에미르 이슬라모비치 박사에게 실험실과 온실 지원을 해주셔서 감사드립니다. 셰리 플린트-가르시아 박사에게 도주해 주신 것에 대해서도 감사드립니다.

1. 식물 재료의 성장
<ol><li>접종 및 스크리닝을 위해 식물 라인을 선택합니다. 2개의 옥수수 라인, 5개의 테오신테 라인, 그리고 미국 maydis에 대한 특징성이 없는 40개의 옥수수 x 테오신테 라인이 이 작품(표1)에사용되었다.</li>
	<li>실험용 식물종자(U. maydis 주입) 및 제어(물 주입) 바늘 주입 접종 실험. 각 플랜트 라인에 대해 이 작업을 수행합니다.</li>
	<li>작은 평지에 각 식물 라인에 대해 4 개의 씨앗 (복제)을 심고 손가락으로 토양으로 약 1/2 인치 씨앗을 밀어 토양으로 가볍게 덮음으로써(그림 1A 및 1B). 씨앗 위에 토양을 포장하지 마십시오. 씨앗을 심거나 씨앗 위에 토양을 포장하면 모종 출현에 문제가 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>씨앗을 토양에 물을 넣습니다. 토양에 흠뻑 젖고 씨앗이 물을 뿌은 후 토양 아래에 남아 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>물을 마신 후, 수중 및 야간 환경이 28/20°C, 광기간 의 14/10 시간, 각각 500 μmol/m2 초   광합성 활성 방사선이 캐노피의 상단에 있는 성장 챔버에 놓는다. 낮과 밤의 상대 습도를 각각 약 70%와 90%로 유지합니다.</li>
	<li>실험 전반에 걸쳐 일치하는 성장 환경을 유지하기 위해 동일한 성장 챔버에 모든 식물을 유지합니다.</li>
	<li>10일 후, 식물을 성장 챔버로부터 제거하고 바늘 주입 접종 방법을 사용하여 U. maydis 세포 현탁액 배양으로 식물을 접종한다. 참고 : 옥수수 식물은8-10을심은 후 7 일 동안 접종 할 수 있습니다. 그러나, 테오신테 식물은 7 일 후에 너무 작습니다. 따라서, 실험 내의 일관성을 위해 심기 후 10일 후에 옥수수와 테오신테 식물을 접종한다(2.12단계 참조).</li>
</ol>2. 바늘 주입 접종
<ol><li>라미나르 플로우 후드에서 모든 작업을 수행합니다. 냉동고 보관에서 미국 수지니스 글리세롤 주식을 제거하십시오. 미국 마디스 야생형 균주 1/2(짝짓기 형 a1b1) 및 2/9(짝짓기 형 a2b2, 동종 에 가까운 1/2) 감자 덱스트로스 한천(PDA) 플레이트에 멸균 루프 및 줄무늬 글리세롤 스톡을 사용한다. 균주를 별도로 유지합니다.</li>
	<li>PDA 플레이트를 30°C 인큐베이터에 2일 동안 배치합니다. 다른 생영양 병원균을 사용하는 경우 적절한 변형, 미디어 및 성장 조건을 사용합니다. 미국 의 수지 변형이 잘 성장하고 있는지 확인하기 위해 이틀 동안 병원균의 성장을 모니터링합니다. </li>
	<li>2일 후에 인큐베이터에서 PDA 플레이트를 제거합니다. 플레이트는 좋은 병원균 성장을 가져야하며 단일 식민지(그림 2A)를포함해야합니다. 단일 식민지를 얻는 것이 중요합니다. 단일 식민지가 존재하지 않는 경우 낮은 농도에서 플레이트를 다시 행진.</li>
	<li>라미나르 플로우 후드로 모든 작업을 수행합니다. 멸균 이쑤시개를 사용하여 PDA 플레이트의 각 변형에 대해 단일 콜로니를 선택합니다. 단일 콜로니가 들어 있는 이쑤시개를 감자 덱스트로스 국물(PDB)에 넣습니다. 2-3 문화가 있는 것이 좋습니다.</li>
	<li>3ml PDB 배양을 30°C 인큐베이터/셰이커에 200rpm에 2일간 놓습니다. 문화의 성장을 보장하기 위해 이틀 동안 문화의 성장을 모니터링할 수 있습니다. 문화는 매우 흐린 나타납니다.</li>
	<li>인큐베이터/셰이커로부터 액체 배양을 제거하고 OD600의 농도를 측정하여 세포가 1.0(~1 x 107 셀/ml)의 OD로 성장되었는지확인한다.</li>
	<li>최종 30ml 배양량에 물을 사용하여 1 x 106 셀/ml의 최종 농도로 U. maydis 세포 현탁액 배양을 가져옵니다. 이러한 농도는 병원균 세포 현탁액 배양을 가진 식물의 좋은 감염을 일관되게 초래한다. 17
</li>
</ol>참고: 다양한 세포 현탁액 농도는접종18,19에필요한 적절한 세포 티터를 결정하기 위해 상이한 병원균 균주를 사용할 때 테스트되어야 한다. 세포 현탁액 배양에 대한 주어진 최종 농도는 소급을 위한 출발점으로 사용될 수 있다. 병원체 세포 현탁액 배양의 적절한 농도는 좋은감염(그림 3A-E)으로식물 표현형을 시각화하여 검증되어야 한다.
<ol start="8"><li>접종 전에 두 개의 U. maydis 균주의 동일한 볼륨을 혼합합니다. 하나의 병원균균을 사용하는 경우 2.9단계로 진행한다. 각 접종 실험에 대한 신선한 U. maydis 세포 현탁액 배양을 준비하고 2 일 후에 세포 현탁액 배양을 폐기하십시오.</li>
	<li>실험용 바늘 주입 접종의 경우, 세포 현탁액 배양을 주사기로 끌어서 U. maydis 세포 현탁액 배양으로 3ml 주사기를 채우는 다.</li>
