애기장대 및 기타 식물의 흰가루병 감염 표현형을 정확하게 평가하기 위한 쉽고 유연한 접종 방법

흰가루병은 중요한 식물 질병입니다. 질병 표현형을 정확하게 결정하려면 병원균의 접종이 필요합니다. 기존 방법은 비효율적이기 때문에이 프로토콜을 개발했습니다.

우리의 포자 접종 방법은 쉽게 접종을 할 수 있으며 간단하고 확장 가능합니다. 따라서 흰가루병을 다루는 모든 실험실에서이 방법을 쉽게 사용할 수 있습니다. 연구원들은 또한 골판지 상자 위에 메쉬를 장착하여 포자 접종에 사용할 수 있습니다.

포자를 제거하고 메쉬를 통해 솔질하는 방법은 중요한 단계입니다. 따라서 이것을 비디오로 시연하면 매우 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 경우 50마이크로미터 나일론 멤브레인 메쉬 또는 48마이크로미터 스테인리스 스틸 메쉬 롤을 얻습니다.

접종 상자를 만들기 위해 큰 크기의 중간 밀도 합판을 24.5X10 인치 및 12X10 인치 조각으로 자릅니다. 메쉬로 탈착식 상단 뚜껑을 만들려면 긴 나무 사각형 다웰을 26 인치와 12.75 인치의 두 세트로 자릅니다. 상자 주위에 맞도록 네 조각을 붙이고 못을 박습니다.

아크릴 시트를 가져 와서 8 개의 모서리 클램프를 사용하여 모든 아크릴 시트를 상자에 조립하십시오. 상자의 아크릴 시트 앞면에 7X2 인치 개구부를 자릅니다. 신선한 흰가루병 포자를 접종 물로 준비하려면 섭씨 22도 및 65 % 상대 습도의 성장 챔버에서 깨끗한 애기장대 면역 저하 pad4-1 돌연변이 식물을 6-8 주 동안 재배하십시오.

표준 아파트에서 감염 표현형을 결정하기 위해 식물을 재배하십시오. pad4-1 식물의 하나 또는 절반을 접종하여 충분한 신선한 흰가루병 포자를 만듭니다. 감염된 식물의 신선한 포자를 사용할 수 있으면 감염 테스트를 위해 접종실 내부의 접종 상자로 식물을 옮깁니다.

심하게 감염된 애기장대 잎 15-20 개를 자르고 응축수가 있으면 말리십시오. 한 쌍의 긴 집게로 한 손에 한두 개의 잎을 거꾸로 잡습니다. 그런 다음 양손을 챔버의 개구부에 넣고 가위로 집게의 팔을 부드럽게 치고 접종 상자에 장착 된 메쉬 위의 잎을 천천히 움직입니다.

미세한 팬 블렌더 브러시로 포자를 전체 메쉬 표면을 다른 방향으로 솔질하여 식물에 포자의 균일한 분포를 최대화합니다. 브러시로 메쉬를 몇 번 가볍게 두드려 메쉬에 붙어있는 포자를 털어냅니다. 포자가 침전되면 접종 상자에서 접종 된 식물이 들어있는 평평한 곳으로 옮깁니다.

플라스틱 돔으로 플랫을 덮고 섭씨 22도 및 65 % 상대 습도의 성장 챔버에 놓습니다. 질환 표현형은 접종 후 5 또는 8 내지 12일에 수행될 수 있다. 상자의 상단과 하단을 제거하고 모서리를 테이프로 고정하고 접착제로 상단에 50마이크로미터 메쉬를 장착하여 판지 상자를 접종 상자로 변환합니다.

접종실 내부에 식물이 들어있는 플랫을 옮기고 더 작은 접종 상자를 플랫 위에 놓아 식물을 덮습니다. 그런 다음 포자를 제거하고 닦으십시오. 페트리 접시보다 약간 큰 미니 접종 상자를 만드십시오.

접시를 사용할 때까지 섭씨 4도에서 냉장고에 보관하십시오. 테스트 할 각 식물에 대해 잎자루 바닥에서 하나 또는 두 개의 완전히 확장 된 잎을 자릅니다. 분리 된 잎의 잎자루를 한천 배지에 30도 각도로 삽입하십시오.

접종실 내부의 잎을 접종하고 뚜껑이있는 판을 성장 챔버로 옮깁니다. 감염 표현형을 평가하기 위해 접종 후 4-5일에 잎을 신선한 무균 MS 한천 플레이트로 옮깁니다. 잎을 신선한 한천 배지에 넣기 전에 잎자루의 바닥을 자릅니다.

접종 후 8일 또는 9일에 질병 표현형을 평가합니다. 현미경 분석은 평평한 바닥의 미세한 슬라이드에 포자의 분포를 균일하게 표시했습니다. 광 접종 후 6 개의 다른 위치에 분포 된 계산 된 포자 밀도는 큰 차이를 보이지 않았다.

포자를 많이 접종 한 후에도 비슷한 결과가 나타났습니다. 접종 균등성은 무거운 접종 후 12 일에 다른 식물 유전자형간에 검사되었습니다. pad4-1 식물은 야생형 식물인 콜롬비아 0에 비해 향상된 질병 감수성을 보였다.

취약한 식물에 접종 후 약 10 일 후에 생성 된 적절한 신선한 포자를 사용하는 것이 중요한데, 이는 신선한 포자가 제거되기 쉽고 식민지화를 확립 할 가능성이 더 높기 때문입니다. 흰가루병은 식물 표피 세포 만 식민지화합니다. 표피 박리 또는 레이저 미세 해부를 통한 흰가루병 감염 세포의 분리는 숙주 반응에 대한보다 표적화 된 전사체 및 단백질체 연구를 가능하게합니다.

이 방법은 연구자가 분말 곰팡이 감염 표현형을보다 효율적으로 결정하는 데 도움이되므로 식물 흰가루병 상호 작용에 대한보다 효과적인 기능 연구를 촉진해야합니다.