이 작업은 Geneplus-베이징 연구소에 의해 지원 됩니다.

북경 대학 사람들의 윤리 위원회에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 종양 표본과 혈액 샘플을 가져온 &#39; s 병원. 서 면된 동의 그들의 샘플을 사용 하 여 환자 로부터 얻은 했다. 참가자는 다음 기준에 따라 상영 했다: 여성, 고급 비 작은 세포 폐암, EGFR p.L858R 돌연변이 질병 진행 EGFR의 두 세션을 다음 타겟으로 Erlotinib, 치료 이전 생어 시퀀싱, 표시 및 저항의 원인을 분석 하 여 새로운 대상 약물을 찾을 ctDNA에 적용 된 응급실-Seq.
 1. cfDNA 및 genomic DNA (gDNA) 주변 혈액에서 DNA 추출 <ol><li>주변 혈액 컬렉션 튜브에서의 10 mL를 수집, 반전 부드럽게 위아래로 6-8 번을 혼합. 셀 전단 하지 마십시오. 혈액 샘플 컬렉션 튜브 6-37 ° C에서 최대 72 시간까지 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>1600 ()에서 10 분 동안 실내 온도에 컬렉션 튜브 원심 g. x</li>
	<li>컬렉션 튜브에서 원심 분리기 튜브 일회용 피펫으로 펠 릿 레이어 (백혈구)를 방해 하지 않고 사용 하 여 적절 하 게 표시 4 청소 2 mL 상쾌한 (플라즈마)를 전송.</li>
	<li>Transfer1 mL 2 mL를 깨끗 한 일회용 피펫으로 적절 하 게 사용 하 여 셀의 원심 분리기 관 이라는. 셀 또는 단계 1.8 전에 추운-20 ° C에서 저장 될 수 있습니다.</li>
	<li>4 ° C에서 10 분 및 16000 () (1.3 단계)에서 플라즈마 원심 g. x</li>
	<li>전송으로 제대로 표시 하는 원심 분리기 튜브 청소 플라즈마 &#34; 플라즈마 &#34;, 오염을 피하기 위하여 하단에 잔여 볼륨의 ~0.1 mL를 두고. 1.7 단계까지-80 ° C에서 플라즈마를 저장.</li>
	<li>단계 1.6에서에서 플라즈마의 3 mL cfDNA (ctDNA 포함)을 사용 하 여 제조 업체에 따라 상용 키트를 사용 하 여 &#39; s 지침.</li>
	<li>GDNA 제조 업체에 따라 상용 키트를 사용 하 여 분리 단계 1.3에서에서 백혈구의 사용 200 µ L &#39; s 지침. 
	참고: 모두 cfDNA 및 gDNA를 사용 하기 전에-20 ° C에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>는 CfDNA 및 gDNA (표 2)에 대 한 다른 품질 컨트롤을 적용합니다. 샘플 저하 및 gDNA 오염 수준을 결정 하는 bioanalyzer에 대 한 표준화 된 방법으로 품질 관리를 수행 합니다. CfDNA 추출의 품질의 피크 분석 그림 1과 유사한 표시 되어야 합니다. 
	참고: cfDNA의 최대 크기는 약 170 bp.는 DNA의 양을 증가 귀 착될 것 이다 cfDNA에 드문 돌연변이의 효과적인 탐지에 대 한 높은 품질 라이브러리 참고. 적어도 30 ng cfDNA (3만 부)를 사용 하는 것이 좋습니다.</li>
</ol> 2. 도서관 준비 참고: 조각난된 DNA에 기본 라이브러리 건설에 관한 cfDNA 피크 크기 ~ 170 bp와 조각에 존재 하 고 따라서 조각화 될 필요가 없습니다.
<ol><li>조각 컨트롤 샘플 (gDNA) 의해 얻을 200-250 bp 파편을 쥡니다.
	<ol><li>트리 스-EDTA 청소 쥡니다 튜브에 버퍼의 100 µ L에서 gDNA 샘플의 준비 1 µ g.</li>
		<li>30으로 쥡니다 프로그램 설정 s 12 분의 총 12 사이클에 대 한 해제 및 30 s</li>
		<li>쥡니다, 후 (5 µ L) 제품 2 %agarose 젤 분석을 실행 하 여 200-250 bp 파편을 포함 하는 것을 확인.</li>
		<li>새로운 1.5 mL 튜브에 모든 조각화 제품을 전송 하 고 올바른 조각을 선택 하 5 분에 대 한 자석 구슬의 150 µ L로 품 어.</li>
		<li>는 상쾌한 30 자석 선반에 튜브를 넣어 제거 s.</li>
		<li>자석 선반에 머물고 튜브 80% 에탄올 (갓 준비)의 200 µ L와 구슬 씻어. 30 알을 품는 상쾌한을 제거 하기 전에 s. 한번 반복.</li>
		<li>공기 튜브 뚜껑 자석 선반에 머무는 동안 오픈 비즈 건조. Overdried 구슬을 DNA 대상 복구 잘 다는 것을 확인 하지 마십시오. UV/Vis 분광학에 의해 정량화 다음 DNA 파편을 해결 하려면 구슬에 10 mM Tris HCl (pH 8)의 32 µ L을 추가 하 여 구슬에서 DNA 파편을 elute. 
		참고: 적어도 200 ng 다음 실험에 필요한.</li>
	</ol></li> <li>끝 준비 반응 참고: 따라 제조 업체 &#39; s 명령 및 필요에 따라 수정. CfDNA;의 사용 30 ng 그리고 컨트롤과 gDNA의 1 µ g입니다.
	살 균 nuclease 무료 튜브에 cfDNA의 <ol><li>반응 버퍼, 효소 혼합, 30의 3 µ L의 추가 7 µ L ng ddH 2 O 60 µ L의 전체 볼륨에 추가. 별도 튜브에 위의 구성 요소를 추가 하지만 1 µ g의 cfDNA 대신 gDNA.</li>
		<li>믹스 고 65 ° C는 thermocycler에서 30 분가 열 하는 뚜껑 없이 다음 30 분 동안 20 ° C에 혼합물을 품 어. 다음 단계로 바로 진행.</li>