	<li>대조군 바늘 주입 접종의 경우, 물17로3ml 주사기를 채우는 다. 실험용 바늘 주입 접종에 동일한 절차를 사용하십시오.</li>
	<li>각 3ml 주사기의 끝에 0.457 mm x 1.3cm 피하 바늘을 부착합니다. 선택된 바늘 크기는 식물 조직에 최소한의 손상으로 식물 잎 사이에 세포 현탁액 배양을 전달할 것이다.</li>
	<li>바늘 주입접종(도 2B)에대비하여 심기 10일 후에 성장 챔버로부터 실험 및 제어 식물을 제거한다(1.7단계 참조).</li>
	<li>미국 메이디스 세포 현탁액 배양을 함유한 피하 주사바늘을 토양 선 바로 위에 90° 각도로 실험 식물의 줄기에 조심스럽게 삽입한다. 바늘이 줄기 한가운데에 들어야 삽입합니다. 줄기(도 2C)를통해 바늘을 밀어붙이지 마십시오.</li>
	<li>미국 의 약 100 μl을 가진 실험 식물을 주입하여 세포 현탁액 배양18,19. 이것은 모종의 높이에 따라 약간 달라집니다. 세포 현탁액 배양은 줄기를 통해 밀어 식물의 소용돌이로 이동합니다. 세포 현탁액 배양은 식물의 소용돌이에서 볼 수 있습니다. 3ml 주사기가 비어 질 때까지 각 개별 식물에 세포 현탁액 배양 100 μl을 계속 주입하십시오.</li>
	<li>주입 후 식물 줄기에서 바늘을 조심스럽게 제거하십시오. 지금 빈 3ml 주사기에서 바늘을 제거하고 물로 채웁니다. 바늘을 주사기에 다시 부착하고 바늘을 통해 물을 밀어 바늘 끝에 잡힐 수있는 식물 조직을 제거합니다.</li>
	<li>각 실험 플랜트에 대해 2.9-2.15단계를 반복합니다. 물을 주입하여 제어 식물에 대한 동일한 프로토콜을 따르십시오.</li>
	<li>접종된 실험 및 제어 식물을 다시 성장 챔버에 넣습니다. 식물 조직이 아닌 토양을 적시어 식물에 매일 물을.</li>
	<li>병원균 발달 및 식물 내성 반응을 감지하기 위해 매일 식물을 확인하십시오.</li>
</ol>3. 저항 반응 스크리닝
<ol><li>각 식물에 대한 저항 반응을 점수 및 기록 7, 10, 14, 및 21 일 사후 접종 (dpi) 1 5 저항 반응 등급 척도를 사용하여. 등급 척도의 수치 값이 증가함에 따라 질병 심각도가 증가합니다(표2). 1C(잎 클로로시스), 1A(잎 안토시아닌 생성) 또는 2(작은 잎 담즙) 저항 반응이 저항을 나타낸다. 3(줄기담), 4(기초담즙), 또는 5(식물사멸) 저항반응은 감수성을나타낸다(그림 3A-E 및 표 2)18,19.</li>
	<li>실험 및 제어 식물과 기록 저항 반응 등급을 모두 점수.</li>
	<li>실험 및 제어 식물의 저항 반응을 비교합니다. 1C, 1A 또는 2 저항 반응 등급을 가진 실험 식물을 선택합니다. 이 식물은 미국 maydis18,19에저항하는 것으로 간주됩니다.</li>
	<li>전체 실험을 반복하여 식물 표현형을 확인합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Smith, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crop+fungal+resistance+developed+using+genetic+engineering+and+antifungal+proteins+from+viruses.">Crop fungal resistance developed using genetic engineering and antifungal proteins from viruses.</a> , (2011).</li><li>Sher, A. F., MacNab, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vegetable diseases and their control. , 223-226 (1986).</li><li>Crepet, W. L., Feldman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+earliest+remains+of+grasses+in+the+fossil+record.">The earliest remains of grasses in the fossil record.</a> Am. J. Bot. 78, 1010-1014 (1991).</li><li>Iltis, H. H., Scoderstrom, T. R., Hilu, K. W., Campbell, C. 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본 연구에서는 700개의 옥수수와 테오신테 식물의 줄기로 미국 의 균주를 전달하는 데 사용되는 바늘 주입 접종 방법이 성공적이었다. 또한, 개정된 질병 저항 등급 척도는 식물을 선별하고 병원체 발달을 검출하기 위해 사용되었다. 두 가지 방법을 모두 사용한 결과, 미국 메이디에 저항하는 식물 라인은 700개의 옥수수와 테오신테 식물 중 에서 확인되었으며, 이는 이제 질병 내성을 ...

