우리는 기술 지원을 박사 아그네스 알레와 MSKCC 유전체학 코어 실험실 감사합니다. 이 프로토콜은 제프리 Beene 암 연구 센터와 농부 가족 재단의 지원으로 개발되었다.

1. DNA 및 시약 준비 참고 :이 프로토콜은 24 샘플 (예를 들면 12 종양 / 보통 쌍)의 동시 처리 및 분석을 설명하지만, 작고 큰 일괄 작업에 적용 할 수 있습니다. DNA 샘플은 FFPE 또는 냉동 조직, 세포 학적 표본, 또는 혈액에서 파생 수 있습니다. 일반적으로, 동일 환자에서 종양 및 정상 조직 둘 상속 다형성에서 체세포 돌연변이를 구별하기 위해 함께 파일링한다. 프로토콜은 즉시 DNA 추출을 따라 시작된다. <ol><li> 나누어지는 50 ~ 250 NG 1X 트리스-EDTA에 희석 샘플 당 추출 된 DNA (산도 8.0) 별도의 Covaris 둥근 바닥 튜브에 50 μL의 최종 볼륨에 버퍼 (250 권장 NG). </li><li> 10 듀티 계수, 175 PIP 및 버스트 당 200주기 360 초 : 다음 전단 설정에 Covaris E220 악기의 DNA 전단. </li><li> 실온으로 AMPure XP를 구슬로 장식한다 (표 2) 해동. 모든 BU 해동이전에 적절한 단계에 얼음 ffers과 효소. </li></ol> 2. 도서관 준비 - 최종 수리 모듈 <ol><li> 샘플 당 다음 볼륨을 사용하여 살균 microcentrifuge 관에 최종 수리 마스터 믹스를 준비 : 배 NEBNext 최종 수리 반응 버퍼 (표 2)의 10 μl를, 5 μL NEBNext 끝 효소 믹스 (표 2) 수리, 35 ㎕의 멸균 클레아 무료 H 2 O. </li><li> 96 - 웰 플레이트의 별도의 우물에 각 전단 DNA의 50 μl를 나누어지는. 각 반응으로 제조 된 최종 수리 마스터 믹스 50 μl를 추가합니다. 20 ℃에서 30 분 동안 열 순환기에 품다 </li></ol> 3. 포스트 최종 수리 정리 <ol><li> 각 샘플에 AMPure XP를 구슬로 장식한다 (표 2)의 2 배 볼륨 (200 μL)를 추가하고 온화하게 멀티 채널 피펫을 사용하여 아래로 배 전체 볼륨을 피펫. 실온에서 15 분 동안 품어. </li><li> 자기 대 (표 2에 배치 </샘플 클리어 나타날 때까지 15 분 동안 RT에서)&gt; 강한. </li><li> 부드럽게 제거하고 구슬을 방해하지 상등액 복용 치료를 버린다. 어떤 액체가 우물에 남아있을 수 있습니다. </li><li> 스탠드에 튜브로 부드럽게 각각의 샘플에 새로 제조 된 80 % 에탄올 200 μl를 추가하고 30 초 동안 실온에서 접시를 품어. 조심스럽게 피펫으로 에탄올을 제거합니다. </li><li> 2 에탄올 세척 총 5 단계를 반복합니다. 확인 모든 에탄올이 제거되었습니다. 자기 스탠드에서 제거하고 5 분 동안 실온에서 건조시켜주십시오. </li><li> 44.5 ㎕의 멸균 H 2 O로 건조 구슬을 재현 탁 조심스럽게 피펫 전체 볼륨 위아래로 10 배 철저하게 혼합. 확인 비드 더이상 웰의 측면에 부착되지 않는다. </li><li> 2 분 동안 실온에서 재 부유 구슬을 품어. 샘플 분명히 나타날 때까지 5 분 동안 자기 스탠드에 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 새로운 웰에 샘플을 포함하는 상등액 42 μl를 전송합니다. 이 절차는 안전이 성에서 중지 될 수 있습니다EP 최대 7 일 -20 ° C에서 저장 샘플. 다시 시작하기 전에 얼음에 냉동 샘플을 해동합니다. </li></ol> 4. 도서관 준비 - 다 - 미행 모듈 <ol><li> 배 NEBNext DA-미행 반응 버퍼 (표 2), 3 μL (3&#39;-5 &#39;엑소) 클레 나우 조각 (표 2의 5 μL : 샘플 당 다음 볼륨을 사용하여 살균 microcentrifuge 관에서 DA-미행 마스터 믹스를 준비합니다 ). </li><li> 각이 잘 최종 수리 DNA의 42 μl를 포함에 준비된 DA-미행 마스터 믹스 13 μl를 추가합니다. 37 ℃에서 30 분 동안 열 순환기에 품다 </li><li> 된 DA-미행 게시물을 수행 청소 : 반복 33.75 μL의 최종 볼륨 멸균 H 2 O의 2 배 구슬의 양 (100 μL) 만에 resuspend를 사용하여 3.1-3.8 단계를 반복합니다. 