Name: detection of rare mutations in ctdna using next generation sequencing
Uploaded: 2017-08-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing at JoVE.com

이 작업은 Geneplus-베이징 연구소에 의해 지원 됩니다.

북경 대학 사람들의 윤리 위원회에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 종양 표본과 혈액 샘플을 가져온 &#39; s 병원. 서 면된 동의 그들의 샘플을 사용 하 여 환자 로부터 얻은 했다. 참가자는 다음 기준에 따라 상영 했다: 여성, 고급 비 작은 세포 폐암, EGFR p.L858R 돌연변이 질병 진행 EGFR의 두 세션을 다음 타겟으로 Erlotinib, 치료 이전 생어 시퀀싱, 표시 및 저항의 원인을 분석 하 여 새로운 대상 약물을 찾을 ctDNA에 적용 된 응급실-Seq.
 1. cfDNA 및 genomic DNA (gDNA) 주변 혈액에서 DNA 추출 <ol><li>주변 혈액 컬렉션 튜브에서의 10 mL를 수집, 반전 부드럽게 위아래로 6-8 번을 혼합. 셀 전단 하지 마십시오. 혈액 샘플 컬렉션 튜브 6-37 ° C에서 최대 72 시간까지 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>1600 ()에서 10 분 동안 실내 온도에 컬렉션 튜브 원심 g. x</li>
	<li>컬렉션 튜브에서 원심 분리기 튜브 일회용 피펫으로 펠 릿 레이어 (백혈구)를 방해 하지 않고 사용 하 여 적절 하 게 표시 4 청소 2 mL 상쾌한 (플라즈마)를 전송.</li>
	<li>Transfer1 mL 2 mL를 깨끗 한 일회용 피펫으로 적절 하 게 사용 하 여 셀의 원심 분리기 관 이라는. 셀 또는 단계 1.8 전에 추운-20 ° C에서 저장 될 수 있습니다.</li>
	<li>4 ° C에서 10 분 및 16000 () (1.3 단계)에서 플라즈마 원심 g. x</li>
	<li>전송으로 제대로 표시 하는 원심 분리기 튜브 청소 플라즈마 &#34; 플라즈마 &#34;, 오염을 피하기 위하여 하단에 잔여 볼륨의 ~0.1 mL를 두고. 1.7 단계까지-80 ° C에서 플라즈마를 저장.</li>
	<li>단계 1.6에서에서 플라즈마의 3 mL cfDNA (ctDNA 포함)을 사용 하 여 제조 업체에 따라 상용 키트를 사용 하 여 &#39; s 지침.</li>
	<li>GDNA 제조 업체에 따라 상용 키트를 사용 하 여 분리 단계 1.3에서에서 백혈구의 사용 200 µ L &#39; s 지침. 
	참고: 모두 cfDNA 및 gDNA를 사용 하기 전에-20 ° C에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>는 CfDNA 및 gDNA (표 2)에 대 한 다른 품질 컨트롤을 적용합니다. 샘플 저하 및 gDNA 오염 수준을 결정 하는 bioanalyzer에 대 한 표준화 된 방법으로 품질 관리를 수행 합니다. CfDNA 추출의 품질의 피크 분석 그림 1과 유사한 표시 되어야 합니다. 
	참고: cfDNA의 최대 크기는 약 170 bp.는 DNA의 양을 증가 귀 착될 것 이다 cfDNA에 드문 돌연변이의 효과적인 탐지에 대 한 높은 품질 라이브러리 참고. 적어도 30 ng cfDNA (3만 부)를 사용 하는 것이 좋습니다.</li>
</ol> 2. 도서관 준비 참고: 조각난된 DNA에 기본 라이브러리 건설에 관한 cfDNA 피크 크기 ~ 170 bp와 조각에 존재 하 고 따라서 조각화 될 필요가 없습니다.
<ol><li>조각 컨트롤 샘플 (gDNA) 의해 얻을 200-250 bp 파편을 쥡니다.
	<ol><li>트리 스-EDTA 청소 쥡니다 튜브에 버퍼의 100 µ L에서 gDNA 샘플의 준비 1 µ g.</li>
		<li>30으로 쥡니다 프로그램 설정 s 12 분의 총 12 사이클에 대 한 해제 및 30 s</li>
		<li>쥡니다, 후 (5 µ L) 제품 2 %agarose 젤 분석을 실행 하 여 200-250 bp 파편을 포함 하는 것을 확인.</li>
		<li>새로운 1.5 mL 튜브에 모든 조각화 제품을 전송 하 고 올바른 조각을 선택 하 5 분에 대 한 자석 구슬의 150 µ L로 품 어.</li>
		<li>는 상쾌한 30 자석 선반에 튜브를 넣어 제거 s.</li>
		<li>자석 선반에 머물고 튜브 80% 에탄올 (갓 준비)의 200 µ L와 구슬 씻어. 30 알을 품는 상쾌한을 제거 하기 전에 s. 한번 반복.</li>
		<li>공기 튜브 뚜껑 자석 선반에 머무는 동안 오픈 비즈 건조. Overdried 구슬을 DNA 대상 복구 잘 다는 것을 확인 하지 마십시오. UV/Vis 분광학에 의해 정량화 다음 DNA 파편을 해결 하려면 구슬에 10 mM Tris HCl (pH 8)의 32 µ L을 추가 하 여 구슬에서 DNA 파편을 elute. 
		참고: 적어도 200 ng 다음 실험에 필요한.</li>
	</ol></li> <li>끝 준비 반응 참고: 따라 제조 업체 &#39; s 명령 및 필요에 따라 수정. CfDNA;의 사용 30 ng 그리고 컨트롤과 gDNA의 1 µ g입니다.
	살 균 nuclease 무료 튜브에 cfDNA의 <ol><li>반응 버퍼, 효소 혼합, 30의 3 µ L의 추가 7 µ L ng ddH 2 O 60 µ L의 전체 볼륨에 추가. 별도 튜브에 위의 구성 요소를 추가 하지만 1 µ g의 cfDNA 대신 gDNA.</li>