식물의 곰팡이 질병은 농업에 가장 저명한 위협 중 하나입니다. 세계 인구의 식량 수요로 인해 질병 저항이 개선된 작물을 개발할 필요성이 증가하고 있습니다. 식물 병원체는 작물 수확량6에부정적인 영향을 미치는 질병을 일으키는 현장에서 작물 식물을 자연적으로 감염시킵니다. 저항하는 식물을 식별하고 활용하면 저항을 개선하고 수율 손실을 줄일 수 있는 것으로 나타났습니다. 내성 품종은 옥수수, 밀, 쌀, 사탕수수를 포함한 많은 식물 종에서 식물 병원균으로 식물을 접종하고 저항하는 라인7을선택하여 확인되었습니다. 따라서 효율적인 접종 방법의 개발 및 사용은 많은 식물을 접종하고 저항을 위해 선별 할 수 있게 합니다. 딥 접종, 병원체 현탁액 배양배의 배관, 바늘 주입 접종8-11등 다양한 접종 방법이 사용되고 있다. 각 방법을 통해 병원균이 식물성 잎 사이에 안정적으로 도입되어야 하며 병원균의 형성을 통해 식물성전환증을 통해 식물성전환기(12,13)를보장해야 한다.
딥 접종 방법은 식물 묘목 을 병원체 현탁액 배양으로 잠급하는 것을 포함하며, 파이펫팅 방법은 병원균 세포 현탁액 배양을 식물 묘목의 소용돌이에 배치해야합니다. 그러나 두 가지 방법에 문제가 있습니다. 첫째, 두 가지 방법은 잎 표면에서 매우 가변적인 식물 조직으로 병원균의 자연적인 움직임에 의존한다. 대부분의 병원균은 식물 잎 표면에 장토 마개 또는 상처를 통해 자연적으로 식물에 들어갑니다. 그러나, 잎 표면에 스토마타 및/또는 상처를 통해 식물 잎 표면을 관통하는 병원체 기능에 상당한 가변성이 있다. 따라서 병원균 침투는 잠재적으로 일관되지 않은 데이터를 초래할 수 있는 접종 방법으로 제어할 수 없습니다. 둘째, 많은 수의 식물을 선별할 때, 묘목을 병원체 현탁액 배양으로 침수하는 것은 시간이 많이 소요될 수 있으며, 스크리닝될 수 있는 식물의 수를 제한할 수 있다. 반대로, 본 원에 기재된 바늘 주입 접종 프로토콜은아프레소리아(14)의형성을 용이하게 하는 식물 잎 사이에 병원체 현탁액 배양을 전달한다. 병원체는 병원체 침투 문제를 제거하는 식물에 들어가기 위해 새로 개발 된 appressoria를 활용합니다. 또한, 바늘 주입 접종 프로토콜은 미국 신체 상해와 접종 된 옥수수와 테오신테 식물에 대한 표현형의 범위를 제공하고 좋은 감염을 입증한다. 표현형은 병원체 현탁액 배양에 가장 적합한 농도를 결정하기 위해 마커로서 사용될 수 있으며, 이는 상이한 실험 내부와 그 사이에 일관된 식물 표현형을 초래한다.
병원균 세포 현탁액 배양으로 식물 접종에 이어 식물은 전형적으로 내성 또는 취약한 표현형8-11,15를검출하기 위해 선별된다. 질병 등급 척도가 식물 표현형을 선별하고 분류하기 위해 광범위하게 사용되고 있지만, 분석중인 병원체에 따라 등급 척도가 다릅니다. 따라서, 미국 메이디및 옥수수 상호작용에 대한 질병 등급 척도 프로토콜 확립은 유사한 곰팡이 병원균(16)에 활용될 수 있다.
현재 일련의 프로토콜은 옥수수, 테오신테 및 옥수수 x 테오신테 내성 라인의 미국 증시 세포 현탁액 배양 및 질병 내성 반응 스크리닝을 가진 바늘 주입 접종을 자세히 설명합니다. 본 프로토콜은 옥수수 식물로 의한 미국 수산화의 바늘 주입 접종에 국한되지 않지만 상대적으로 모든 곰팡이 병원균 및 식물 종에 활용 될 수있다. 따라서, 동일한 프로토콜에 있는 두 방법의 세부 사항을 포함하여 연구원은 직접 접종 및 검열을 위한 프로토콜을 이용하거나 관심있는 병원체 및 식물 종에 더 잘 맞추기 위하여 원래 프로토콜을 조작할 수 있게 할 것입니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed for plants</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Collected from original crosses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>Conviron</td>
			<td>PGR14 REACH-IN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planting flats</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>14-3385-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite)</td>
			<td>Hummert International</td>
			<td>10-1059-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>Lab Conoco</td>
			<td>70875372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stocks were grown from original culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile loop</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S17356A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato dextrose agar (PDA) plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R454311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator set to 30 &#176;C</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-690-650F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile toothpicks</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td>Purchased from Walmart and sterilized by autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato dextrose broth (PDB)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN1008617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator-shaker set to 30 &#176;C</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td>14-278-179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>4001000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U. maydis&#160;cell suspension culture (1 x 106 cells/ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Grown from glycerol stock as described in the methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml Syringes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>.457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles</td>
			<td>Kendall Brands</td>
			<td>8881250321</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid and efficient method for assessing pathogenicity of ustilago maydis on maize and teosinte lines