이 절차는 안전이 단계 최대 7 일 -20 ° C에서 보관 샘플을 중지 할 수 있습니다. 다시 시작 진행하기 전에 얼음에 냉동 샘플을 해동합니다. &lt;/ 리&gt; </ol> 5. 도서관 준비 - 어댑터 내고 모듈 <ol><li> 배 NEBNext 빠른 내고 반응 버퍼 (뉴 잉글랜드 바이오 랩스, 표 2), 5 ㎕의 빠른 T4 DNA 리가 제 (표 2) 10 μL : 샘플 당 다음 볼륨을 사용하여 살균 microcentrifuge 관에서 결찰 마스터 믹스를 준비합니다. </li><li> 각이 잘 DA-꼬리가 달린 DNA를 포함하여 결찰 마스터 믹스의 15 μl를 추가합니다. </li><li> 물론 각각에 해당하는 25 μM NEXTflex 바코드 어댑터 (표 2)의 1.25 μl를 추가합니다. 각 샘플은 별도의 바코드 어댑터를 받아야한다. 20 ℃에서 15 분 동안 열 순환기에 품다 </li><li> 50 μL의 최종 볼륨에 멸균 H 2 O의 반복 구슬의 1X 볼륨 (50 μL)을 사용하여 3.1-3.8 단계 만에 resuspend : 포스트 어댑터 내고 청소를 수행합니다. </li><li> 반복 두 번째 1X 볼륨 (50 μL) 청소를위한 3.1-3.8 단계 만에 멸균 H에 재현 탁 2 O23 μL의 최종 볼륨. 이 절차는 안전이 단계 최대 7 일 -20 ° C에서 보관 샘플을 중지 할 수 있습니다. 다시 시작하기 전에 얼음에 냉동 샘플을 해동합니다. </li></ol> 6. 도서관 증폭 <ol><li> 25 ㎕의 2 배 KAPA 고음질 HS RM (표 2), 1 ㎕를 100 μM 프라이머 1 프라이머 2 (표 3) 각 : 샘플마다 다음과 같은 볼륨을 사용하여 살균 microcentrifuge 관에서 KAPA 고음질 마스터 믹스를 준비합니다. </li><li> 각이 잘 내고 제품을 포함하여 마스터 믹스의 27 μl를 추가합니다. 50 μL에 피펫을 설정하고 부드럽게 위아래로 배 전체 볼륨을 피펫. </li><li> 다음 PCR 사이클의 열 순환기에 배치 : 98 ° C에서 45 초 동안 변성, 98 ° C, 60 ° C에서 30 초에서 15 초 10주기, 30 72 ° C에서 초, 1 분 최종 연장 72 ° C에서 </li><li> 포스트 증폭 청소를 수행 반복 사용 3.1-3.8 단계1X의 AMPure XP 구슬의 볼륨 (50 μL), 30 μL의 최종 볼륨에 멸균 물에 resuspend. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 큐빗 광범위한 분석 (라이프 테크놀로지스, 표 2)를 사용하여 각 라이브러리의 농도를 정량화. </li></ol> 7. 로슈 NimbleGen의 SeqCAP EZ 도서관 하이브리드, 세척 및 증폭 <ol><li> 얼음 해동 보편적이고 인덱스 올리고 차단제 (표 3), SeqCap EZ 도서관 및 NimbleGen의 캡처 구성 요소 (COT의 DNA, 2X 하이브리드 화 버퍼 및 하이브리드 구성 요소 A, 표 2). 모든 올리고 차단제는 1 mm의 작업 주식에 저장됩니다. 우리 SeqCap EZ 도서관은 다른 사용자 정의 및 카탈로그 디자인이 사용될 수 있지만, 279 암 관련 유전자의 모든 단백질 코딩 엑손을 포괄 캡처 프로브의 맞춤 설계 풀입니다. </li><li> 특정 바코드 광고에 해당하는 인덱스 올리고 뉴클레오티드 차단제의 1 ㎜ 풀을 준비라이브러리의 제조에 사용 aptor 서열. 1 각 차단기의 μL​​, 그리고 소용돌이를 결합합니다. </li><li> 새로운 멸균 1.5 ML microcentrifuge 관에서 1mg/ml의 침대의 DNA의 5 μL, 1 mM의 보편적 인 차단기의 2 μL 및 인덱스 올리고 차단제의 1 ㎜ 풀의 2 μl를 추가합니다. </li><li> 하나의 반응에 수영장 (24) 바코드 라이브러리. 캡처 혼합물 (상기에서 제조) 풀링, 바코드 일련의 라이브러리의 1-3 μg의 총을 추가합니다. 24 샘플은 샘플 당 100 ng를 추천합니다. 종양과 일치하는 일반 샘플을 풀링 할 때, 우리는 그들이 더 큰 범위의 깊이 순서가되도록 더 많은 종양 라이브러리 (종양 및 정상 50 NG 당 예를 들어, 100 NG)를 추가 좋습니다. </li><li> 튜브의 뚜껑을 닫고 18 ~ 20 G 나 작은 바늘 캡의 상단에 15 ~ 20 홀을 만든다. 