우리는 그들의 도움을 카린 Kindbeiter, 뮤리엘 Bozon 및 Florie 위 Reynaud 감사합니다. 작품은 CNRS, ANR YODA 프로그램과 Labex DevWeCan에 의해 지원됩니다.

1 일 1. E12.5 마우스 배아에서 척수 바닥 플레이트 (FP)의 해부 참고 : 전체 절차는 멸균 조건의 사용을 필요로한다. 이것은 오염을 피하기 위해 해부 후드 절개를 수행하는 것이 바람직하다. 후드의 표면은 에탄올로 청소해야합니다. 모든 해부 악기 멸균 페트리 접시에 소독 및 보관해야합니다. 액체 (매체, 해부 매체는) 밀폐 보관하고 얼음 욕조에 넣어해야합니다. 각각의 배아 개별 신선한 하락에 수집되어야한다. 이 조직 보존을위한 중요합니다. 해부는 뒤몽 # 5 포셉으로 수행된다. 요리, 그립 후뇌에 손상없이 탯줄 또는 머리 사이의 배아를 전송합니다. 그것은 성공적으로 절개를 완료하기 위해 척수 손상되지 중요합니다. 준비 차가운 인산염 완충 생리 식염수 (PBS), 차가운 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) -6.5 %의 포도당과 실내 온도 neurobasal 매체. 1.1 척수의 해부 동물은 유럽 지침 다음 센터 국립 드 라 공들인 Scientifique의 동물 관리 지침에 따라 처리됩니다. 안락사의 방법은 자궁 경부 전위, 그것은 목에 압력을 적용하고 뇌에서 척추 탈구로 구성되어 있습니다. 이 방법은 마우스 동물 모델에게 추천하고, 신속하고 효율적인 방식으로 수행 될 수있다. <ol><li> 임신 (E0.5 = 첫 날 다음 매트)의 E12.5에서 임신 한 쥐를 안락사. 마우스 복부 측면을 위로 놓습니다. </li><li> 70 % 에탄올로 복부를 적시십시오. Adson 집게와 복부의 피부를 조이고 수술 가위로 피부와 복막 레이어를 잘라. 절개를하고 복강을 노출 마우스의 양측에 잘라 사용. </li><li> 배아의 문자열은 마우스의 양쪽에 존재한다. UTE의 하나의 뿔을 잡고두 개의 배아와 외부 부분에서 시작을 해부 사이의 조직에서 RUS. 얼음 차가운 PBS와 100mm 페트리 접시에 그대로 자​​궁을 전송합니다. </li><li> 여분의 배아 조직에서 배아를 추출합니다. 포셉 두 쌍의 태반 조직 (어두운 빨강)을 잡고 조직을 찢어 자궁 주머니에서 배아를 제거하기 위해 부드럽게 잡아 당깁니다. </li></ol> 참고 : 더 나은 보호를 위해, 자신의 자궁 주머니 하나 하나의 배아를 수집합니다. <ol start="5"><li> 다음 단계는 양안 돋보기 및 해부 후드 아래에 이루어집니다. 차가운 HBSS 6.5 % 포도당의 드롭 한 배아를 놓습니다. </li><li> 집게를 사용하여 배아 목을 벨. </li></ol> 참고 : 아래 턱뼈와 후뇌 사이에 잘라, 후뇌의 뒤쪽 부분은 다음 단계에 중요합니다. <ol start="7"><li> 실험에 직면 앞쪽 부분에 배아 복부 얼굴을 아래로 놓습니다. </li><li> 피부를 꼬집어집게 일쌍와 다른 쌍을 사용하여 태아의 피부을 당깁니다. </li></ol> 주 :이 단계는 피부가 완전 배아의 앞쪽 부분에서 제거 될 때까지 반복되어야한다. <ol start="9"><li> 왼쪽에있는 태아의 전방 측을 켭니다. 한 집게로 앞쪽 부분에 배아를 &quot;아래로 핀&quot;. 다른 집게는 피부를 잡아 배아의 주동이의쪽으로 끌어와. 척수는 액세스 할 수 있습니다. </li><li> 여전히 척수를 감싸는 수막을 잘라 집게의 한면을 사용합니다. 척수는 지금 열려 있습니다. </li><li> 오른쪽에있는 태아의 전방 측을 켭니다. </li><li> 배아의 자궁 경관 측면에서 시작하여 척수 조직을 분리합니다. 척수 (집게가 척수 손상을 방지하기 위해 폐쇄 개최한다)에서 집게를 밀어 넣습니다. 집게는 척수에서 볼 수 있어야합니다. 척수에서 작은 회전하는 움직임을 분리하기에 충분하다조직과 후근 신경절 (DRG)를 둘러싼. </li></ol> 참고 : 출발 연결된 주변 조직 따라서 다음 단계 중에 파괴의 가능성을 증가, 척수에 무게를 추가 할 수 있습니다. <ol start="13"><li> 차가운 HBSS 6.5 % 포도당의 신선한 방울의 고립 된 척수를 놓습니다. </li><li> 평면, 멀리 실험에서 위쪽과 앞쪽 측면에 수막에 척수를 놓습니다. </li><li> 한 집게로 남아있는 후뇌를 사용하여 척수를 &quot;핀 내려&quot;, 두 번째 집게는 수막을 잡아와. 