		<li>믹스 고 65 ° C는 thermocycler에서 30 분가 열 하는 뚜껑 없이 다음 30 분 동안 20 ° C에 혼합물을 품 어. 다음 단계로 바로 진행.</li>
	</ol></li> <li>어댑터 결 찰 <ol><li>결 찰 마스터 믹스의 추가 30 µ L, 결 찰 증강의 1 µ L 및 단계 2.2에서에서 혼합물에 독특한 시퀀싱 어댑터 4 µ L.</li>
		<li>열 뚜껑 없이 thermocycler에 15 분 동안 20 ° C에서 품.</li>
		<li>자석 구슬 resuspend을 다음 단계 전에 적어도 30 분 동안 실내 온도에 비즈를 두고 소용돌이.</li>
		<li>이전에 언급 한 혼합물에 resuspended 자석 구슬의 87 µ L 추가; 아래로 pipetting으로 잘 혼합 하 고 5 분에 대 한 실 온에서 품 어</li>
		<li>단계 2.1에 설명 된 대로 세척 및 공기 건조 구슬.</li>
		<li>10 mm Tris HCl (pH 8) 20 µ L을 추가 하 여 구슬에서 DNA 대상 elute.</li>
	</ol></li> <li>농축의 DNA 파편 어댑터 출혈 <ol><li>추가 20 µ L 어댑터 출혈 DNA의 파편, 인덱스 뇌관/i 7의 5 µ L (2.5 µ L 뇌관-P7 (10 분) 및 시퀀싱을 위해 뇌관-P5 (10 분)의 2.5 µ L), 25µL의 라이브러리 증폭 마스터 믹스, 그리고 ddH 2 O 50 µ L의 총 볼륨.</li>
		<li>PCR 증폭 어댑터 출혈 DNA 및 열 주기 다음과 같습니다: 98 ° C 45에서 초기 변성 뒤 8 사이클 (cfDNA) 또는 4 사이클 (gDNA) 15 ° C에 어 닐 링의 s s, 30 위한 65 ° C s, 72 ° C 30에 대 한 s) 그리고 60 72 ° C에서 최종 확장 s, 다음 4에 온도 들고 ° c.</li>
		<li>일시 자석 구슬 획득된 파편을 PCR 농축 DNA의 추가 45 µ L.</li>
		<li>10 mM Tris HCl (pH 8)의 30 µ L에서 어댑터와 함께 elute DNA 조각.</li>
	</ol></li> <li>라이브러리 품질 관리 <ol><li>제조 업체에 따라 &#39; 어댑터를 측정 하는 상업 키트에 대 한 s 프로토콜 출혈 DNA 농도. DNA 품질을 결정 하는 bioanalyzer를 사용 하 여.</li>
	</ol></li></ol> 3. 타겟 DNA 캡처 참고: 대상 농축 1021 kb 대상 농축 지역 12에서 알려진된 종양 관련 드라이버 돌연변이 취재에 대 한 특별히 설계 된-프로브 사용자 지정 시퀀스 캡처를 사용 하 여 수행한 종양의 종류입니다. 제조 업체에 대 한 수정 &#39; s 프로토콜 다음 단계에 자세히 나와 있습니다.
<ol><li>풀링 라이브러리의 차단 <ol><li>추가 1.5 µ g (cfDNA에 대 한 풀으로 라이브러리의 최대 수는 6, gDNA 20) 8 µ L P5 Block(100P), P7 Block(100P)의 8 µ L 및 침대 1 DNA의 5 µ L의 2 단계에서 (1 µ g / µ L) 무 균 튜브에. 60에서 설정 진공 집중 장치를 사용 하 여 튜브의 내용을 건조 ° c.</li>
	</ol></li> <li>DNA 캡처 라이브러리 조사 Hybridize.
	<li>3.1: 8.5 µ L 2 X 교 잡 버퍼, 교 잡 증강, 그리고 nuclease 무료 ddH 2 오의 1.8 µ L의 2.7 µ L의 단계에서 튜브를 구성 하는 다음 요소를 추가</li> 하는 <ol>
		<li>믹스를 위아래로 pipetting으로 하 고 10 분 동안 95 ° C에 thermomixer에서 품 어</li>
		<li>인큐베이션, 다음 즉시 사용자 정의 프로브의 4 µ L을 추가. 65 & # 17에서 열 cycler에서 샘플을 품 어6; 뚜껑이 있는 C 4 헤에 75 ° C에가 열</li>
	</ol></li> <li>DNA 조각 캡처 <ol><li>streptavidin 구슬 구슬 언바운드 DNA를 제거 세척 뒤 교배 대상 DNA를 품 어. 제조 업체에 따라 상업 키트를 사용 하 여 &#39; resuspended 구슬 캡처된 dna의 최종 20 µ L을 s 지침 조각.</li>
	</ol></li> <li>캡처된 DNA의 확대 조각 <ol><li>상업을 사용 하 여 수행 PCR 키트 2 µ M 백본 oligonucleotides, 제조 업체에 따르면 &#39; s 지침.</li>
		<li>때에 PCR 반응 완료, PCR 제품에 직접 정지 구슬의 45 µ L을 추가 하 고 10 mM Tris HCl (pH 8)의 30 µ L로 차입 하 여 구슬에 바인딩된 증폭된 대상 DNA 파편을 풍요롭게.</li>
	</ol></li> <li>라이브러리 정량화 키트와 함께 DNA 파편을 계량 하 고 Bioanalyzer ( 그림 2)에 의해 평균 조각 길이 결정.</li></ol>
 4. 시퀀싱 <ol><li>시퀀스 다중화 18 h. 총 데이터 생산은 최대 60 기가바이트 75 bp 짝 끝에서 실행 되는 벤치탑 시퀀서를 사용 하 여 라이브러리, 15 G는 컨트롤 샘플 gDNA 환자 샘플 cfDNA 및 1 G에 대 한 필요.</li></ol>
 5. 데이터 분석 워크플로 참고: 그림 3 일반 작업 흐름 및 데이터 분석 프로세스를 표시 합니다. 데이터 분석 매개 변수 및 명령을 다음과 같습니다.