속도 청소기 고온 (60 ℃)에서 DNA 진공 농축기에서 증폭 된 샘플 라이브러리 / COT DNA / 올리고. </li><li> 일단 완전히 건조 2 배 hybridi의 7.5 μL로 재수zation 버퍼링 및 하이브리드 구성 요소 A의 3 μL 튜브는 이제 다음을 포함한다 : 5 μg의 COT의 DNA, 변수 μg 증폭 샘플 라이브러리, 범용 및 색인 올리고 1000 pmol의 7.5 ㎕의 2 배 하이브리드 버퍼, 3 ㎕의 하이브리드 구성 요소 10.5 μL의 총 부피. </li><li> 실험실 테이프의 작은 조각으로 뚜껑에있는 구멍을 커버. 소용돌이 10 초 동안 최대 속도로 10 초 원심 분리기에 대한 샘플. </li><li> 실온에서 10 초 동안 최대 속도로 원심 분리 DNA를 변성 10 분, 95 ° C에서 샘플을 품어. </li><li> 새로운 0.2 ML PCR 지구 관에서 SeqCap EZ 도서관 캡처 프로브 및 멸균 클레아 무료 H 2 O 2.25 μL 2.25 μL 나누어지는 준비 단계 7.7의 내용을 추가합니다. 부드럽게 위아래로 배 전체 볼륨을 피펫. </li><li> 48 ~ 96 시간 동안 47 ° C에서 열 자전거 타는 사람에 품어. 설정하고 57 ° C.에 열 자전거 타는 사람의 뚜껑 온도를 유지 </li><li> FOL세척 및 캡처 된 DNA의 복구를위한 NimbleGen의 SeqCap EX 라이브러리 SR 사용 설명서 버전 3.0 (표 2)의 제 6 장 낮은 단계. </li><li> 다음 수정을 촬영 한 DNA의 증폭을위한 로슈 NimbleGen의 프로토콜의 제 7의 단계를 다음과 같습니다 : <ul type="disc"><li> 대신 Phusion 하이 피델리티 PCR 마스터 믹스의 2 배 KAPA 고음질 중합 효소 (표 2)를 사용하여 </li><li> 표 3에 100 μM의 프라이머 1 프라이머 2를 사용합니다. </li><li> 30 초 동안 98 ° C에서 초기 변성, 10 초 동안 98 ° C의 11주기, 30 초, 60 ° C, 30 초, 72 ° C, 5 분 동안 72 ° C에서 최종 연장 : 다음 PCR 조건을 실행 . 4 ° C에서 개최 </li></ul></li><li> 제조업체의 지시에 따라 큐빗 고감도 분석 (표 2)를 사용하여 증폭 된 캡쳐 DNA의 농도를 정량화. </li><li> 애질런트 바이오를 사용하여 캡처 DNA의 품질을 분석분석기 DNA HS 칩 (표 2)는 제조업체의 지침에 따라. <ul type="disc"><li> PCR 수익률은 최소 100 NG (범위 100-1,000 NG)해야한다. </li><li> 평균 조각의 길이는 150-400 염기쌍 사이 여야합니다. </li></ul></li></ol> 8. Illumina의 안녕 시퀀서 시퀀싱 <ol><li> 오후 2 증폭 캡처 DNA를 희석하고, Illumina의 HiSeq 2000 흐름 세포의 단일 차선에 샘플을로드합니다. 시퀀스 쌍 엔드 75 염기쌍은 제조업체의 지침에 따라 읽습니다. 우리의 경험에 의하면, 하나의 레인 24 샘플의 풀에 279 유전자에 걸쳐 샘플 당 500-700X 고유의 시퀀스 범위를 생산하기에 충분하다. </li><li> Illumina의 소프트웨어 (실시간 분석) 통화 및 품질 평가 점수를 기반으로하는 클러스터 강도 높은 해상도의 이미지를 변환합니다. 바코드의 정체성에 따라 데이터를 역 다중화하고, 각 샘플에 대한 개별 FASTQ 파일을 생성하는 CASAVA를 사용합니다. </li></ol> 9. 데이터 아날ysis <ol><li> 서열의 3 &#39;말단으로부터 트림 어댑터 서열 Cutadapt을 (사용 FASTQ 파일 판독 <a href="http://code.google.com/p/cutadapt/">http://code.google.com/p/cutadapt/</a> ). 오버랩의 최소 길이 (-O)은 1 %의 에러율 (-E) 3이다. 페어의 유지를위한 최소한의 기본 길이는 25입니다 트리밍 후 읽습니다. </li><li> 에 맞 춥니 다 순서는 버로우 - 휠러 동기기 도구 (BWA) 12를 사용하여 참조 인간 게놈 hg19로 읽습니다. 