	</ol></li> <li>어댑터 결 찰 <ol><li>결 찰 마스터 믹스의 추가 30 µ L, 결 찰 증강의 1 µ L 및 단계 2.2에서에서 혼합물에 독특한 시퀀싱 어댑터 4 µ L.</li>
		<li>열 뚜껑 없이 thermocycler에 15 분 동안 20 ° C에서 품.</li>
		<li>자석 구슬 resuspend을 다음 단계 전에 적어도 30 분 동안 실내 온도에 비즈를 두고 소용돌이.</li>
		<li>이전에 언급 한 혼합물에 resuspended 자석 구슬의 87 µ L 추가; 아래로 pipetting으로 잘 혼합 하 고 5 분에 대 한 실 온에서 품 어</li>
		<li>단계 2.1에 설명 된 대로 세척 및 공기 건조 구슬.</li>
		<li>10 mm Tris HCl (pH 8) 20 µ L을 추가 하 여 구슬에서 DNA 대상 elute.</li>
	</ol></li> <li>농축의 DNA 파편 어댑터 출혈 <ol><li>추가 20 µ L 어댑터 출혈 DNA의 파편, 인덱스 뇌관/i 7의 5 µ L (2.5 µ L 뇌관-P7 (10 분) 및 시퀀싱을 위해 뇌관-P5 (10 분)의 2.5 µ L), 25µL의 라이브러리 증폭 마스터 믹스, 그리고 ddH 2 O 50 µ L의 총 볼륨.</li>
		<li>PCR 증폭 어댑터 출혈 DNA 및 열 주기 다음과 같습니다: 98 ° C 45에서 초기 변성 뒤 8 사이클 (cfDNA) 또는 4 사이클 (gDNA) 15 ° C에 어 닐 링의 s s, 30 위한 65 ° C s, 72 ° C 30에 대 한 s) 그리고 60 72 ° C에서 최종 확장 s, 다음 4에 온도 들고 ° c.</li>
		<li>일시 자석 구슬 획득된 파편을 PCR 농축 DNA의 추가 45 µ L.</li>
		<li>10 mM Tris HCl (pH 8)의 30 µ L에서 어댑터와 함께 elute DNA 조각.</li>
	</ol></li> <li>라이브러리 품질 관리 <ol><li>제조 업체에 따라 &#39; 어댑터를 측정 하는 상업 키트에 대 한 s 프로토콜 출혈 DNA 농도. DNA 품질을 결정 하는 bioanalyzer를 사용 하 여.</li>
	</ol></li></ol> 3. 타겟 DNA 캡처 참고: 대상 농축 1021 kb 대상 농축 지역 12에서 알려진된 종양 관련 드라이버 돌연변이 취재에 대 한 특별히 설계 된-프로브 사용자 지정 시퀀스 캡처를 사용 하 여 수행한 종양의 종류입니다. 제조 업체에 대 한 수정 &#39; s 프로토콜 다음 단계에 자세히 나와 있습니다.
<ol><li>풀링 라이브러리의 차단 <ol><li>추가 1.5 µ g (cfDNA에 대 한 풀으로 라이브러리의 최대 수는 6, gDNA 20) 8 µ L P5 Block(100P), P7 Block(100P)의 8 µ L 및 침대 1 DNA의 5 µ L의 2 단계에서 (1 µ g / µ L) 무 균 튜브에. 60에서 설정 진공 집중 장치를 사용 하 여 튜브의 내용을 건조 ° c.</li>
	</ol></li> <li>DNA 캡처 라이브러리 조사 Hybridize.
	<li>3.1: 8.5 µ L 2 X 교 잡 버퍼, 교 잡 증강, 그리고 nuclease 무료 ddH 2 오의 1.8 µ L의 2.7 µ L의 단계에서 튜브를 구성 하는 다음 요소를 추가</li> 하는 <ol>
		<li>믹스를 위아래로 pipetting으로 하 고 10 분 동안 95 ° C에 thermomixer에서 품 어</li>
		<li>인큐베이션, 다음 즉시 사용자 정의 프로브의 4 µ L을 추가. 65 & # 17에서 열 cycler에서 샘플을 품 어6; 뚜껑이 있는 C 4 헤에 75 ° C에가 열</li>
	</ol></li> <li>DNA 조각 캡처 <ol><li>streptavidin 구슬 구슬 언바운드 DNA를 제거 세척 뒤 교배 대상 DNA를 품 어. 제조 업체에 따라 상업 키트를 사용 하 여 &#39; resuspended 구슬 캡처된 dna의 최종 20 µ L을 s 지침 조각.</li>
	</ol></li> <li>캡처된 DNA의 확대 조각 <ol><li>상업을 사용 하 여 수행 PCR 키트 2 µ M 백본 oligonucleotides, 제조 업체에 따르면 &#39; s 지침.</li>
		<li>때에 PCR 반응 완료, PCR 제품에 직접 정지 구슬의 45 µ L을 추가 하 고 10 mM Tris HCl (pH 8)의 30 µ L로 차입 하 여 구슬에 바인딩된 증폭된 대상 DNA 파편을 풍요롭게.</li>
	</ol></li> <li>라이브러리 정량화 키트와 함께 DNA 파편을 계량 하 고 Bioanalyzer ( 그림 2)에 의해 평균 조각 길이 결정.</li></ol>
 4. 시퀀싱 <ol><li>시퀀스 다중화 18 h. 총 데이터 생산은 최대 60 기가바이트 75 bp 짝 끝에서 실행 되는 벤치탑 시퀀서를 사용 하 여 라이브러리, 15 G는 컨트롤 샘플 gDNA 환자 샘플 cfDNA 및 1 G에 대 한 필요.</li></ol>
 5. 데이터 분석 워크플로 참고: 그림 3 일반 작업 흐름 및 데이터 분석 프로세스를 표시 합니다. 데이터 분석 매개 변수 및 명령을 다음과 같습니다.
<ol><li>고품질 읽기를 필터링 하 고 오류 및 NCfilter를 사용 하 여 UID의 수정. 