옥수수는 전 세계적으로 주요 시리얼 작물입니다. 그러나, 바이오 트로피크 병원체에 대한 감수성은 생산성을 높이기 위한 주요 제약조건이다. U. maydis는 옥수수에 옥수수 smut의 생물 영양 곰팡이 병원균 및 인과 에이전트입니다. 이 질병은 미국에서 매년 약 10억 달러의 상당한 수율 손실을 담당하고 있으며 작물 회전, 살균제 적용 및 종자 치료를 포함한여러 가지 방법은 현재 옥수수 smut2를제어하는 데 사용됩니다. 그러나, 호스트 저항은 옥수수 smut를 관리 하기 위한 유일한 실용적인 방법. 옥수수, 밀, 쌀 등 농작물 식물의 식별은 다양한 생영양 병원균에 내성이 있는 것으로 매년3-5%감소한다. 따라서 식물 잎 사이에 병원균을 효율적이고 재현적으로 전달하는 병원균 접종 방법의 사용은 미국 의 질비에내성이 있는 옥수수 선의 신속한 식별을 용이하게 할 것이다. 바와 같이, 미국 메이디스에내성이 있는 옥수수 라인을 들여쓰기위한 첫 번째 단계, 바늘 주입 접종 방법 및 저항 반응 스크리닝 방법은 옥수수, 테오신테 및 옥수수 x 테오신테 내성 라인을 접종하고 내성 식물을 선택하기 위해 이용되었다.
옥수수, 테오신테 및 옥수수 x 테오신테 내성 라인, 약 700 식물로 구성, 심어졌다, 미국 maydis의변형으로 접종, 저항을 위해 선별. 접종 및 스크리닝 방법은 성공적으로 미국 maydis에저항하는 3개의 테오신트 라인을 확인했습니다. 여기에 옥수수, 테오신테 및 옥수수 x 테오신테 내성 라인에 대한 상세한 바늘 주입 접종 및 저항 반응 스크리닝 프로토콜이 제시된다. 이 연구는 바늘 주입 접종이 식물 잎 사이에 미국 maydis를 효율적으로 전달할 수 있는 농업에서 귀중한 도구이며, 현재 질병 내성을 위해 번식 프로그램에서 결합하고 테스트할 수 있는 미국 산염에 내성이 있는 식물 라인을 제공했음을 보여줍니다.

성공적인 바늘 주입 접종은 미국 신체 상해 (실험)로 접종 된 식물의 표현형을 시각화하여 결정 될 수있다. 실험 식물의 대다수는 미국 수지 감염에 취약했다. 민감성 식물은 검은 색 텔리오스포레스(그림3D 및 3E, 표 2)를가진 줄기 및 기저 담즙 형성에 의해 입증된 매우 심각한 질병 발달을 보였다. 몇몇 식물은 질병의 엄격 때문에 접종 후에 죽었...