자신의 표준 모범 사례 (에 따라 게놈 분석 툴킷 (GATK)를 사용하여 표시 중복, 지역의 여러 순서 재배치,베이스 품질 평가 점수의 재조정 등의 후 처리 단계 수행 <a href="http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic?name=best-practices">http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic을? = 모범 사례의 이름</a> ) 13. 같은 환자에서 여러 시료 (예를 들어 일치하는 종양과 정상)를 프로파일 링 할 때, 지역의 여러 순서 재정렬 perfor해야공동 MED. 이러한 후 처리 단계의 출력은 모든 시퀀스, 품질 및 배향 정보를 포함하고 판독 시퀀스 (14)를 변형 시각화 통합 유전체학 뷰어 (IGV)에 직접로드 될 수있는 각 샘플에 대한 별도의 BAM 파일이다. </li><li> 피카드 도구를 사용하여 시퀀스 성능 메트릭을 계산 ( <a href="http://picard.sourceforge.net/">http://picard.sourceforge.net/</a> ). 유익한 통계는 정렬 속도, 조각의 크기 분포, GC-콘텐츠 관련 보도 바이어스에 대상 캡처 특이 PCR 복제 속도, 라이브러리의 복잡성 및 대상 범위를 의미 있습니다. 대표 값은 그림 1에 표시됩니다. GATK에서 DepthOfCoverage을 사용하여 계산 공통 다형 사이트의 대립 유전자 빈도는 무관 DNA로부터의 오염을 모니터링 및 그 유사한 샘플이 동일한 환자에서 온 보장하기 위해 사용된다. 다음 전산 분석은 일치의 존재에 따라 달라집니다체세포 유전 변경의 탐지를위한 종양과 정상 샘플. 후기, 실시간 종양은 또한 별도의 정상 대조 샘플을 사용하여 분석 할 수 있지만, 대부분의 체세포 돌연변이는 쉽게 상속 서열 변이체와 ​​구별 될 수 없다. </li><li> 이러한 muTect 15 SomaticSniper 16 또는 Strelka 17로 체세포 돌연변이 발신자를 사용하여 각 종양 정상 쌍의 체세포 단일 염기 변이 (SNVs)로 전화하십시오. 우리는 낮은 0이 아닌 대립 유전자의 정상 샘플 카운트 한 대립 유전자 빈도는 종양의 최소 5 배 큰대로와 변형을 허용, 수정 필터링 기준으로 muTect를 사용합니다. 순환 적 정상 DNA를 패널에서 호출 변형은 순서 또는 정렬의 가능성 체계적인 유물로 제거됩니다. 필터를 통과하는 각 SNV는 조심스럽게 IGV를 사용하여 검토합니다. </li><li> 이러한 SomaticIndelDetector 13 Dindel 18으로 알고리즘을 사용하여 각 종양 정상 쌍의 체세포 삽입이나 삭제를 전화, 또는 SOAPindel 19 </sup&gt;. 우리는 다음과 같은 기준으로 SomaticIndelDetector를 사용하여, 적어도 10 %의 대립 유전자 빈도를, 적어도 3, 적어도 10지지 읽기와 대립 유전자 빈도를 판독지지, 또는 적어도 2 %로. 우리는 낮은 0이 아닌 대립 유전자의 정상 샘플 카운트 한 대립 유전자 빈도는 종양의 최소 5 배 큰대로로 삽입이나 삭제를 허용. 정상 DNA를 패널에서 호출 삽입이나 삭제는 위와 같이, 제거됩니다. 필터를 통과하는 각 INDEL은 조심스럽게 IGV를 사용하여 검토합니다. </li><li> 대상 엑손의 순서 범위에서 카피 수의 상태를 추정. 각각의 샘플은 모든 대상 엑손, GC 비율에 회귀에 대한 평균 순서 범위의 황토 정규화를 수행합니다. 황토의 적합을 뺀 샘플 전체 평균의 범위를 추가하여 표준화 범위의 값을 조정합니다. 종양 일반적인 쌍에 대한 모든 대상 엑손에 걸쳐 표준화 된 일련의 범위에서 비율을 계산합니다. 일치하는 일반 샘플 및 / 또는 소음을 줄이기 위해, 다른 성별 일치 배체의 부재생식선 카피 수 변이를 결여 정상인이 사용될 수있다. 커버리지 비율의 증가 또는 감소에 따라 체세포 복제 수의 이득과 손실을 결정합니다. </li><li> 적어도 하나의 게놈 중단 점은 게놈의 대상 구간 내 또는 근처에 폭포 암 유전자를 포함하는 체세포의 재 배열을 호출합니다. 제안 된 알고리즘은 GASV 20 breakdancer을 21 CREST (22) 및 dRanger 23 (가) 있습니다. Intrachromosomal 반전, 삭제 및 탠덤 중복은 지원의 상대적 위치와 방향이 부조화 한 쌍으로 읽고에 따라 구별 할 수있다. 