	NCfilter(own) NCfilter 필터-l 5-q 0.5-0.1 n-T 3-G-1 fastq1-2 fastq2 realSeq(own) 파이썬 빈/realRealSeq MaskUID-1 fq1-2 fq2-o 출력 dir-p 접두사-u 4-s 7-m 3-i uidFile-f.</li>
	<li>참조 게놈 hg19 (인간 게놈 19), BWA (버전 0.7.12-r1039) 메모리를 사용 하 여 시퀀싱 결과 찾아서 게놈 분석 툴킷 (GATK) (버전 3.4-46-gbc02625)로 다시 맞춥니다. 
	bwa mem t-3 hg19 fastq1 fastq2 자바-d64-서버-XX: + UseParallelGC-XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g- Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar-T RealignerTargetCreator-R hg19-L targetRegion-dbsnp 알려진 &#8212; 
	allowPotentiallyMisencodedQuals-nt 10-난 cancerBam-난 normalBam 자바-d64-서버-XX: + UseParallelGC-XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g &#8212; Djava.io.tmpdir=/tmp/-병 GenomeAnalysisTK.jar-T IndelRealigner-R hg19-dbsnp 알려져 -allowPotentiallyMisencodedQuals &#8212; targetIntervals 간격-난 cancerBam-난 normalBam</li>
	<li>UID와 기지 PCR/시퀀싱에 의해 도입 된 기본 품질 수정 오류 해결 서식 파일 조각의 위치에 따라 중복 클러스터. 
	realSeq(own) 파이썬 realSeq/빈/realSeq 클러스터-b unmarkdup_sort_merge.bam-r chipRegion-o output_dir-p -m 6를 접두사</li> <li>다시 정렬 BWA mem.에 의해 클러스터 중복 
	bwa mem t-3 hg19 fastq1 fastq2</li> <li>GATK (버전 3.4-46-gbc02625)를 사용 하 여 기본 품질 평가 점수에의 한 재 다음 로컬 재배치 수행. 
	Loacal 재배치: 자바-d64-서버-XX: + UseParallelGC-XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-병 GenomeAnalysisTK.jar-T RealignerTargetCreator-R hg19-L targetRegion-알려진 dbsnp-allowPotentiallyMisencodedQuals-nt 10 -CancerBam-난 normalBam 자바-d64-서버-XX: + UseParallelGC-XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-병 GenomeAnalysisTK.jar-T IndelRealigner-R hg19-알려진 dbsnp-allowPotentiallyMisencodedQuals-targetIntervals 간격-난 cancerBam-난 normalBam 기본 품질 점수 재: 자바-d64-서버-XX: + UseParallelGC-XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-GenomeAnalysisTK.jar-T 병 BaseRecalibrator-R hg19-L targetRegion- knownSites dbsnp-knownSites 우주 allowPotentiallyMisencodedQuals-nct 10-나 bam-o grp 자바-d64-서버-XX: + UseParallelGC-XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-GenomeAnalysisTK.jar-T 자 PrintReads-난 bam-BQSR grp-o outbam-R hg19-nct 8-allowPotentiallyMisencodedQuals</li> <li>SNV (단일 뉴클레오티드 변형) 및 INDEL (작은 삽입 또는 삭제) 전화, 낮은 주파수 변이의 정확도 추가 확인 (좋은 지원 읽습니다) 발사 잔여물에 의해 둘 다 정방향 및 역방향 가닥 읽기 제어 그룹 (생식 돌연변이)와 초기 데이터베이스를 통해 여과 및 쌍. 
	realDcaller(own) 파이썬 realDcaller-f hg19-r chipRegion-C baselineDB-O L-2 cancerBam normalBam-p 30</li> <li>CNV (복사 번호 유사) 호출에 대 한 초기 샘플 컨트롤 사용. 
	NCcnv(own) 파이썬 NCcnv-o cnvdir-t tmpdir-r chipRegion cnv-normgt normalBam-tumgt cancerBam-repdb repeatMarsk</li> <li>Realigned 매핑되지 않은, 클립 및 SV (구조적 변화) 전화를 귀에 거슬리는 쌍 읽기. 
	NCsv(own) 파이썬 NCsv-t tmpdir-r hg19-o outputdir x-사본-w bwapath n-4 normalBam cancerBam</li></ol>

