우리의 프로토콜은 연구자들이 값비싼 장비를 사용하지 않고도 야생형 및 유전적 진균 돌연변이의 초기 감염 단계를 시각화할 수 있도록 하는 단순화된 방법입니다. 이 기술의 주요 장점은 복잡한 생물학적 질문에 답하고 추가 분석을 위해 곰팡이 돌연변이를 신속하게 스크리닝하기 위해 기본 실험실 용품을 사용한다는 것입니다. 이 기술의 어려운 부분은 칼집 치료입니다.
외피는 쉽게 손상될 수 있는 얇은 세포 층이므로 성공적인 실험을 위해서는 신중한 취급이 필수적입니다. 시작하려면 두 번째 잎 단계까지 자란 보리를 선택하십시오. 그리고 멸균 가위를 사용하여 토양 선 바로 위의 보리 식물을 자릅니다.
집게와 메스를 사용하여 세로로 열린 첫 번째 잎의 칼집을 조심스럽게 자릅니다. 그리고 집게를 사용하여 두 번째 잎의 바닥에서 제거하십시오. 메스를 사용하여 첫 번째 잎의 대부분을 칼집에서 잘라내고 장착을 위해 잎 조직의 0.5인치만 남깁니다.
접시 내부의 습도를 유지하기 위해 젖은 종이 타월이 들어있는 멸균 된 60mm 페트리 접시에 첫 번째 잎을 평평하게 놓습니다. 잎 조직을 페트리 접시 바닥에 테이프로 붙입니다. 9 일에서 12 일 된 Magnaporthe oryzae 배양 접시를 선택하고 0.5-2 밀리리터의 멸균 수를 첨가하십시오.
멸균 접종 루프를 사용하여 균사체를 부드럽게 긁어 부착 된 분생 포자를 방출합니다. 분생 포자 현탁액을 작은 치즈 천 조각이 들어 있는 미세 원심분리기 튜브에 조심스럽게 피펫팅하여 분생포형 현탁액에서 큰 균사체 조각을 걸러냅니다. 필요한 경우 포자 농도를 밀리리터당 10배에서 4번째 포자의 5배로 희석하는데, 농도가 너무 높으면 개별 감염 부위를 이미징하기가 어렵기 때문입니다.
칼집 크기에 따라 압연 잎 덮개 안에 25-50 마이크로 리터의 분생 현탁액을 조심스럽게 피펫팅합니다. 다음으로, 4 개 또는 5 개의 500 밀리리터 비커를 이중 증류수로 채우고 김이 날 때까지 가열하십시오. 페트리 접시의 뚜껑을 김이 나는 비커 중 하나 위에 올려 접시 내부의 습기를 가둡니다.
감염된 잎 덮개 판을 쌓고 포자가 발아할 수 있는 습하고 습한 환경을 조성하기 때문에 나머지 뜨거운 비커로 둘러쌉니다. 단색의 고무 또는 플라스틱 상자로 덮고 48시간 동안 또는 원하는 이미징 시점 동안 방해받지 않은 상태로 두어 이 설정을 빛으로부터 보호하십시오. 갓 희석한 45% 아세트산과 0.1% 트리판 블루를 혼합하여 얼룩을 준비합니다.
1 밀리리터의 염료 용액을 마이크로 원심 분리기 튜브에 분취합니다. 메스를 사용하여 테이프에서 잎 덮개를 조심스럽게 자릅니다. 집게를 사용하여 피복을 미세 원심분리기 튜브에 넣고 염료 용액에 완전히 잠겼는지 확인합니다.
염료가 잎에 침투할 수 있도록 튜브를 섭씨 40도의 열 블록이나 수조에 2시간 동안 두십시오. 다음으로, 잎 덮개를 60 % 신선한 글리세롤로 세 번 조심스럽게 헹구어 여분의 염료를 제거합니다. 슬라이드에 장착할 준비가 될 때까지 외피를 글리세롤에 보관하십시오.
깨끗한 유리 슬라이드에 칼집을 놓고 60 % 글리세롤 몇 방울을 넣으십시오. 해부 현미경과 두 쌍의 집게를 사용하여 접종 된 중심이 위를 향하도록 조심스럽게 덮개를 펼칩니다. 집게로 덮개를 열고 덮개가 말리거나 감염 부위를 막는 것을 방지하기 위해 덮개 슬립을 맨 위에 놓습니다.
장기 보관을 위해 매니큐어를 사용하여 커버 슬립을 밀봉하거나 단기 보관을 테이프로 감습니다. 복합 광학 현미경으로 슬라이드를 관찰합니다. 스마트폰으로 현미경에 휴대폰 어댑터를 장착하여 기본 이미지를 촬영합니다.
Android 장치의 경우 카메라 응용 프로그램 설정을 조정하여 플래시를 끄고, 탑 샷을 비활성화하고, 밝기 및 그림자 자동 조정을 비활성화하고, 사진 해상도를 최대로 설정합니다. 휴대 전화를 장착한 후 데이터 수집을 위해 원하는 목적을 가진 스케일 마이크로미터의 이미지를 촬영합니다. 휴대폰의 확대/축소를 2.5배로 조정하고 픽셀 크기를 일정하게 유지하세요.
칼집의 중앙에는 포자와 감염 appressoria가 가장 많이 집중되어 있습니다. 따라서 통계 분석을 위한 상당한 수를 얻기 위해 각 피복의 9-12개 이미지를 목표로 합니다. 외피의 감염 부위는 트립판 블루로 염색한 후 스마트폰과 스마트폰 현미경 어댑터를 사용하여 이미지화했습니다.
염색 과정에서 열과 아세트산은 잎 조직을 부드럽게 부드럽게합니다. 60% 글리세롤의 염색 후 헹굼은 과도한 얼룩을 제거할 뿐만 아니라 잎으로 인한 빛 산란을 줄이고 이미지 품질을 개선하는 데 도움이 됩니다. 염색 프로토콜에서 벗어나면 여기에 설명된 대로 최적이 아닌 결과가 발생할 수 있습니다.
4091 야생형으로 감염된 보리는 잎초 조직 내부에 감염된 균사의 존재에 의해 확인된 성공적으로 감염된 세포를 생산하였다. 돌연변이 J99A 감염의 경우, appressoria 및 침투 못의 성공적인 발달이 관찰되었지만 침습성 균사를 생성하지 않았습니다. 감염 기반 분석에는 타이밍이 중요합니다.
적절하게 숙성된 식물과 곰팡이 포자는 성공에 필수적입니다. 이 연구에서 우리는 감염 구조의 유무를 조사했습니다. 추가 실험은 감염 구조의 표현형과 침입 균사의 표현형에 관한 질문에 답할 수 있습니다.
우리의 방법론은 새로운 것이 아니라 더 복잡하고 값 비싼 실험의 단순화되고 접근 가능한 버전입니다.