모든 후보의 재 배열을 수동으로 IGV를 사용하여 검토되어야한다. 우리는 추정 재 배열 중단 점에서 PCR과 생어 시퀀싱에 의해 검증 실험을하는 것이 좋습니다. </li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+geometric+approach+for+classification+and+comparison+of+structural+variants.">A geometric approach for classification and comparison of structural variants.</a> Bioinformatics. 25 (12), 222-230 (2009).</li><li>Chen, K., Wallis, J. W., Mclellan, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BreakDancer:+an+algorithm+for+high-resolution+mapping+of+genomic+structural+variation.">BreakDancer: an algorithm for high-resolution mapping of genomic structural variation.</a> Nat. Methods. 6 (9), 677-681 (2009).</li><li>Wang, J., Mullighan, C. G., Easton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CREST+maps+somatic+structural+variation+in+cancer+genomes+with+base-pair+resolution.">CREST maps somatic structural variation in cancer genomes with base-pair resolution.</a> Nat. Methods. 8 (8), 652-654 (2011).</li><li>Drier, Y., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+rearrangements+across+cancer+reveal+classes+of+samples+with+distinct+patterns+of+DNA+breakage+and+rearrangement-induced+hypermutability.">Somatic rearrangements across cancer reveal classes of samples with distinct patterns of DNA breakage and rearrangement-induced hypermutability.</a> Genome Res. 23 (2), 228-235 (2012).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Roychowdhury, S., Iyer, M. K., Robinson, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+oncology+through+integrative+high-throughput+sequencing:+a+pilot+study.">Personalized oncology through integrative high-throughput sequencing: a pilot study.</a> Sci. Transl. Med. 3 (111), 111ra121 (2011).</li><li>Kerick, M., Isau, M., Timmermann, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+high+throughput+sequencing+in+clinical+cancer+settings:+formaldehyde+fixed-paraffin+embedded+(FFPE)+tumor+tissues,+input+amount+and+tumor+heterogeneity.">Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity.</a> BMC Med. Genomics. 4, 68 (2011).</li></ol>