<ol><li>고품질 읽기를 필터링 하 고 오류 및 NCfilter를 사용 하 여 UID의 수정. 
	NCfilter(own) NCfilter 필터-l 5-q 0.5-0.1 n-T 3-G-1 fastq1-2 fastq2 realSeq(own) 파이썬 빈/realRealSeq MaskUID-1 fq1-2 fq2-o 출력 dir-p 접두사-u 4-s 7-m 3-i uidFile-f.</li>
	<li>참조 게놈 hg19 (인간 게놈 19), BWA (버전 0.7.12-r1039) 메모리를 사용 하 여 시퀀싱 결과 찾아서 게놈 분석 툴킷 (GATK) (버전 3.4-46-gbc02625)로 다시 맞춥니다. 
	bwa mem t-3 hg19 fastq1 fastq2 자바-d64-서버-XX: + UseParallelGC-XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g- Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar-T RealignerTargetCreator-R hg19-L targetRegion-dbsnp 알려진 &#8212; 
	allowPotentiallyMisencodedQuals-nt 10-난 cancerBam-난 normalBam 자바-d64-서버-XX: + UseParallelGC-XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g &#8212; Djava.io.tmpdir=/tmp/-병 GenomeAnalysisTK.jar-T IndelRealigner-R hg19-dbsnp 알려져 -allowPotentiallyMisencodedQuals &#8212; targetIntervals 간격-난 cancerBam-난 normalBam</li>
	<li>UID와 기지 PCR/시퀀싱에 의해 도입 된 기본 품질 수정 오류 해결 서식 파일 조각의 위치에 따라 중복 클러스터. 
	realSeq(own) 파이썬 realSeq/빈/realSeq 클러스터-b unmarkdup_sort_merge.bam-r chipRegion-o output_dir-p -m 6를 접두사</li> <li>다시 정렬 BWA mem.에 의해 클러스터 중복 
	bwa mem t-3 hg19 fastq1 fastq2</li> <li>GATK (버전 3.4-46-gbc02625)를 사용 하 여 기본 품질 평가 점수에의 한 재 다음 로컬 재배치 수행. 
	Loacal 재배치: 자바-d64-서버-XX: + UseParallelGC-XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-병 GenomeAnalysisTK.jar-T RealignerTargetCreator-R hg19-L targetRegion-알려진 dbsnp-allowPotentiallyMisencodedQuals-nt 10 -CancerBam-난 normalBam 자바-d64-서버-XX: + UseParallelGC-XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-병 GenomeAnalysisTK.jar-T IndelRealigner-R hg19-알려진 dbsnp-allowPotentiallyMisencodedQuals-targetIntervals 간격-난 cancerBam-난 normalBam 기본 품질 점수 재: 자바-d64-서버-XX: + UseParallelGC-XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-GenomeAnalysisTK.jar-T 병 BaseRecalibrator-R hg19-L targetRegion- knownSites dbsnp-knownSites 우주 allowPotentiallyMisencodedQuals-nct 10-나 bam-o grp 자바-d64-서버-XX: + UseParallelGC-XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-GenomeAnalysisTK.jar-T 자 PrintReads-난 bam-BQSR grp-o outbam-R hg19-nct 8-allowPotentiallyMisencodedQuals</li> <li>SNV (단일 뉴클레오티드 변형) 및 INDEL (작은 삽입 또는 삭제) 전화, 낮은 주파수 변이의 정확도 추가 확인 (좋은 지원 읽습니다) 발사 잔여물에 의해 둘 다 정방향 및 역방향 가닥 읽기 제어 그룹 (생식 돌연변이)와 초기 데이터베이스를 통해 여과 및 쌍. 
	realDcaller(own) 파이썬 realDcaller-f hg19-r chipRegion-C baselineDB-O L-2 cancerBam normalBam-p 30</li> <li>CNV (복사 번호 유사) 호출에 대 한 초기 샘플 컨트롤 사용. 
	NCcnv(own) 파이썬 NCcnv-o cnvdir-t tmpdir-r chipRegion cnv-normgt normalBam-tumgt cancerBam-repdb repeatMarsk</li> <li>Realigned 매핑되지 않은, 클립 및 SV (구조적 변화) 전화를 귀에 거슬리는 쌍 읽기. 
	NCsv(own) 파이썬 NCsv-t tmpdir-r hg19-o outputdir x-사본-w bwapath n-4 normalBam cancerBam</li></ol>