<ol>
	<li>Kennedy, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+ultralow-frequency+mutations+by+Duplex+Sequencing.">Detecting ultralow-frequency mutations by Duplex Sequencing.</a> Nat. Protoc. 9, 2586-2606 (2014).</li><li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+DNA+sequencing.">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+tumor+DNA+in+early-+and+late-stage+human+malignancies.">Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies.</a> Sci. Transl. Med. 6, (2014).</li><li>Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+clinical+utility+of+ultrasensitive+circulating+tumor+DNA+detection+with+CAPP-Seq.">Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq.</a> Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).</li><li>Diaz, L. A., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsies:+genotyping+circulating+tumor+DNA.">Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA.</a> J. Clin. Oncol. 32, 579-586 (2014).</li><li>Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy:+monitoring+cancer-genetics+in+the+blood.">Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. 10, 472-484 (2013).</li><li>Su, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+platform+for+rapid+detection+of+multiple+oncogenic+mutations+with+relevance+to+targeted+therapy+in+non-small-cell+lung+cancer.">A platform for rapid detection of multiple oncogenic mutations with relevance to targeted therapy in non-small-cell lung cancer.</a> J. Mol. Diagn. 13, 74-84 (2011).</li><li>Kukita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fidelity+target+sequencing+of+individual+molecules+identified+using+barcode+sequences:+de+novo+detection+and+absolute+quantitation+of+mutations+in+plasma+cell-free+DNA+from+cancer+patients.">High-fidelity target sequencing of individual molecules identified using barcode sequences: de novo detection and absolute quantitation of mutations in plasma cell-free DNA from cancer patients.</a> DNA Res. 22, 269-277 (2015).</li><li>Schmitt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+small+genomic+targets+with+high+efficiency+and+extreme+accuracy.">Sequencing small genomic targets with high efficiency and extreme accuracy.</a> Nat. Methods. 12, 423-425 (2015).</li><li>Schmitt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+ultra-rare+mutations+by+next-generation+sequencing.">Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 14508-14513 (2012).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+method+for+quantitating+circulating+tumor+DNA+with+broad+patient+coverage.">An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage.</a> Nat. Med. 20, 548-554 (2014).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+digital+error+suppression+for+improved+detection+of+circulating+tumor+DNA.">Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA.</a> Nat Biotechnol. 34 (5), 547-555 (2016).</li><li>Alix-Panabie&#768;res, C., Schwarzenbach, H., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+and+circulating+tumor+DNA.">Circulating tumor cells and circulating tumor DNA.</a> Annu. Rev. Med. 63, 199-215 (2012).</li><li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer.">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> N. Engl. J. Med. 368, 1199-1209 (2013).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+short-read+alignment+with+Burrows-+Wheeler+transform.">Fast and accurate short-read alignment with Burrows- Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li><li>Youn, A., Simon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+cancer+driver+genes+in+tumor+genome+sequencing+studies.">Identifying cancer driver genes in tumor genome sequencing studies.</a> Bioinformatics. 27, 175-181 (2011).</li><li>Forshew, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+identification+and+monitoring+of+cancer+mutations+by+targeted+deep+sequencing+of+plasma+DNA.">Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li><li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+mutation+and+resistance+of+non-small-cell+lung+cancer+to+gefitinib.">EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib.</a> N. Engl. J. Med. 352, 786-792 (2005).</li><li>Kuang, Y., Rogers, A., Yeap, Y., Wang, L., Makrigiorgos, M., Vetrand, K., Thiede, S., Distel, R. J., Ja&#776;nne, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+detection+of+EGFR+T790M+in+gefitinib+or+erlotinib+resistant+non-small+cell+lung+cancer.">Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer.</a> Clin. Cancer Res. 15, 2630-2636 (2009).</li><li>Taniguchi, K., Uchida, J., Nishino, K., Kumagai, T., Okuyama, T., Okami, J., Higashiyama, M., Kodama, K., Imamura, F., Kato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+of+EGFR+mutations+in+circulating+tumor+DNA+derived+from+lung+adenocarcinomas.">Quantitative detection of EGFR mutations in circulating tumor DNA derived from lung adenocarcinomas.</a> Clin. Cancer Res. 17, 7808-7815 (2011).</li><li>Leary, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+personalized+tumor+biomarkers+using+massively+parallel+sequencing.">Development of personalized tumor biomarkers using massively parallel sequencing.</a> Sci. Transl. Med. 2, (2010).</li><li>Forshew, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+identification+and+monitoring+of+cancer+mutations+by+targeted+deep+sequencing+of+plasma+DNA.">Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li><li>Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+clinical+utility+of+ultrasensitive+circulating+tumor+DNA+detection+with+CAPP-Seq.">Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq.</a> Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).</li></ol>