박사 버거는 기초 의학, 암 진단 회사에서 컨설팅 비용과 연구 기금을 받았다.

우리의 영향 분석은 높은 정렬 속도, 높은 곳에서 목표 속도, 높은 대상 범위 및 검출 돌연변이, 삽입이나 삭제, 및 번호 변경을 복사에 대한 높은 감도를 생산하고 있습니다. 우리는 냉동 모두의 시퀀스 DNA에 미치는 영향 분석의 능력을 증명하고 낮은 DNA 입력 FFPE 샘플을 보관했다. 키 암 관련 유전자의 엑손 타겟 시퀀싱을 수행함으로써, 하나함으로써 저주파 변이를 감지하는 능력을 최대화 이러?...

키 종양 유전자와 종양 억제 유전자의 &quot;드라이버&quot;종양 유전자 이벤트의 식별은 많은 암 (1)의 진단과 치료에 필수적인 역할을한다. 대규모 병렬 &quot;차세대&quot;염기 서열을 이용하여 대규모 연구 노력은 최근 몇 년에있는 많은 암 관련 유전자의 식별을 가능하게했다. 그러나 이러한 시퀀싱 플랫폼은 일반적으로 이와 같은 (FFPE) 종양 샘플 포함 된 포르말린 고정 파라핀 등의 보존 조직에서 DNA 돌연변이의 특성 및 분석의 주요 제한 포즈, 냉동 조직에서 분리 된 DNA의 많은 양을 필요로한다. 효율적이고 안정적​​으로 FFPE 종양 샘플에서 &quot;실행 가능한&quot;게놈 정보의 특성을 향상 노력은 이전에 둑 표본의 후 향적 분석을 가능하게하고 또한 암 관리에 대한 개별적인 접근 방식을 권장합니다. 전통적으로, 분자 Diagnostic 연구소는 DNA 돌연변이 프로파일에 대한 생어 시퀀싱 및 실시간 PCR 등의 시간이 소요되는, 낮은 처리량 방법에 의존하고있다. 더 최근에, 멀티 플렉스 PCR 또는 질량 분석 유전자형을 이용한 높은 처리량 방법은 키 암 유전자 3-5 재발 체세포 돌연변이를 조사하기 위해 개발되었다. 이러한 접근법은, 그러나, 단지 미리 지정된 &quot;핫스팟&quot;돌연변이는 종양 억제 유전자에서 불활 화 돌연변이를 검출하기에 부적합하게, 정량되는 것을 제한된다. 대규모 병렬 염기 서열 일반 및 희귀 모두 돌연변이 전체 엑손을 심문 할 수있는 능력, 이러한 카피 수의 이득과 손실 등 게놈 변경의 추가 클래스를 공개 할 수있는 기능, 이기종 샘플 6, 더 큰 검출 감도를 포함하여 이러한 전략을 통해 몇 가지 장점을 제공합니다 7 . 그것은 상대이지만 전체 게놈 시퀀싱은 돌연변이 발견을위한 가장 포괄적 인 접근 방식을 나타냅니다LY 비싸고는 데이터 분석 및 저장을위한 대용량 연산 요구를 초래한다. 게놈의 작은 부분이 임상 관심을 가질 수있는 임상 응용 프로그램의 경우, 시퀀싱 기술의 두 가지 특정 혁신은 변형되고있다. 첫째, 하이브리드 기반의 엑손 캡처를 통해, 하나는, 표적 돌연변이 프로파일 8 키 암 관련 유전자에 해당하는 DNA를 분리 할 수 있습니다. 둘째, 분자 바코드 (즉, DNA 서열의 길이는 6 ~ 8 개의 뉴클레오티드)의 결찰을 통해, 하나는 시퀀싱 실행 당 수백 개의 샘플을 풀 수 있고, 완전히 대규모 병렬 시퀀싱 장비 (10)의 계속 증가하는 용량을 활용할 수 있습니다. 결합하면, 이러한 혁신은 작은 전산 요구 사항 (11), 낮은 비용을 프로파일 링하는 종양을 활성화하고 높은 처리량. 또한, 특정 애플리케이션에 가장 중요한 만 유전자 시퀀스 범위를 재분배하여, 하나는 achie 수 있습니다낮은 대립 유전자 빈도 이벤트에 대한 높은 검출 감도에 큰 순서 깊이를했습니다. 여기에서 우리는 (모든 단백질 코딩 엑손를 캡처하고 279 키 암 관련 유전자의 인트론을 선택하는 사용자 지정 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 하이브리드 화하여 바코드 일련의 라이브러리 풀에 엑손 캡처를 활용 미치는 영향 분석 (실행 가능한 암 대상의 통합 돌연변이 프로파일)를 설명하는 표 1 ). 이 전략은 돌연변이, 삽입이나 삭제, 복사 번호 변경의 식별을 가능하게하고,이 279 유전자를 포함하는 구조 재 배열을 선택합니다. 우리의 방법은 냉동과 FFPE 조직뿐만 아니라 미세 바늘 흡인 및 기타 세포 검사 표본 모두에서 고립 된 DNA와 호환됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<tbody> 
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEBNext End Repair Module</td>
			<td style="width:247px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">E6050L</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEBNext dA-Tailing Module</td>
			<td style="width:247px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">E6053L</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEBNext Quick Ligation Module</td>
			<td style="width:247px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:137px;">E6056L</td>
			<td style="width:79px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agencourt AMPure XP</td>
			<td style="width:247px;">Beckman Coulter Genomics</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NEXTflex PCR-Free Barcodes &#8211; 24</td>
			<td style="width:247px;">Bioo Scientific</td>
			<td style="width:137px;">514103</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">HiFi Library Amplification Kit</td>
			<td style="width:247px;">KAPA Biosystems</td>
			<td style="width:137px;">KK2612</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">COT Human DNA, Fluorometric Grade</td>
			<td style="width:247px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:137px;">05 480 647 001</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit</td>
			<td style="width:247px;">Roche NimbleGen</td>
			<td style="width:137px;">05 634 261 001</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">SeqCap EZ Library Baits</td>
			<td style="width:247px;">Roche NimbleGen</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:247px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">28104</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit</td>
			<td style="width:247px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">Q32850</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit</td>
			<td style="width:247px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:137px;">Q32851</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agilent DNA HS Kit</td>
			<td style="width:247px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:137px;">5067-4626, 4627</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:247px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Covaris E220</td>
			<td style="width:247px;">Covaris</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Magnetic Stand-96</td>
			<td style="width:247px;">Ambion</td>
			<td style="width:137px;">AM10027</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Illumina Hi-Seq 2000</td>
			<td style="width:247px;">Illumina</td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting somatic genetic alterations in tumor specimens by exon capture and massively parallel sequencing