<ol>
	<li>Kennedy, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+ultralow-frequency+mutations+by+Duplex+Sequencing.">Detecting ultralow-frequency mutations by Duplex Sequencing.</a> Nat. Protoc. 9, 2586-2606 (2014).</li><li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+DNA+sequencing.">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+tumor+DNA+in+early-+and+late-stage+human+malignancies.">Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies.</a> Sci. Transl. Med. 6, (2014).</li><li>Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+clinical+utility+of+ultrasensitive+circulating+tumor+DNA+detection+with+CAPP-Seq.">Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq.</a> Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).</li><li>Diaz, L. A., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsies:+genotyping+circulating+tumor+DNA.">Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA.</a> J. Clin. Oncol. 32, 579-586 (2014).</li><li>Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy:+monitoring+cancer-genetics+in+the+blood.">Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. 10, 472-484 (2013).</li><li>Su, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+platform+for+rapid+detection+of+multiple+oncogenic+mutations+with+relevance+to+targeted+therapy+in+non-small-cell+lung+cancer.">A platform for rapid detection of multiple oncogenic mutations with relevance to targeted therapy in non-small-cell lung cancer.</a> J. Mol. Diagn. 13, 74-84 (2011).</li><li>Kukita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fidelity+target+sequencing+of+individual+molecules+identified+using+barcode+sequences:+de+novo+detection+and+absolute+quantitation+of+mutations+in+plasma+cell-free+DNA+from+cancer+patients.">High-fidelity target sequencing of individual molecules identified using barcode sequences: de novo detection and absolute quantitation of mutations in plasma cell-free DNA from cancer patients.</a> DNA Res. 22, 269-277 (2015).</li><li>Schmitt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+small+genomic+targets+with+high+efficiency+and+extreme+accuracy.">Sequencing small genomic targets with high efficiency and extreme accuracy.</a> Nat. Methods. 12, 423-425 (2015).</li><li>Schmitt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+ultra-rare+mutations+by+next-generation+sequencing.">Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 14508-14513 (2012).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+method+for+quantitating+circulating+tumor+DNA+with+broad+patient+coverage.">An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage.</a> Nat. Med. 20, 548-554 (2014).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+digital+error+suppression+for+improved+detection+of+circulating+tumor+DNA.">Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA.</a> Nat Biotechnol. 34 (5), 547-555 (2016).</li><li>Alix-Panabie&#768;res, C., Schwarzenbach, H., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+and+circulating+tumor+DNA.">Circulating tumor cells and circulating tumor DNA.</a> Annu. Rev. Med. 63, 199-215 (2012).</li><li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer.">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> N. Engl. J. Med. 368, 1199-1209 (2013).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+short-read+alignment+with+Burrows-+Wheeler+transform.">Fast and accurate short-read alignment with Burrows- Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li><li>Youn, A., Simon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+cancer+driver+genes+in+tumor+genome+sequencing+studies.">Identifying cancer driver genes in tumor genome sequencing studies.</a> Bioinformatics. 27, 175-181 (2011).</li><li>Forshew, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+identification+and+monitoring+of+cancer+mutations+by+targeted+deep+sequencing+of+plasma+DNA.">Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li><li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+mutation+and+resistance+of+non-small-cell+lung+cancer+to+gefitinib.">EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib.</a> N. Engl. J. Med. 352, 786-792 (2005).</li><li>Kuang, Y., Rogers, A., Yeap, Y., Wang, L., Makrigiorgos, M., Vetrand, K., Thiede, S., Distel, R. J., Ja&#776;nne, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+detection+of+EGFR+T790M+in+gefitinib+or+erlotinib+resistant+non-small+cell+lung+cancer.">Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer.</a> Clin. Cancer Res. 15, 2630-2636 (2009).</li><li>Taniguchi, K., Uchida, J., Nishino, K., Kumagai, T., Okuyama, T., Okami, J., Higashiyama, M., Kodama, K., Imamura, F., Kato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+of+EGFR+mutations+in+circulating+tumor+DNA+derived+from+lung+adenocarcinomas.">Quantitative detection of EGFR mutations in circulating tumor DNA derived from lung adenocarcinomas.</a> Clin. Cancer Res. 17, 7808-7815 (2011).</li><li>Leary, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+personalized+tumor+biomarkers+using+massively+parallel+sequencing.">Development of personalized tumor biomarkers using massively parallel sequencing.</a> Sci. Transl. Med. 2, (2010).</li><li>Forshew, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+identification+and+monitoring+of+cancer+mutations+by+targeted+deep+sequencing+of+plasma+DNA.">Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li><li>Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+clinical+utility+of+ultrasensitive+circulating+tumor+DNA+detection+with+CAPP-Seq.">Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq.</a> Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).</li></ol>