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A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines

생체영양 병원체 우스틸라고 수교를 이용한 옥수수 및 테오신테 식물을 접종하는 바늘 주입 방법의 사용이 설명된다. 상기 바늘 주입 접종 방법은 병원체가 아프레소리아 형성을 통해 식물에 유입되는 식물 잎 사이에 곰팡이 병원균의 통제된 전달을 용이하게 한다. 이 방법은 매우 효율적이며, 미국 maydis와재현 가능한 접종을 가능하게 합니다.

옥수수와 테오신테 라인에 우스틸라고 성 실증의 병원성을 평가하기위한 신속하고 효율적인 방법

Maize is a major cereal crop worldwide. However, susceptibility to biotrophic pathogens is the primary constraint to increasing productivity. U. maydis is ...

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Research

JoVE Journal

Environment

A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines

8.4K 조회수.  University of Georgia. 생체영양 병원체 우스틸라고 수교를 이용한 옥수수 및 테오신테 식물을 접종하는 바늘 주입 방법의 사용이 설명된다. 상기 바늘 주입 접종 방법은 병원체가 아프레소리아 형성을 통해 식물에 유입되는 식물 잎 사이에 곰팡이 병원균의 통제된 전달을 용이하게 한다. 이 방법은 매우 효율적이며, 미국 maydis와재현 가능한 접종을 가능하게 합니다.

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Use of Chironomidae (Diptera) Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrate assemblages have been successfully used to assess human impacts on water quality. Unfortunately, traditional benthic larval sampling methods, such as the dip-net, can be time-consuming and expensive. An alternative protocol involves collection of Chironomidae surface-floating pupal exuviae (SFPE). Chironomidae is a species-rich family of flies (Diptera) whose immature stages typically occur in aquatic habitats. Adult chironomids emerge from the water, leaving their pupal skins, or exuviae, floating on the water&#8217;s surface. Exuviae often accumulate along banks or behind obstructions by action of the wind or water current, where they can be collected to assess chironomid diversity and richness. Chironomids can be used as important biological indicators, since some species are more tolerant to pollution than others. Therefore, the relative abundance and species composition of collected SFPE reflect changes in water quality. Here, methods associated with field collection, laboratory processing, slide mounting, and identification of chironomid SFPE are described in detail. Advantages of the SFPE method include minimal disturbance at a sampling area, efficient and economical sample collection and laboratory processing, ease of identification, applicability in nearly all aquatic environments, and a potentially more sensitive measure of ecosystem stress. Limitations include the inability to determine larval microhabitat use and inability to identify pupal exuviae to species if they have not been associated with adult males.

Use of Chironomidae Diptera Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrates are often used to monitor and assess water quality. An efficient protocol involves collections of Chironomidae surface-floating pupal exuviae (SFPE). Here, techniques for field collection, laboratory processing, slide mounting, and identification of Chironomidae SFPE are described.

Chironomidae (파리목)의 사용 표면 부동 물 기관에 대한 신속한 생물학적 평가 프로토콜로 번데기 Exuviae을

Rapid bioassessment protocols using benthic macroinvertebrate assemblages have been successfully used to assess human impacts on water quality. ...

연구

환경과학

The Use of an Automated System (GreenFeed) to Monitor Enteric Methane and Carbon Dioxide Emissions from Ruminant Animals

Ruminant animals (domesticated or wild) emit methane (CH4) through enteric fermentation in their digestive tract and from decomposition of manure during storage. These processes are the major sources of greenhouse gas (GHG) emissions from animal production systems. Techniques for measuring enteric CH4 vary from direct measurements (respiration chambers, which are highly accurate, but with limited applicability) to various indirect methods (sniffers, laser technology, which are practical, but with variable accuracy). The sulfur hexafluoride (SF6)&#160;tracer gas method is commonly used to measure enteric CH4 production by animal scientists and more recently, application of an Automated Head-Chamber System (AHCS) (GreenFeed, C-Lock, Inc., Rapid City, SD), which is the focus of this experiment, has been growing. AHCS is an automated system to monitor CH4 and carbon dioxide (CO2) mass fluxes from the breath of ruminant animals. In a typical AHCS operation, small quantities of baiting feed are dispensed to individual animals to lure them to AHCS multiple times daily. As the animal visits AHCS, a fan system pulls air past the animal&#8217;s muzzle into an intake manifold, and through an air collection pipe where continuous airflow rates are measured. A sub-sample of air is pumped out of the pipe into non-dispersive infra-red sensors for continuous measurement of CH4 and CO2 concentrations. Field comparisons of AHCS to respiration chambers or SF6 have demonstrated that AHCS produces repeatable and accurate CH4 emission results, provided that animal visits to AHCS are sufficient so emission estimates are representative of the diurnal rhythm of rumen gas production. Here, we demonstrate the use of AHCS to measure CO2 and CH4 fluxes from dairy cows given a control diet or a diet supplemented with technical-grade cashew nut shell liquid.