저자는 공개 없다.

그러나 순환 종양 DNA (ctDNA)의 존재는 ctDNA 분석의 응용 프로그램은 여전히 하지 일상적인 임상 연습에 30 여 년 전, 발견 되었다. CtDNA 검출 및 분석을 위한 기술 개발의 ctDNA 방법의 실용적인 응용 프로그램에 대 한 관심 증가 했다. 미세한 잔여 질병, 치료, 그리고 종양 진화와 intratumoral이13의 배경 아래 종양 분자 프로 파일에 대 한 응답의 평가 대 한 최소한-침략 적 접근을 제?...

차세대 시퀀싱 (NGS), 강력한 도구, 게놈의 신비를 조사 하는 유전 변경을 드러낼 수 있는 정보의 대량을 제공할 수 있습니다. 병원에서 NGS 분석의 응용 프로그램은 특히 맞춤된 의학에 대 한 더 일반적인 되고있다. 그러나 NGS의 가장 큰 한계 중 하나는, 높은 오류 비율입니다. 공부 상속 된 돌연변이 적합 하다, 비록 드문 돌연변이의 분석은 크게 제한1,2, 특히 "" 액체 생 검에서 얻은 DNA를 분석.
종양을 순환 DNA (ctDNA) 종양 세포에서 헛간 혈액 세포 무료 DNA (cfDNA) 이다. 대부분의 경우, ctDNA의 수량에서는 매우 낮은 하 게 하는 그것의 탐지 및 분석 매우 도전입니다. 그러나, ctDNA는 많은 매력적인 기능: 그것의 고립은 최소한 침략 적, 종양 성장의 초기 단계에서 검출 될 수 있다, 치료 효율성을 반영 하는 ctDNA 수준 및 ctDNA 기본 및 전이성 병 변에서 발견 DNA 변이 포함 3 , 4 , 5. 따라서, NGS 기술과 분석의 급속 한 발전을 감안할 때, ctDNA 검출 응용 되고있다 더 매력적.
다른 대규모 병렬 시퀀싱 방법 ctDNA 탐지를 위해 이용 되었습니다 있지만 이러한 방법 중 누구도 클리닉 그들의 제한 때문에 일상적인 사용 하기 위해 허용: 낮은 감도, 다양성의 부족 및 상대적으로 높은 비용6 ,,78. 예를 들어 이중 시퀀싱, 고유 식별자 (UID), 태그에 따라 반복적으로 대부분의 시퀀싱 오류 조정 합의 양방향으로에서 오류를 수정 합니다. 그러나,이 방법의 타당성은 그것의 높은 비용 및 낮은 데이터 활용9,10손실. 마찬가지로, CAPP-Seq 및 그것의 향상 된 반복, CAPP IDE11,12에 있는 큰 실용성 cfDNA 탐지 정확성과 이러한 방법의 개선이 필요 하지만.
정확한 ctDNA 탐지 및 분석에 대 한 현재 필요를 충족 시키기 위해 우리는 풍요롭게 드문 돌연변이 시퀀싱 (ER-Seq)는 새로운 전략을 개발 했다. 이 방법은 다음 결합: ctDNA 분자, 양방향 오류 수정와 중 단일 변이 구별 하는 기능을 효율적으로 복구 하 고유 시퀀싱 어댑터 &#62; 1 × 107 야생-타입 뉴클레오티드; 1021 kb 프로브 커버 대상 영역의 측정의 질을 높일 12 종양, 폐암, 대 장 암, 위 암, 유방암, 신장 암, 췌장암, 간 암, 갑 상선 암 등 종양 관련 돌연변이의 95% 자 궁 경부 암, 식도 암 및 자궁내 막 암 (표 1). 그리고 초기 데이터베이스 심사 하기가 효율적이 고 정확 하 게 ctDNA에 드문 돌연변이 검출 하기 쉽다.
초기 데이터베이스를 구축, 샘플 (처음 ~ 1000)의 같은 종류의 숫자에서 응급실-Seq에 의해 모든 유전자 돌연변이 찾아. 이 진짜 돌연변이 다른 여러 신뢰할 수 있는 검출 방법 및 분석 하 여 확인 해야 합니다. 다음, 거짓 변이의 패턴을 요약 하 고 초기 기준선 데이터베이스 구축 모든 거짓 돌연변이 클러스터. 계속이 데이터베이스에 후속 시퀀싱 실험에서 발견 하는 거짓 변이 추가 합니다. 따라서,이 기준선 데이터베이스 동적 확장된 데이터베이스, 시퀀싱 정확도 크게 향상 됩니다.
진행을 촉진 하 종양 진단 및 모니터링에서 우리는 응급실-Seq, 유니버설 데이터의 수집에 대 한 저비용이 고 실현 가능한 방법 제시. 우리 병원에서 희귀 한 돌연변이 및 사용에 대 한 타당성을 탐지 하기 위한 그것의 정확도 보여주는 수술 응급실-Seq 분석, 사례 연구를 제시.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>55114</td>
			<td>DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51105</td>
			<td>DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Measure cfDNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32853</td>
			<td>Measure library concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 Reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>Measure cfDNA and library fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E7645L</td>
			<td>Library Preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt SPRIselect Reagent</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>B23317</td>
			<td>DNA fragment screening and purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93283</td>
			<td>Dissolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xGen Lockdown Probes</td>
			<td>IDT</td>
			<td>&#8212;&#8212;</td>
			<td>xGen Custom Probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cot-1 DNA</td>
			<td>Life</td>
			<td>15279-011</td>
			<td>Targeted DNA capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td>
			<td>Life</td>
			<td>65305</td>
			<td>Targeted DNA capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xGen Lockdown Reagents</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1072281</td>
			<td>Targeted DNA capture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td>
			<td>KAPA</td>
			<td>KK2602</td>
			<td>post-capture PCR enrichment libraries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA Library Quantification Kit</td>
			<td>KAPA</td>
			<td>KK4602</td>
			<td>Measure library concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles)</td>
			<td>illumina</td>
			<td>FC-404-2002</td>
			<td>Sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge5810</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop8000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8000</td>
			<td>Measure gDNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Quantify</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16-tube DynaMagTM-2 Magnet</td>
			<td>Life</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentrator plus</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR</td>
			<td>AB</td>
			<td>simplyamp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QPCR</td>
			<td>AB</td>
			<td>7500Dx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500</td>
			<td>illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of rare mutations in ctdna using next generation sequencing