저자는 공개 없다.

그러나 순환 종양 DNA (ctDNA)의 존재는 ctDNA 분석의 응용 프로그램은 여전히 하지 일상적인 임상 연습에 30 여 년 전, 발견 되었다. CtDNA 검출 및 분석을 위한 기술 개발의 ctDNA 방법의 실용적인 응용 프로그램에 대 한 관심 증가 했다. 미세한 잔여 질병, 치료, 그리고 종양 진화와 intratumoral이13의 배경 아래 종양 분자 프로 파일에 대 한 응답의 평가 대 한 최소한-침략 적 접근을 제?...

차세대 시퀀싱 (NGS), 강력한 도구, 게놈의 신비를 조사 하는 유전 변경을 드러낼 수 있는 정보의 대량을 제공할 수 있습니다. 병원에서 NGS 분석의 응용 프로그램은 특히 맞춤된 의학에 대 한 더 일반적인 되고있다. 그러나 NGS의 가장 큰 한계 중 하나는, 높은 오류 비율입니다. 공부 상속 된 돌연변이 적합 하다, 비록 드문 돌연변이의 분석은 크게 제한1,2, 특히 "" 액체 생 검에서 얻은 DNA를 분석.
종양을 순환 DNA (ctDNA) 종양 세포에서 헛간 혈액 세포 무료 DNA (cfDNA) 이다. 대부분의 경우, ctDNA의 수량에서는 매우 낮은 하 게 하는 그것의 탐지 및 분석 매우 도전입니다. 그러나, ctDNA는 많은 매력적인 기능: 그것의 고립은 최소한 침략 적, 종양 성장의 초기 단계에서 검출 될 수 있다, 치료 효율성을 반영 하는 ctDNA 수준 및 ctDNA 기본 및 전이성 병 변에서 발견 DNA 변이 포함 3 , 4 , 5. 따라서, NGS 기술과 분석의 급속 한 발전을 감안할 때, ctDNA 검출 응용 되고있다 더 매력적.
다른 대규모 병렬 시퀀싱 방법 ctDNA 탐지를 위해 이용 되었습니다 있지만 이러한 방법 중 누구도 클리닉 그들의 제한 때문에 일상적인 사용 하기 위해 허용: 낮은 감도, 다양성의 부족 및 상대적으로 높은 비용6 ,,78. 예를 들어 이중 시퀀싱, 고유 식별자 (UID), 태그에 따라 반복적으로 대부분의 시퀀싱 오류 조정 합의 양방향으로에서 오류를 수정 합니다. 그러나,이 방법의 타당성은 그것의 높은 비용 및 낮은 데이터 활용9,10손실. 마찬가지로, CAPP-Seq 및 그것의 향상 된 반복, CAPP IDE11,12에 있는 큰 실용성 cfDNA 탐지 정확성과 이러한 방법의 개선이 필요 하지만.
정확한 ctDNA 탐지 및 분석에 대 한 현재 필요를 충족 시키기 위해 우리는 풍요롭게 드문 돌연변이 시퀀싱 (ER-Seq)는 새로운 전략을 개발 했다. 이 방법은 다음 결합: ctDNA 분자, 양방향 오류 수정와 중 단일 변이 구별 하는 기능을 효율적으로 복구 하 고유 시퀀싱 어댑터 &#62; 1 × 107 야생-타입 뉴클레오티드; 1021 kb 프로브 커버 대상 영역의 측정의 질을 높일 12 종양, 폐암, 대 장 암, 위 암, 유방암, 신장 암, 췌장암, 간 암, 갑 상선 암 등 종양 관련 돌연변이의 95% 자 궁 경부 암, 식도 암 및 자궁내 막 암 (표 1). 그리고 초기 데이터베이스 심사 하기가 효율적이 고 정확 하 게 ctDNA에 드문 돌연변이 검출 하기 쉽다.
초기 데이터베이스를 구축, 샘플 (처음 ~ 1000)의 같은 종류의 숫자에서 응급실-Seq에 의해 모든 유전자 돌연변이 찾아. 이 진짜 돌연변이 다른 여러 신뢰할 수 있는 검출 방법 및 분석 하 여 확인 해야 합니다. 다음, 거짓 변이의 패턴을 요약 하 고 초기 기준선 데이터베이스 구축 모든 거짓 돌연변이 클러스터. 계속이 데이터베이스에 후속 시퀀싱 실험에서 발견 하는 거짓 변이 추가 합니다. 따라서,이 기준선 데이터베이스 동적 확장된 데이터베이스, 시퀀싱 정확도 크게 향상 됩니다.
진행을 촉진 하 종양 진단 및 모니터링에서 우리는 응급실-Seq, 유니버설 데이터의 수집에 대 한 저비용이 고 실현 가능한 방법 제시. 우리 병원에서 희귀 한 돌연변이 및 사용에 대 한 타당성을 탐지 하기 위한 그것의 정확도 보여주는 수술 응급실-Seq 분석, 사례 연구를 제시.