키 종양 변이를 감지하고 조사하는 노력이 암 환자에 대한 적절한 치료를 촉진하는 중요한 입증했다. 높은 처리량의 설립, 대규모 병렬 &quot;차세대&quot;순서는 많은 이러한 돌연변이의 발견을 원조하고있다. 이 기술의 임상과 번역 유틸리티를 강화하기 위해, 플랫폼은 높은 처리량, 비용 효율적이며 성능이 저하되거나 손상된 DNA의 소량을 얻을 수있다 (FFPE) 조직 샘플 포함 된 포르말린 고정 파라핀과 호환되어야합니다. 여기, 우리는 대규모 병렬 염기 서열 냉동 및 FFPE 종양에서 암 관련 변이의 검출 대상 엑손 기반의 하이브리드 캡처 다음에 바코드 및 다중 DNA 라이브러리의 준비에 대해 설명합니다. 이 방법은 서열 변이의 식별을 가능하게 번호 변경을 복사하고, 모든 대상 유전자를 포함하는 구조 재 배열을 선택합니다. 대상 엑손 염기 서열은 t을 제공합니다그는 따라서 낮은 주파수 변이를 검출하는 높은 감도를 부여, 높은 처리량, 낮은 비용, 그리고 깊은 순서 범위의 혜택을 제공합니다.