The Use of an Automated System GreenFeed to Monitor Enteric Methane and Carbon Dioxide Emissions from Ruminant Animals

Accuracy and precision of the techniques used to measure methane emissions from ruminant animals are critically important for the success of greenhouse gas mitigation efforts. This manuscript describes the principles and operation of an automated system to monitor methane and carbon dioxide mass fluxes from the breath of ruminant animals.

자동화 시스템 (GreenFeed)의 사용 반추 동물의 장내 메탄과 이산화탄소 배출량을 모니터링하려면

Ruminant animals (domesticated or wild) emit methane (CH4) through enteric fermentation in their digestive tract and from decomposition of manure during ...

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ecological interactions. Arthropods are usually tracked in nature by tagging them with a unique mark and then re-collecting them over time and space to determine their dispersal capabilities. In addition to actual physical tags, such as colored dust or paint, various types of proteins have proven very effective for marking arthropods for ecological research. Proteins can be administered internally and/or externally. The proteins can then be detected on recaptured arthropods with a protein-specific enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Here we describe protocols for externally and internally tagging arthropods with protein. Two simple experimental examples are demonstrated: (1) an internal protein mark introduced to an insect by providing a protein-enriched diet and (2) an external protein mark topically applied to an insect using a medical nebulizer. We then relate a step-by-step guide of the sandwich and indirect ELISA methods used to detect protein marks on the insects. In this demonstration, various aspects of the acquisition and detection of protein markers on arthropods for mark-release-recapture, mark-capture, and self-mark-capture types of research are discussed, along with the various ways that the immunomarking procedure has been adapted to suit a wide variety of research objectives.

Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.

관리 및 분산 연구를위한 절지 동물에 단백질 마크를 검출

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

Reliable Method for Assessing Seed Germination, Dormancy, and Mortality under Field Conditions

We describe techniques for approximating seed bank dynamics over time using Helianthus annuus as an example study species. Strips of permeable polyester fabric and glue can be folded and glued to construct a strip of compartments that house seeds and identifying information, while allowing contact with soil leachate, water, microorganisms, and ambient temperature. Strips may be constructed with a wide range of compartment numbers and sizes and allow the researcher to house a variety of genotypes within a single species, different species, or seeds that have experienced different treatments. As opposed to individual seed packets, strips are more easily retrieved as a unit. While replicate packets can be included within a strip, different strips can act as blocks or can be retrieved at different times for observation of seed behavior over time. We used a high temperature glue gun to delineate compartments and sealed the strips once the seed and tags identifying block and removal times were inserted. The seed strips were then buried in the field at the desired depth, with the location marked for later removal. Burrowing animal predators were effectively excluded by use of a covering of metal mesh hardware cloth on the soil surface. After the selected time interval for burial, strips were dug up and seeds were assessed for germination, dormancy and mortality. While clearly dead seeds can often be distinguished from ungerminated living ones by eye, dormant seeds were conclusively identified using a standard Tetrazolium chloride colorimetric test for seed viability.

Here we present a protocol for assessing seed survivorship, germination and dormancy under field conditions using buried, labeled seed strips and tetrazolium chloride (TZ) viability testing.

이 필드 조건에서 종자 발아, 휴면 및 사망률을 평가하기위한 신뢰할 수있는 방법

We describe techniques for approximating seed bank dynamics over time using Helianthus annuus as an example study species. Strips of permeable polyester ...

Protocol for Assessing the Relative Effects of Environment and Genetics on Antler and Body Growth for a Long-lived Cervid

Cervid phenotype can be placed into one of two categories: efficiency, which promotes survival over extravagant morphometric growth, and luxury, which promotes growth of large weaponry and body size. Populations of the same species display each phenotype depending on environmental conditions. Although antler and body size of male white-tailed deer (Odocoileus virginianus) varies by physiographic region in Mississippi, USA and is strongly correlated with regional variation in nutritional quality, the effects of population-level genetics from native stocks and previous re-stocking efforts cannot be disregarded. This protocol describes how we designed a controlled study, where other factors that influence phenotype, such as age and nutrition, are controlled. We brought wild-caught pregnant females and six-month-old fawns from three distinct physiographic regions in Mississippi, USA to the Mississippi State University Rusty Dawkins Memorial Deer Unit. Deer from the same region were bred to produce a second generation of offspring, allowing us to assess generational responses and maternal effects. All deer ate the same high-quality (20% crude protein deer pellet) diet ad libitum. We uniquely marked each neonate and recorded body mass, hind foot, and total body length. Each subsequent fall, we sedated individuals via remote injection and sampled the same morphometrics plus antlers of adults. We found that all morphometrics increased in size from first to second generation, with full compensation of antler size (regional variation no longer present) and partial compensation of body mass (some evidence of regional variation) evident in the second generation. Second generation males that originated from our poorest quality soil region displayed about a 40% increase in antler size and about a 25% increase in body mass when compared to their wild harvested counterparts. Our results suggest phenotypic variation of wild male white-tailed deer in Mississippi are more related to differences in nutritional quality than population-level genetics.