<table><tbody><tr><td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51105</td><td>DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA</td></tr><tr><td>Quant-iT dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>Measure cfDNA concentration</td></tr><tr><td>Quant-iT dsDNA BR Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32853</td><td>Measure library concentration</td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 Reagents</td><td>Agilent</td><td>5067-1504</td><td>Measure cfDNA and library fragments</td></tr><tr><td>The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina</td><td>NEB</td><td>E7645L</td><td>Library Preparation</td></tr><tr><td>Agencourt SPRIselect Reagent</td><td>Beckman</td><td>B23317</td><td>DNA fragment screening and purification</td></tr><tr><td>Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML</td><td>Sigma</td><td>93283</td><td>Dissolution</td></tr><tr><td>xGen Lockdown Probes</td><td>IDT</td><td>&amp;mdash;&amp;mdash;</td><td>xGen Custom Probe</td></tr><tr><td>Human Cot-1 DNA</td><td>Life</td><td>15279-011</td><td>Targeted DNA capture</td></tr><tr><td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td><td>Life</td><td>65305</td><td>Targeted DNA capture</td></tr><tr><td>xGen Lockdown Reagents</td><td>IDT</td><td>1072281</td><td>Targeted DNA capture</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>KAPA</td><td>KK2602</td><td>post-capture PCR enrichment libraries</td></tr><tr><td>KAPA Library Quantification Kit</td><td>KAPA</td><td>KK4602</td><td>Measure library concentration</td></tr><tr><td>NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles)</td><td>illumina</td><td>FC-404-2002</td><td>Sequence</td></tr><tr><td>Centrifuge5810</td><td>eppendorf</td><td>5810</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop8000</td><td>Thermo Scientific</td><td>8000</td><td>Measure gDNA concentration</td></tr><tr><td>Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Quantify</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>eppendorf</td><td></td><td>Incubation</td></tr><tr><td>16-tube DynaMagTM-2 Magnet</td><td>Life</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Concentrator plus</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>AB</td><td>simplyamp</td><td></td></tr><tr><td>QPCR</td><td>AB</td><td>7500Dx</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500</td><td>illumina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detection of rare mutations in ctdna using next generation sequencing

차세대 시퀀싱 (NGS)를 사용 하 여 종양 DNA (ctDNA) 순환의 분석 임상 종양학의 개발을 위한 유용한 도구가 되고있다. 그러나,이 방법의 응용 프로그램 때문에 혈액에 있는 ctDNA의 양을 추적 분석에서 낮은 감도 도전 이다. 또한, 메서드는이 시퀀싱 및 이후 분석에서 거짓 긍정 및 부정적인 결과 생성할 수 있습니다. 타당성과 병원에서 ctDNA 검색의 신뢰성을 개선 하기 위해, 여기 선물이 시퀀싱, 풍요롭게 드문 돌연변이 시퀀싱 (ER-Seq) 드문 돌연변이 풍요롭게 하는 기술. ER-Seq 유망한 도구 매우 낮은 주파수 유전 변경 감지를 하 게 하 고 따라서 질병 heterogenicity 공부에 매우 도움이 될 것입니다 1 x 107 야생-타입 뉴클레오티드에서 단일 돌연변이 구분할 수 있습니다. 고유한 시퀀싱 어댑터의 결 찰, 덕이 메서드 동안 오류 양방향으로 (감각과 antisense)에 대 한 동일한 시간 수정에 ctDNA 분자의 효율적인 복구를 수 있습니다. 덮어 대상 영역의 측정을 풍요롭게 하는 우리의 다양 한 1021 kb 프로브 12 종양에서 종양 관련 드라이버 돌연변이의 95%. 비용 효율적이 고 보편적인 방법이 유전자 데이터의 유일 하 게 성공적인 축적 수 있습니다. 효율적으로 배경 오류 필터링, 후 응급실-seq 정확 하 게 희귀 변이 검색할 수 있습니다. 사례 연구를 사용 하 여, 상세한 프로토콜 프로브 디자인, 도서관 건설, 대상 DNA 캡처 방법론, 데이터 분석 워크플로 포함 하는 동안에 시연 선물이. 일반적으로이 메서드를 수행 하는 과정 1-2 일 소요 됩니다.

ER-Seq에 사용 되는 풍부한 대상 지역 표 1에 나와 있습니다 1021 kb 프로브는 커버 12 일반적인 종양의 유전자 돌연변이의 95% 이상. 이러한 프로브의 광범위 암 환자의 대다수에 적용이 프로세스를 만든다. 또한, 우리의 독특한 시퀀싱 어댑터 및 기준선 데이터베이스 검사 가능 하 게 그것은 드문 돌연변이 정확 하 게 감지 하.
<p class="jove_content" fo:k...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing at JoVE.com

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

이 원고 ctDNA, 응급실이에서 낮은 주파수의 돌연변이 검출 하는 기술을 설명 합니다. 이 메서드는 두 방향 오류 수정, 특별 한 배경 필터 및 효율적인 분자 신안의 독특한 사용에 의해 분화 된다.

다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 CtDNA에서 희소 한 변이의 탐지

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

detection-of-rare-mutations-in-ctdna-using-next-generation-sequencing

Research

JoVE Journal

Cancer Research

16.7K 조회수.  Geneplus-Beijing Institute. 이 원고 ctDNA, 응급실이에서 낮은 주파수의 돌연변이 검출 하는 기술을 설명 합니다. 이 메서드는 두 방향 오류 수정, 특별 한 배경 필터 및 효율적인 분자 신안의 독특한 사용에 의해 분화 된다.