24 바코드 일련의 라이브러리 (12 종양 정상 쌍)의 한 수영장은 279 암 유전자의 모든 단백질 코딩 엑손에 해당하는 프로브를 사용하여 캡처 및 2 × 75 BP는 HiSeq 2000 흐름 세포의 단일 차선에 읽는 순서가되었다. 종양과 정상 라이브러리는 2:1의 비율로 풀링했다. 동결 된 종양 DNA 시료 풀의 샘플 성능 메트릭은 배향 율, 단편 크기 분포에 대한 대상 캡처 특이성, 및 표적 범위를 의미 포함한,도 1에...

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Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

우리는 바코드 DNA 라이브러리 및 대규모 병렬 &quot;다음 세대&quot;염기 서열 임상 종양 표본의 주요 암 관련 변이의 검출에 대한 후속 하이브리드 기반의 엑손 캡처의 준비에 대해 설명합니다. 대상 엑손 시퀀싱 따라서 낮은 주파수 변이를 검출하는 높은 감도를 산출, 높은 처리량, 낮은 비용, 그리고 깊은 순서 범위의 혜택을 제공합니다.

엑손 캡처 및 대규모 병렬 염기 서열 종양 검체에서 체세포 유전 변경을 검출

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

detecting-somatic-genetic-alterations-tumor-specimens-exon-capture

Research

JoVE Journal

Biology

19.3K 조회수.  Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.  우리는 바코드 DNA 라이브러리 및 대규모 병렬 "다음 세대"염기 서열 임상 종양 표본의 주요 암 관련 변이의 검출에 대한 후속 하이브리드 기반의 엑손 캡처의 준비에 대해 설명합니다. 대상 엑손 시퀀싱 따라서 낮은 주파수 변이를 검출하는 높은 감도를 산출, 높은 처리량, 낮은 비용, 그리고 깊은 순서 범위의 혜택을 제공합니다. 

비디오: Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + HIV에 대한 일회용 Microfluidic 칩을 사용하여 T - 림프구 캡처

연구

생물학

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

야마나카 인자의 과발현에 의해 능성에 성인 체세포 세포의 생체 내 재 프로그램

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Linear Amplification Mediated PCR &#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with integrating vector systems. Due to the stable integration of retroviral vectors, integration sites can be used to study the clonal fate of individual cells and their progeny. LAM- PCR for the first time provided evidence that leukemia in gene therapy treated patients originated from provirus induced overexpression of a neighboring proto-oncogene. The high sensitivity and specificity of LAM-PCR compared to existing methods like inverse PCR and ligation mediated (LM)-PCR is achieved by an initial preamplification step (linear PCR of 100 cycles) using biotinylated vector specific primers which allow subsequent reaction steps to be carried out on solid phase (magnetic beads). LAM-PCR is currently the most sensitive method available to identify&#160;unknown DNA which is located in the proximity of known DNA. Recently, a variant of LAM-PCR has been developed that circumvents restriction digest thus abrogating retrieval bias of integration sites and enables a comprehensive analysis of provirus locations in host genomes. The following protocol explains step-by-step the amplification of both 3&#8217;- and 5&#8217;- sequences adjacent to the integrated lentiviral vector.

Linear Amplification Mediated PCR &amp;#8211; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA

Linear-amplification mediated (LAM)-PCR is a method developed to identify the exact positions of integrating viral vectors in the genome. The technique has evolved to be the superior method to study clonal dynamics in gene therapy patients, biosafety of novel vector technologies, T-cell diversity, cancer stem cell models, etc.

선형 증폭 매개 PCR - 알 수없는 측면에서는 DNA의 유전 적 요소와 특성의 현지화

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with ...

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model congenital abnormalities. During the first day of life, the zebrafish embryo progresses through many developmental stages including fertilization, cleavage, gastrulation, segmentation, and the organogenesis of structures such as the kidney, heart, and central nervous system. The anatomy of a young zebrafish embryo presents several challenges for the visualization and analysis of the tissues involved in many of these events because the embryo develops in association with a round yolk mass. Thus, for accurate analysis and imaging of experimental phenotypes in fixed embryonic specimens between the tailbud and 20 somite stage (10 and 19 hours post fertilization (hpf), respectively), such as those stained using whole mount in situ hybridization (WISH), it is often desirable to remove the embryo from the yolk ball and to position it flat on a glass slide. However, performing a flat mount procedure can be tedious. Therefore, successful and efficient flat mount preparation is greatly facilitated through the visual demonstration of the dissection technique, and also helped by using reagents that assist in optimal tissue handling. Here, we provide our WISH protocol for one or two-color detection of gene expression in the zebrafish embryo, and demonstrate how the flat mounting procedure can be performed on this example of a stained fixed specimen. This flat mounting protocol is broadly applicable to the study of many embryonic structures that emerge during early zebrafish development, and can be implemented in conjunction with other staining methods performed on fixed embryo samples.

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

The zebrafish embryo is an excellent model for developmental biology research. During embryogenesis, zebrafish develop with a yolk mass, which presents three-dimensional challenges for sample observation and analysis. This protocol describes how to create two-dimensional flat mount preparations of whole mount in situ (WISH) stained zebrafish embryo specimens.

전체 마운트하여 제브라 피쉬 배아 시편 스테인드 관찰 및 분석을위한 평면 마운트 준비<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

배양 된 포유 동물 세포에서 대규모 병렬 리포터 분석 실험

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

대변​​ 글루코 코르티코이드 분석 : equids는 비 침습적 부신 모니터링

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

RNA 시퀀싱 분석은 유전자 발현 및 게놈 변경을 특성화를 대상으로

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.