흰가루병은 중요한 식물 질병입니다. 질병 표현형을 정확하게 결정하려면 병원균의 접종이 필요합니다. 기존 방법은 비효율적이기 때문에이 프로토콜을 개발했습니다.
우리의 포자 접종 방법은 쉽게 접종을 할 수 있으며 간단하고 확장 가능합니다. 따라서 흰가루병을 다루는 모든 실험실에서이 방법을 쉽게 사용할 수 있습니다. 연구원들은 또한 골판지 상자 위에 메쉬를 장착하여 포자 접종에 사용할 수 있습니다.
포자를 제거하고 메쉬를 통해 솔질하는 방법은 중요한 단계입니다. 따라서 이것을 비디오로 시연하면 매우 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 경우 50마이크로미터 나일론 멤브레인 메쉬 또는 48마이크로미터 스테인리스 스틸 메쉬 롤을 얻습니다.
접종 상자를 만들기 위해 큰 크기의 중간 밀도 합판을 24.5X10 인치 및 12X10 인치 조각으로 자릅니다. 메쉬로 탈착식 상단 뚜껑을 만들려면 긴 나무 사각형 다웰을 26 인치와 12.75 인치의 두 세트로 자릅니다. 상자 주위에 맞도록 네 조각을 붙이고 못을 박습니다.
아크릴 시트를 가져 와서 8 개의 모서리 클램프를 사용하여 모든 아크릴 시트를 상자에 조립하십시오. 상자의 아크릴 시트 앞면에 7X2 인치 개구부를 자릅니다. 신선한 흰가루병 포자를 접종 물로 준비하려면 섭씨 22도 및 65 % 상대 습도의 성장 챔버에서 깨끗한 애기장대 면역 저하 pad4-1 돌연변이 식물을 6-8 주 동안 재배하십시오.
표준 아파트에서 감염 표현형을 결정하기 위해 식물을 재배하십시오. pad4-1 식물의 하나 또는 절반을 접종하여 충분한 신선한 흰가루병 포자를 만듭니다. 감염된 식물의 신선한 포자를 사용할 수 있으면 감염 테스트를 위해 접종실 내부의 접종 상자로 식물을 옮깁니다.
심하게 감염된 애기장대 잎 15-20 개를 자르고 응축수가 있으면 말리십시오. 한 쌍의 긴 집게로 한 손에 한두 개의 잎을 거꾸로 잡습니다. 그런 다음 양손을 챔버의 개구부에 넣고 가위로 집게의 팔을 부드럽게 치고 접종 상자에 장착 된 메쉬 위의 잎을 천천히 움직입니다.
미세한 팬 블렌더 브러시로 포자를 전체 메쉬 표면을 다른 방향으로 솔질하여 식물에 포자의 균일한 분포를 최대화합니다. 브러시로 메쉬를 몇 번 가볍게 두드려 메쉬에 붙어있는 포자를 털어냅니다. 포자가 침전되면 접종 상자에서 접종 된 식물이 들어있는 평평한 곳으로 옮깁니다.
플라스틱 돔으로 플랫을 덮고 섭씨 22도 및 65 % 상대 습도의 성장 챔버에 놓습니다. 질환 표현형은 접종 후 5 또는 8 내지 12일에 수행될 수 있다. 상자의 상단과 하단을 제거하고 모서리를 테이프로 고정하고 접착제로 상단에 50마이크로미터 메쉬를 장착하여 판지 상자를 접종 상자로 변환합니다.
접종실 내부에 식물이 들어있는 플랫을 옮기고 더 작은 접종 상자를 플랫 위에 놓아 식물을 덮습니다. 그런 다음 포자를 제거하고 닦으십시오. 페트리 접시보다 약간 큰 미니 접종 상자를 만드십시오.
접시를 사용할 때까지 섭씨 4도에서 냉장고에 보관하십시오. 테스트 할 각 식물에 대해 잎자루 바닥에서 하나 또는 두 개의 완전히 확장 된 잎을 자릅니다. 분리 된 잎의 잎자루를 한천 배지에 30도 각도로 삽입하십시오.
접종실 내부의 잎을 접종하고 뚜껑이있는 판을 성장 챔버로 옮깁니다. 감염 표현형을 평가하기 위해 접종 후 4-5일에 잎을 신선한 무균 MS 한천 플레이트로 옮깁니다. 잎을 신선한 한천 배지에 넣기 전에 잎자루의 바닥을 자릅니다.
접종 후 8일 또는 9일에 질병 표현형을 평가합니다. 현미경 분석은 평평한 바닥의 미세한 슬라이드에 포자의 분포를 균일하게 표시했습니다. 광 접종 후 6 개의 다른 위치에 분포 된 계산 된 포자 밀도는 큰 차이를 보이지 않았다.
포자를 많이 접종 한 후에도 비슷한 결과가 나타났습니다. 접종 균등성은 무거운 접종 후 12 일에 다른 식물 유전자형간에 검사되었습니다. pad4-1 식물은 야생형 식물인 콜롬비아 0에 비해 향상된 질병 감수성을 보였다.
취약한 식물에 접종 후 약 10 일 후에 생성 된 적절한 신선한 포자를 사용하는 것이 중요한데, 이는 신선한 포자가 제거되기 쉽고 식민지화를 확립 할 가능성이 더 높기 때문입니다. 흰가루병은 식물 표피 세포 만 식민지화합니다. 표피 박리 또는 레이저 미세 해부를 통한 흰가루병 감염 세포의 분리는 숙주 반응에 대한보다 표적화 된 전사체 및 단백질체 연구를 가능하게합니다.
이 방법은 연구자가 분말 곰팡이 감염 표현형을보다 효율적으로 결정하는 데 도움이되므로 식물 흰가루병 상호 작용에 대한보다 효과적인 기능 연구를 촉진해야합니다.