비디오: Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific molecular profiles of a tumor may predict responsiveness to therapeutic agents or provide knowledge about prognosis. At our institution a tumor genotyping program was established as part of routine clinical care, screening both hematologic and solid tumors for a wide spectrum of mutations using two next-generation sequencing (NGS) panels: a custom, 33 gene hematological malignancies panel for use with peripheral blood and bone marrow, and a commercially produced solid tumor panel for use with formalin-fixed paraffin-embedded tissue that targets 47 genes commonly mutated in cancer. Our workflow includes a pathologist review of the biopsy to ensure there is adequate amount of tumor for the assay followed by customized DNA extraction is performed on the specimen. Quality control of the specimen includes steps for quantity, quality and integrity and only after the extracted DNA passes these metrics an amplicon library is generated and sequenced. The resulting data is analyzed through an in-house bioinformatics pipeline and the variants are reviewed and interpreted for pathogenicity. Here we provide a snapshot of the utility of each panel using two clinical cases to provide insight into how a well-designed NGS workflow can contribute to optimizing clinical outcomes.

This manuscript describes clinical protocols for two next-generation sequencing panels. One panel interrogates hematologic malignancies while the other panel targets genes commonly mutated in solid tumors. Molecular classification of driver mutations in human malignancies offers valuable prognostic and predictive information.

고체 및 액체 종양에서 실행 가능한 돌연변이의 검출을위한 차세대 시퀀싱

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

연구

암 연구학

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging resistance mutations during therapy, or when patients have few circulating tumor cells. Wild-type blocking PCR followed by sequencing analysis offers high sensitivity, flexibility, and simplicity as a methodology for detecting these low frequency mutations. By adding a custom designed locked nucleic acid oligonucleotide to a new or previously established conventional PCR based sequencing assay, sensitivities of approximately 1 mutant allele in a background of 1,000 WT alleles can be achieved (1:1,000). Sequencing artifacts associated with deamination events commonly found in formalin fixed paraffin embedded tissues can be partially remedied by the use of uracil DNA glycosylase during extraction steps. The optimized protocol here is specific for detecting MYD88 mutation, but can serve as a template to design any WTB-PCR assay. Advantages of the WTB-PCR assay over other commonly utilized assays for the detection of low frequency mutations including allele specific PCR and real-time quantitative PCR include fewer occurrences of false positives, greater flexibility and ease of implementation, and the ability to detect both known and unknown mutations.

Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

와일드 형은 PCR은 낮은 주파수 체세포 돌연변이의 검출을위한 고감도 방법으로 직접 시퀀싱과 결합 블로킹

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

유전학

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently developed method uses a medical wire functionalized with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies for in vivo isolation of circulating tumor cells (CTCs)1. A patient-matched cohort in non-metastatic prostate cancer showed that the in vivo isolation technique resulted in a higher percentage of patients positive for CTCs as well as higher CTC counts as compared to the current gold standard in CTC enumeration. As cells cannot be recovered from current medical devices, a new functionalized wire (referred to as Device) was manufactured allowing capture and subsequent detachment of cells by enzymatic treatment. Cells are allowed to attach to the Device, visualized on a microscope and detached using enzymatic treatment. Recovered cells are cytocentrifuged onto membrane-coated slides and harvested individually by means of laser microdissection or micromanipulation. Single-cell samples are then subjected to single-cell whole genome amplification allowing multiple downstream analysis including screening and target-specific approaches. The procedure of isolation and recovery yields high quality DNA from single cells and does not impair subsequent whole genome amplification (WGA). A single cell&#39;s amplified DNA can be forwarded to screening and/or targeted analysis such as array comparative genome hybridization (array-CGH) or sequencing. The device allows ex vivo isolation from artificial rare cell samples (i.e. 500 target cells spiked into 5 mL of peripheral blood). Whereas detachment rates of cells are acceptable (50 - 90%), the recovery rate of detached cells onto slides spans a wide range dependent on the cell line used (&#60;10 - &#62;50%) and needs some further attention. This device is not cleared for the use in patients.

This protocol is to recover and prepare rare target cells from a mixture with non-target background cells for molecular genetic characterization at the single-cell level. DNA quality is equal to non-treated single cells and allows for single-cell application (both screening based and targeted analysis).

단일 셀 다운스트림 특성화에 대 한 대상 셀 사전 농축 및 전체 게놈 증폭

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. In the clinical setting, formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues are widely used for genetic testing. However, FFPE DNA is generally damaged and fragmented during the fixation process with formalin. Therefore, FFPE DNA is sometimes not adequate for genetic testing because of low quality and quantity of DNA. Here we present a method of touch imprint cytology (TIC) to obtain genomic DNA from cancer cells, which can be observed under a microscope. Cell morphology and cancer cell numbers can be evaluated using TIC specimens. Furthermore, the extraction of genomic DNA from TIC samples can be completed within two days. The total amount and quality of TIC DNA obtained using this method was higher than that of FFPE DNA. This rapid and simple method allows researchers to obtain high-quality DNA for genetic testing (e.g., next generation sequencing analysis, digital PCR, and quantitative real time PCR) and to shorten the turnaround time for reporting results.