Phenotypic differences among cervid populations may be related to population-level genetics or nutrition; discerning which is difficult in the wild. This protocol describes how we designed a controlled study where nutritional variation was eliminated. We found that phenotypic variation of male white-tailed deer was more limited by nutrition than genetics.

뿔과 긴 Cervid에 대 한 신체 성장에 환경 및 유전학의 상대적 효과 평가 하기 위한 프로토콜

Cervid phenotype can be placed into one of two categories: efficiency, which promotes survival over extravagant morphometric growth, and luxury, which ...

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

Dimethylated thioarsenicals such as dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV), which are produced by the metabolic pathway of dimethylarsinic acid (DMAV) thiolation, have been recently found in the environment as well as human organs. DMMTAV and DMDTAV can be quantified to determine the ecological effects of dimethylated thioarsenicals and their stability in environmental media. The synthesis method for these compounds is unstandardized, making replicating previous studies challenging. Furthermore, there is a lack of information about storage techniques, including storage of compounds without species transformation. Moreover, because only limited information about synthesis methods is available, there may be experimental difficulties in synthesizing standard chemicals and performing quantitative analysis. The protocol presented herein provides a practically modified synthesis method for the dimethylated thioarsenicals, DMMTAV and DMDTAV, and will help in the quantification of species separation analysis using high performance liquid chromatography in conjunction with inductively coupled plasma mass spectrometry (HPLC-ICP-MS). The experimental steps of this procedure were modified by focusing on the preparation of chemical reagents, filtration methods, and storage.

Preparation of DMMTAV and DMDTAV Using DMAV for Environmental Applications: Synthesis, Purification, and Confirmation

This article presents modified experimental protocols for dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV) synthesis, inducing dimethylarsinic acid (DMAV) thiolation through mixing of DMAV, Na2S, and H2SO4. The modified protocol provides an experimental guideline, thereby overcoming limitations of the synthesis steps that could have caused experimental failures in quantitative analysis.

DMMTAV 및 환경 응용 프로그램에 대 한 DMAV 를 사용 하 여 DMDTAV 의 준비: 합성, 정화, 및 확인

Dimethylated thioarsenicals such as dimethylmonothioarsinic acid (DMMTAV) and dimethyldithioarsinic acid (DMDTAV), which are produced by the metabolic ...

The Hawaii Protocol for Scientific Monitoring of Coffee Berry Borer: a Model for Coffee Agroecosystems Worldwide

Coffee berry borer (CBB) is the most devastating insect pest for coffee crops worldwide. We developed a scientific monitoring protocol that is aimed at capturing and quantifying the dynamics and impact of this invasive insect pest as well as the development of its host plant across a heterogeneous landscape. The cornerstone of this comprehensive monitoring system is timely georeferenced data collection on CBB movement, coffee berry infestation, mortality by the fungus Beauveria bassiana, and coffee plant phenology via a mobile electronic data recording application. This electronic data collection system allows field records to be georeferenced through built-in global positioning systems, and is backed by a network of weather stations and records of farm management practices. Comprehensive monitoring of CBB and host plant dynamics is an essential part of an area-wide project in Hawaii to aggregate landscape-level data for research to improve management practices. Coffee agroecosystems in other parts of the world that experience highly variable environmental and socioeconomic factors will also benefit from implementing this protocol, in that it will drive the development of customized integrated pest management (IPM) to manage CBB populations.

Comprehensive monitoring of coffee berry borer and host plant dynamics is essential for aggregating landscape-level data to improve management of this invasive pest. Here, we present a protocol for scientific monitoring of coffee berry borer movement, infestation, mortality, coffee plant phenology, weather, and farm management via a mobile electronic data recording application.

커피 베리 보어의 과학적 모니터링을 위한 하와이 프로토콜: 커피 Agroecosystems 전세계에 대 한 모델

Coffee berry borer (CBB) is the most devastating insect pest for coffee crops worldwide. We developed a scientific monitoring protocol that is aimed at ...