차세대 시퀀싱 (NGS)를 사용 하 여 종양 DNA (ctDNA) 순환의 분석 임상 종양학의 개발을 위한 유용한 도구가 되고있다. 그러나,이 방법의 응용 프로그램 때문에 혈액에 있는 ctDNA의 양을 추적 분석에서 낮은 감도 도전 이다. 또한, 메서드는이 시퀀싱 및 이후 분석에서 거짓 긍정 및 부정적인 결과 생성할 수 있습니다. 타당성과 병원에서 ctDNA 검색의 신뢰성을 개선 하기 위해, 여기 선물이 시퀀싱, 풍요롭게 드문 돌연변이 시퀀싱 (ER-Seq) 드문 돌연변이 풍요롭게 하는 기술. ER-Seq 유망한 도구 매우 낮은 주파수 유전 변경 감지를 하 게 하 고 따라서 질병 heterogenicity 공부에 매우 도움이 될 것입니다 1 x 107 야생-타입 뉴클레오티드에서 단일 돌연변이 구분할 수 있습니다. 고유한 시퀀싱 어댑터의 결 찰, 덕이 메서드 동안 오류 양방향으로 (감각과 antisense)에 대 한 동일한 시간 수정에 ctDNA 분자의 효율적인 복구를 수 있습니다. 덮어 대상 영역의 측정을 풍요롭게 하는 우리의 다양 한 1021 kb 프로브 12 종양에서 종양 관련 드라이버 돌연변이의 95%. 비용 효율적이 고 보편적인 방법이 유전자 데이터의 유일 하 게 성공적인 축적 수 있습니다. 효율적으로 배경 오류 필터링, 후 응급실-seq 정확 하 게 희귀 변이 검색할 수 있습니다. 사례 연구를 사용 하 여, 상세한 프로토콜 프로브 디자인, 도서관 건설, 대상 DNA 캡처 방법론, 데이터 분석 워크플로 포함 하는 동안에 시연 선물이. 일반적으로이 메서드를 수행 하는 과정 1-2 일 소요 됩니다.

ER-Seq에 사용 되는 풍부한 대상 지역 표 1에 나와 있습니다 1021 kb 프로브는 커버 12 일반적인 종양의 유전자 돌연변이의 95% 이상. 이러한 프로브의 광범위 암 환자의 대다수에 적용이 프로세스를 만든다. 또한, 우리의 독특한 시퀀싱 어댑터 및 기준선 데이터베이스 검사 가능 하 게 그것은 드문 돌연변이 정확 하 게 감지 하.
<p class="jove_content" fo:k...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing at JoVE.com

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

이 원고 ctDNA, 응급실이에서 낮은 주파수의 돌연변이 검출 하는 기술을 설명 합니다. 이 메서드는 두 방향 오류 수정, 특별 한 배경 필터 및 효율적인 분자 신안의 독특한 사용에 의해 분화 된다.

다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 CtDNA에서 희소 한 변이의 탐지

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

detection-of-rare-mutations-in-ctdna-using-next-generation-sequencing

Research

JoVE Journal

Cancer Research

16.7K 조회수.  Geneplus-Beijing Institute. 이 원고 ctDNA, 응급실이에서 낮은 주파수의 돌연변이 검출 하는 기술을 설명 합니다. 이 메서드는 두 방향 오류 수정, 특별 한 배경 필터 및 효율적인 분자 신안의 독특한 사용에 의해 분화 된다.

비디오: Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific molecular profiles of a tumor may predict responsiveness to therapeutic agents or provide knowledge about prognosis. At our institution a tumor genotyping program was established as part of routine clinical care, screening both hematologic and solid tumors for a wide spectrum of mutations using two next-generation sequencing (NGS) panels: a custom, 33 gene hematological malignancies panel for use with peripheral blood and bone marrow, and a commercially produced solid tumor panel for use with formalin-fixed paraffin-embedded tissue that targets 47 genes commonly mutated in cancer. Our workflow includes a pathologist review of the biopsy to ensure there is adequate amount of tumor for the assay followed by customized DNA extraction is performed on the specimen. Quality control of the specimen includes steps for quantity, quality and integrity and only after the extracted DNA passes these metrics an amplicon library is generated and sequenced. The resulting data is analyzed through an in-house bioinformatics pipeline and the variants are reviewed and interpreted for pathogenicity. Here we provide a snapshot of the utility of each panel using two clinical cases to provide insight into how a well-designed NGS workflow can contribute to optimizing clinical outcomes.

This manuscript describes clinical protocols for two next-generation sequencing panels. One panel interrogates hematologic malignancies while the other panel targets genes commonly mutated in solid tumors. Molecular classification of driver mutations in human malignancies offers valuable prognostic and predictive information.

고체 및 액체 종양에서 실행 가능한 돌연변이의 검출을위한 차세대 시퀀싱

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

연구

암 연구학

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance can be caused by a range of mechanisms, including increased drug elimination, decreased drug uptake, drug inactivation and alterations of drug targets. Recent data showed that other than by well-known genetic (mutation, amplification) and epigenetic (DNA hypermethylation, histone post-translational modification) modifications, drug resistance mechanisms might also be regulated by splicing aberrations. This is a rapidly growing field of investigation that deserves future attention in order to plan more effective therapeutic approaches. The protocol described in this paper is aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of several in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes. In particular, we evaluated the differential splicing of DDX5 and PKM transcripts. The aberrant splicing detected by the computational tool MATS was validated in leukemic cells, showing that different DDX5 splice variants are expressed in the parental vs. resistant cells. In these cells, we also observed a higher PKM2/PKM1 ratio, which was not detected in the Panc-1 gemcitabine-resistant counterpart compared to parental Panc-1 cells, suggesting a different mechanism of drug-resistance induced by gemcitabine exposure.

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Here we describe a protocol aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of parental and resistant in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes.