Obtaining high-quality genomic DNA from tumor tissues is an essential first step for analyzing genetic alterations using next generation sequencing. In this article, we present a simple and rapid method to enrich tumor cells and obtain intact DNA from touch imprint cytology specimens.

터치 인쇄물 세포학을 사용 하 여 병 적인 임상 표본에서 높은-품질 종양 DNA를 간단 하 고 빠른 방법

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

드문 이벤트 감지 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱을 사용 하 여

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis as well as for the treatment selection and its response in cancer patients. The current gold standard method for detecting tumor mutations involves a genetic test of tumor DNA by means of tumor biopsies. However, this invasive method is difficult to be performed repeatedly as a follow-up test of the tumor mutational repertoire. Liquid biopsy is a new and emerging technique for detecting tumor mutations as an easy-to-use and non-invasive biopsy approach.
Cancer cells multiply rapidly. In parallel, numerous cancer cells undergo apoptosis. Debris from these cells are released into a patient&#8217;s circulatory system, together with finely fragmented DNA pieces, called cell-free DNA (cfDNA) fragments, which carry tumor DNA mutations. Therefore, for identifying cfDNA based biomarkers using liquid biopsy technique, blood samples are collected from the cancer patients, followed by the separation of plasma and buffy coat. Next, plasma is processed for the isolation of cfDNA, and the respective buffy coat is processed for the isolation of a patient&#39;s genomic DNA. Both nucleic acid samples are then checked for their quantity and quality; and analyzed for mutations using next-generation sequencing (NGS) techniques.
In this manuscript, we present a detailed protocol for liquid biopsy, including blood collection, plasma, and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

In this paper we present a detailed protocol for non-invasive liquid biopsy technique, including blood collection, plasma and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

암 환자의 혈장 샘플에서 세포없는 DNA 의 검출

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using bioinformatics pipelines (&#34;dry bench&#34;). Both elements are essential to produce accurate and reliable results, which are particularly critical for clinical laboratories. Targeted NGS technologies have increasingly found favor in oncology applications to help advance precision medicine objectives, yet the methods often involve disconnected and variable wet and dry bench workflows and uncoordinated reagent sets. In this report, we describe a method for sequencing challenging cancer specimens with a 21-gene panel as an example of a comprehensive targeted NGS system. The system integrates functional DNA quantification and qualification, single-tube multiplexed PCR enrichment, and library purification and normalization using analytically-verified, single-source reagents with a standalone bioinformatics suite. As a result, accurate variant calls from low-quality and low-quantity formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) and fine-needle aspiration (FNA) tumor biopsies can be achieved. The method can routinely assess cancer-associated variants from an input of 400 amplifiable DNA copies, and is modular in design to accommodate new gene content. Two different types of analytically-defined controls provide quality assurance and help safeguard call accuracy with clinically-relevant samples. A flexible &#34;tag&#34; PCR step embeds platform-specific adaptors and index codes to allow sample barcoding and compatibility with common benchtop NGS instruments. Importantly, the protocol is streamlined and can produce 24 sequence-ready libraries in a single day. Finally, the approach links wet and dry bench processes by incorporating pre-analytical sample quality control results directly into the variant calling algorithms to improve mutation detection accuracy and differentiate false-negative and indeterminate calls. This targeted NGS method uses advances in both wetware and software to achieve high-depth, multiplexed sequencing and sensitive analysis of heterogeneous cancer samples for diagnostic applications.

An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.

낮은 품질과 낮은 수량 종양 생검의 습식 및 건식 벤치 프로세스의 통합을 대상으로 최적화하여 차세대 시퀀싱

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using ...

의학

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Efforts to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The establishment of high-throughput, massively parallel "next-generation" sequencing has aided the discovery of many such mutations. To enhance the clinical and translational utility of this technology, platforms must be high-throughput, cost-effective, and compatible with formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue samples that may yield small amounts of degraded or damaged DNA. Here, we describe the preparation of barcoded and multiplexed DNA libraries followed by hybridization-based capture of targeted exons for the detection of cancer-associated mutations in fresh frozen and FFPE tumors by massively parallel sequencing. This method enables the identification of sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving all targeted genes. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus conferring high sensitivity for detecting low frequency mutations.

We describe the preparation of barcoded DNA libraries and subsequent hybridization-based exon capture for detection of key cancer-associated mutations in clinical tumor specimens by massively parallel "next generation" sequencing. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus yielding high sensitivity for detecting low frequency mutations.

엑손 캡처 및 대규모 병렬 염기 서열 종양 검체에서 체세포 유전 변경을 검출

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

생물학

Droplet Digital Polymerase Chain Reaction: A Method to Generate Nanodroplet PCR Reactions for Detecting Rare Tumor Mutations

Source: Bonner, E. R. et al. <a href="https://www.jove.com/video/59721" target="_blank">Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids.</a> J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we present a step-by-step procedure to generate emulsified nano-droplets to detect target nucleic acids by digital polymerase chain reaction or dPCR.

액적 디지털 중합효소 연쇄 반응: 희귀 종양 돌연변이 검출을 위한 나노액적 PCR 반응을 생성하는 방법

Source: Bonner, E. R. et al. Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids. J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we ...