A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for assessing plant responses to chemicals and other substances of interest is presented. This system is highly efficient in obtaining homogeneous and healthy seedlings of the C3 and C4 model species Arabidopsis thaliana and Setaria viridis, respectively. The sterile cultivation avoids algae and microorganism contamination, which are known limiting factors for plant normal growth and development in hydroponics. In addition, this system is scalable, enabling the harvest of plant material on a large scale with minor mechanical damage, as well as the harvest of individual parts of a plant if desired. A detailed protocol demonstrating that this system has an easy and low-cost assembly, as it uses pipette racks as the main platform for growing plants, is provided. The feasibility of this system was validated using Arabidopsis seedlings to assess the effect of the drug AZD-8055, a chemical inhibitor of the target of rapamycin (TOR) kinase. TOR inhibition was efficiently detected as early as 30 min after an AZD-8055 treatment in roots and shoots. Furthermore, AZD-8055-treated plants displayed the expected starch-excess phenotype. We proposed this hydroponic system as an ideal method for plant researchers aiming to monitor the action of plant inducers or inhibitors, as well as to assess metabolic fluxes using isotope-labeling compounds which, in general, requires the use of expensive reagents.

A simple, versatile, and low-cost in vitro hydroponic system was successfully optimized, enabling large-scale experiments under sterile conditions. This system facilitates the application of chemicals in a solution and their efficient absorption by roots for molecular, biochemical, and physiological studies.

유연한 저비용 수경 시스템 살 균 조건에서 작은 분자에 식물 응답을 평가 하기 위한

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for ...

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize (Zea mays L.)

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole grain composition and processing characteristics vary among maize hybrids and can impact the quality of the final processed product. Therefore, in order to produce healthier processed food products from maize, it is necessary to know how to optimize processing parameters for particular sets of germplasm to account for these differences in grain composition and processing characteristics. This includes a better understanding of how current processing techniques impact the nutritional quality of the final processed food product. Here, we describe a microscale protocol that both simulates the processing pipeline to produce cornflakes from large flaking grits and allows for the processing of multiple grain samples simultaneously. The flaking grits, the intermediate processed products, or final processed product, as well as the corn grain itself, can be analyzed for nutritional content as part of a high-throughput analytical pipeline. This procedure was developed specifically for incorporation into a maize breeding research program, and it can be modified for other grain crops. We provide an example of the analysis of insoluble-bound ferulic acid and p-coumaric acid content in maize. Samples were taken at five different processing stages. We demonstrate that sampling can take place at multiple stages during microscale processing, that the processing technique can be utilized in the context of a specialized maize breeding program, and that, in our example, most of the nutritional content was lost during food product processing.

High-throughput, Microscale Protocol for the Analysis of Processing Parameters and Nutritional Qualities in Maize Zea mays L.

Here, we present a microscale protocol for processing grain samples and for incorporating this microscale approach into a high-throughput analytical pipeline. This is a higher throughput adaptation of currently available protocols.

높은 처리량, 처리 파라미터 분석 및 옥수수 (지 시 메이 스 L.) 영양 자질에 대 한 미 프로토콜

Maize is an important grain crop in the United States and worldwide. However, maize grain must be processed prior to human consumption. Furthermore, whole ...

Assessing the Particulate Matter Removal Abilities of Tree Leaves

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on collecting various sized particulate matter (PM) retained on leaf surfaces. We further characterized the retention efficiency of leaves to various sized PM, which will help to assess the abilities of urban trees to remove PM from ambient air quantitatively. 
Taking three broadleaf tree species (Ginkgo biloba, Sophora japonica, and Salix babylonica) and two needleleaf tree species (Pinus tabuliformis and Sabina chinensis) as the research objects, leaf samples were collected 4 days (short PM retention period) and 14 days (long PM retention period) after the latest rainfall. PM retained on the leaf surfaces was collected by means of WC, BC, and UC in sequence. Then, retention efficiencies of leaves (AEleaf) to three types of the various sized PM, including easily removable PM (ERP), difficult-to-remove PM (DRP), and totally removable PM (TRP), were calculated. Only around 23%-45% of the total PM retained on leaves could be cleaned off and collected by WC. When the leaves were cleaned through WC+BC, the underestimation of the PM retention capacity of different tree species was in the range of 29%-46% for various sized PM. Almost all PM retained on leaves could be removed if UC was supplemented to WC+BC. 
In conclusion, if the UC was complemented after the conventional cleaning methods, more PM on leaf surfaces could be eluted and collected. The procedure developed in this study can be used for assessing the PM removal abilities of different tree species.

The ultrasonic cleaning method was applied to elute the particulate matter (PM) retained on leaf surfaces after PM was eluted by the conventional cleaning methods (water cleaning only or water cleaning plus brush cleaning). The methodology can help to improve the estimation accuracy for PM retention capacity of leaves.

단풍 나무의 미 립 자 물질 제거 능력 평가

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on ...