에 약물 저항 관련 소설 스플 라이스 변종을 감지하는 RNA 시퀀싱을 사용하여<em&gt; 체외</em&gt; 암 모델

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We developed an in vitro fully human preclinical model of a co-culture of breast cancer cells and monocytes undergoing differentiation towards osteoclasts. We optimized a model of osteoclastogenesis starting from a sample of peripheral blood collected from healthy donors. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were first separated by density gradient centrifugation, seeded at a high density and induced to differentiate by adding two growth factors (GFs): receptor activator of nuclear factor-&#954;B ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (MCSF). The cells were left in culture for 14 days and then fixed and analyzed by downstream analysis. In osteolytic bone metastases, one of the effects of cancer cell arrival in bone is the induction of osteoclastogenesis. We thus challenged our model with co-cultures of breast cancer cells to study the differentiation power of cancer cells with respect to GFs. A straightforward way of studying cancer cell-osteoclast interaction is to perform indirect co-cultures based on the use of conditioned medium collected from breast cancer cell cultures and mixed with fresh medium. This mixture is then used to induce osteoclast differentiation. We also optimized a method of direct co-culture in which cancer cells and monocytes undergoing differentiation share the medium and exchange secreted factors. This is a significant improvement over the original indirect co-culture method as researchers can observe the reciprocal interactions of the two cell types and perform downstream analyses for both cancer cells and osteoclasts. This method enables us to study the effect of drugs on the metastatic bone microenvironment and to seed cell lines other than those derived from breast cancer. The model can also be used to study other diseases such as osteoporosis or other bone conditions.

This protocol describes development of an in vitro human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes cultured with breast cancer cell lines to mimic the cancer cell-osteoclast interaction. The model could be used to further our understanding of bone metastasis formation and improve therapeutic options.

말 초 혈액 Monocytes 유 방 암 세포 라인 공동 경작에서 Osteoclastogenesis의 인간의 전 임상 모델의 개발

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, and prediction of treatment resistance. Starting from the hypothesis that androgen receptor (AR) gene copy number (CN) gain is a frequent event in metastatic castration resistance prostate cancer (mCRPC), we propose to analyze this event in cfDNA as a potential predictive biomarker.
We evaluated AR CN in cfDNA using 2 different real-time PCR assays and 2 reference genes (RNaseP and AGO1). DNA amount of 60 ng was used for each assay combination. AR CN gain was confirmed using Digital PCR as a more accurate method. CN variation analysis has already been demonstrated to be informative for the prediction of treatment resistance in the setting of mCRPC, but it could be useful also for other purposes in different patient settings. CN analysis on cfDNA has several advantages: it is non-invasive, rapid and easy to perform, and it starts from a small volume of serum or plasma material.

This manuscript describes the copy number variation analysis performed in serum or plasma DNA using real-time PCR approach. This method is suitable for the prediction of drug resistance in castration resistant prostate cancer patients, but it could be informative also for other diseases.

혈 청 및 혈장 복사 번호 검출 실시간 PCR를 사용 하 여

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of associated loci. In addition, the presence of specific modifications has been used to determine the position and identity non-coding functional elements such as enhancers. In recent years, chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) has become a powerful tool in determining the genome-wide profiles of individual histone modifications. However, it has become increasingly clear that the combinatorial patterns of chromatin modifications, referred to as Chromatin States, determine the identity and nature of the associated genomic locus. Therefore, workflows consisting of robust high-throughput (HT) methodologies for profiling a number of histone modification marks, as well as computational analyses pipelines capable of handling myriads of ChIP-Seq profiling datasets, are needed for comprehensive determination of epigenomic states in large number of samples. The HT-ChIP-Seq workflow presented here consists of two modules: 1) an experimental protocol for profiling several histone modifications from small amounts of tumor samples and cell lines in a 96-well format; and 2) a computational data analysis pipeline that combines existing tools to compute both individual mark occupancy and combinatorial chromatin state patterns. Together, these two modules facilitate easy processing of hundreds of ChIP-Seq samples in a fast and efficient manner. The workflow presented here is used to derive chromatin state patterns from 6 histone mark profiles in melanoma tumors and cell lines. Overall, we present a comprehensive ChIP-seq workflow that can be applied to dozens of human tumor samples and cancer cell lines to determine epigenomic aberrations in various malignancies.

Here, we describe an optimized high-throughput ChIP-sequencing protocol and computational analyses pipeline for the determination of genome-wide chromatin state patterns from frozen tumor tissues and cell lines.

종양 조직에 높은 처리량 칩 시퀀스를 사용 하 여 Chromatin의 게놈 넓은 매핑 위한 통합된 플랫폼

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal gastric mucosa. Recently, we detected CDH1a transcript variant in fresh-frozen tumor tissues obtained from patients with GC. The expression of this variant in tissue samples was investigated by the chip-based digital PCR (dPCR) approach presented here. dPCR offers the potential for an accurate, robust, and highly sensitive measurement of nucleic acids and is increasingly utilized for many applications in different fields. dPCR is capable of detecting rare targets; in addition, dPCR offers the possibility for absolute and precise quantification of nucleic acids without the need for calibrators and standard curves. In fact, the reaction partitioning enriches the target from the background, which improves amplification efficiency and tolerance to inhibitors. Such characteristics make dPCR an optimal tool for the detection of the CDH1a rare transcript.

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

The manuscript describes a chip-based digital PCR assay to detect a rare CDH1 transcript variant (CDH1a) in fresh-frozen normal and tumor tissues obtained from patients with gastric cancer.

