This protocol enables the maintenance of quiescent human hematopoietic stem cells in vitro by mimicking the bone marrow microenvironment using abundant fatty acids, cholesterol, lower concentrations of cytokines, and hypoxia.

정지 인간 조혈 줄기 세포를 유지하는 배양 방법

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...