칩 기반 디지털 PCR에 의해 신선한 냉동 위 암 조직에서 CDH1 드문 사본 이체의 탐지

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples from cancer patients often directly influences diagnosis, prognosis, and/or therapy selection. As a result, the accurate detection of gene fusions has become a critical component of clinical management for many disease types. Until recently, clinical gene fusion detection was predominantly accomplished through the use of single-gene assays. However, the ever-growing list of gene fusions with clinical significance has created a need for assessing fusion status of multiple genes simultaneously. Next generation sequencing (NGS)-based testing has met this demand through the ability to sequence nucleic acid in massively parallel fashion. Multiple NGS-based approaches that employ different strategies for gene target enrichment are now available for use in clinical molecular diagnostics, each with its own strengths and weaknesses. This article describes the use of anchored multiplex PCR (AMP)-based target enrichment and library preparation followed by NGS to assess for gene fusions in clinical solid tumor specimens. AMP is unique among amplicon-based enrichment approaches in that it identifies gene fusions regardless of the identity of the fusion partner. Detailed here are both the wet-bench and data analysis steps that ensure accurate gene fusion detection from clinical samples.

This article details the use of an anchored multiplex polymerase chain reaction-based library preparation kit followed by next-generation sequencing to assess for oncogenic gene fusions in clinical solid tumor samples. Both wet-bench and data analysis steps are described.

앵커드 멀티플렉스 폴리머라제 연쇄 반응을 이용한 종양발생 유전자 융합 검출 후 차세대 염기서열 분석

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Machine Learning Algorithms for Early Detection of Bone Metastases in an Experimental Rat Model

Machine learning (ML) algorithms permit the integration of different features into a model to perform classification or regression tasks with an accuracy exceeding its constituents. This protocol describes the development of an ML algorithm to predict the growth of breast cancer bone macrometastases in a rat model before any abnormalities are observable with standard imaging methods. Such an algorithm can facilitate the detection of early metastatic disease (i.e., micrometastasis) that is regularly missed during staging examinations.
The applied metastasis model is site-specific, meaning that the rats develop metastases exclusively in their right hind leg. The model&#8217;s tumor-take rate is 60%&#8211;80%, with macrometastases becoming visible in magnetic resonance imaging (MRI) and positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) in a subset of animals 30 days after induction, whereas a second subset of animals exhibit no tumor growth.
Starting from image examinations acquired at an earlier time point, this protocol describes the extraction of features that indicate tissue vascularization detected by MRI, glucose metabolism by PET/CT, and the subsequent determination of the most relevant features for the prediction of macrometastatic disease. These features are then fed into a model-averaged neural network (avNNet) to classify the animals into one of two groups: one that will develop metastases and the other that will not develop any tumors. The protocol also describes the calculation of standard diagnostic parameters, such as overall accuracy, sensitivity, specificity, negative/positive predictive values, likelihood ratios, and the development of a receiver operating characteristic. An advantage of the proposed protocol is its flexibility, as it can be easily adapted to train a plethora of different ML algorithms with adjustable combinations of an unlimited number of features. Moreover, it can be used to analyze different problems in oncology, infection, and inflammation.

This protocol was designed to train a machine learning algorithm to use a combination of imaging parameters derived from magnetic resonance imaging (MRI) and positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) in a rat model of breast cancer bone metastases to detect early metastatic disease and predict subsequent progression to macrometastases.

실험래기 모델에서 뼈 전이를 조기에 감지하기 위한 기계 학습 알고리즘

Machine learning (ML) algorithms permit the integration of different features into a model to perform classification or regression tasks with an accuracy ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in glioblastoma (GBM), the most prevalent and devastating primary brain tumor. The presence of GSCs makes the GBM very refractory to most of individual targeted agents, so high-throughput screening methods are required to identify potential effective combination therapeutics. The protocol describes a simple workflow to enable rapid screening for potential combination therapy with synergistic interaction. The general steps of this workflow consist of establishing luciferase-tagged GSCs, preparing matrigel coated plates, combination drug screening, analyzing, and validating the results.

환자 유래 신경종 줄기 세포를 사용하여 GBM에 대한 잠재적인 조합 요법을 식별하는 신속한 선별 워크플로우

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly with many downstream assays such as next generation sequencing. Automated tissue dissection is a new methodology that automates and improves tumor enrichment in these common, low tumor content tissues by decreasing the user-dependent imprecision of traditional macro-dissection and time, cost, and expertise limitations of laser capture microdissection by using digital image annotation overlay onto unstained slides. Here, digital hematoxylin and eosin (H&#38;E) annotations are used to target small tumor areas using a blade that is 250 &#181;m2 in diameter in unstained formalin fixed paraffin embedded (FFPE) or fresh frozen sections up to 20 &#181;m in thickness for automated tumor enrichment prior to nucleic acid extraction and whole exome sequencing (WES). Automated dissection can harvest annotated regions in low tumor content tissues from single or multiple sections for nucleic acid extraction. It also allows for capture of extensive pre- and post-harvest collection metrics while improving accuracy, reproducibility, and increasing throughput with utilization of fewer slides. The described protocol enables digital annotation with automated dissection on animal and/or human FFPE or fresh frozen tissues with low tumor content and could also be used for any region of interest enrichment to boost adequacy for downstream sequencing applications in clinical or research workflows.

Digital annotation with automated tissue dissection provides an innovative approach to enriching tumor in low tumor content cases and is adaptable to both paraffin and frozen tissue types. The described workflow improves accuracy, reproducibility and throughput and could be applied to both research and clinical settings.

낮은 종양 함량 조직에서 종양 농축을 위한 자동화된 해부 프로토콜

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...