척수의 주동이의 측면에서 시작하여 수막을 벗겨. </li></ol> 참고 : 움직임 척수의 분열을 방지하기 위해 천천히 일정해야한다. 진동 운동은 수막의 분리를 용이하게 할 수있다. 1.2 FP 해부 <ol><li> 한 집게와 후뇌 핀치. </li><li> FP는 중앙 TRA이며조직의 nsparent 부분. 메스를 사용하여 바닥 판을 잘라. </li></ol> 참고 : 동일한 품질로 양쪽을 잘라, 주동이의 측면에서 시작하여 교대로 오른쪽 바닥 판의 왼쪽을 잘라. <ol start="3"><li> 실온에서 Neurobasal 배지에서 해부 FP를 보존. </li></ol> 2. FP 문화 참고 : 모든 단계는 조직 문화 후드에서 무균 조건 하에서 수행되어야한다. 신선한 매체와 갓 해동 보충 및 시약을 사용합니다. 멸균 유리 커버 슬립, 따뜻한 neurobasal + B27, 플라즈마 및 HBSS - 트롬빈을 준비합니다. 2.1 FP 문화 <ol><li> 100mm 배양 접시에 각각의 coverslip의 중심에 피펫 20 μL 플라즈마의 여러​​ 불임의 coverslips를 놓습니다. </li><li> 각 플라즈마 드롭 2-4 FP를 전송하고 플라즈마 드롭 옆에 20 ㎕의 HBSS - 트롬빈을 추가하고 조심스럽게 섞는다. 커버 슬립을 유지실온에서 충분히의 최소 혈장의 응고를 허용하기 위해. </li></ol> 참고 : 부분 절개의 경우 완전 해부 등의 경우 이전 두 FPS를. 피펫 팁 천천히 혼합 FP 외식과의 접촉을 피하십시오. 플라즈마 응고 응고의 표시로 몇 μm의 후퇴. 응고 플라즈마 응고의 분리를 방지하기 위해, 중간에 중지 할 수 없습니다해야합니다. <ol start="3"><li> 24 웰 플레이트의 각 coverslip에 전송하고 Neurobasal + B27의 500 μl를 추가합니다. 37 ℃에서 48 시간을 품어 </li></ol> 3 일 3. FP 된 배지 (FP의 CM) 수확 참고 : 수확은 조직 배양 후드에서 무균 조건 하에서 수행되어야한다. 상층 액을 배양 요정 중에 오염이나 바닥 플레이트 (의미 부동 한 경우에는 사망 할 수있는 경우OD)을 잘에서 FP의 CM을 수확하지 않습니다. 3.1 FP 센티미터 수확 <ol><li> 각 우물에서주의 깊게 매체를 수확. </li></ol> 참고 : 중합 플라즈마 트롬빈 혼합 또는 FP 조각을 피펫하지 마십시오. <ol start="2"><li> C. -80 °에서 100 ㎕의 분취 량을 저장 </li></ol> DAY 4 4. E12.5 마우스 배아에서 척수 Commissural 뉴런의 해부 참고 :이 제제는 무균 조건 하에서 수행 할 필요가 없습니다. 배아를 수집하기 위해 위에서 설명한 절차를 따르십시오. 준비 차가운 PBS, 차가운 HBSS - 6.5 %의 포도당과 차가운 neurobasal. 4.1 척수의 해부 <ol><li> 집게를 사용하여 배아 목을 벨. </li></ol> 참고 : 아래 턱뼈와 후뇌 사이에 잘라, 후뇌의 뒤쪽 부분은 중요하다다음 단계. <ol start="2"><li> 실험에 직면 전반부와 신선한 드롭 배아 복부 얼굴을 아래로 놓습니다. </li><li> 한 집게로 태아의 피부를 조이고 다른 하나는 피부을 당깁니다. </li></ol> 주 :이 단계는 피부가 완전 배아의 앞쪽 부분에서 제거 될 때까지 반복되어야한다. <ol start="4"><li> 왼쪽에있는 태아의 전방 측을 켭니다. 한 집게로 앞쪽 부분에 배아를 &quot;아래로 핀&quot;. 다른 겸자로, 피부를 잡아 척수를 노출하는, 배아 주동이쪽으로 당긴다. </li><li> 여전히 척수를 감싸는 수막을 잘라 집게의 한면을 사용합니다. 척수는 이제 노출 열려 있습니다. </li><li> 오른쪽에있는 배아 전방 측을 배치합니다. </li><li> 배아의 자궁 경관 측면에서 시작하여 척수 조직을 분리합니다. 척수 (폐쇄 집게를 유지)에서 집게를 밀어 넣습니다. 에CEPS는 척수에서 볼 수 있어야합니다. 척수에서 작은 회전하는 운동은 인접 조직과 후근 신경절 (DRG)를 분리하기에 충분하다. </li><li> 차가운 HBSS 6.5 % 포도당의 새로운 드롭에 고립 된 척수를 전송합니다. </li><li> 평면, 멀리 실험에서 위쪽과 앞쪽 측면에 수막에 척수를 놓습니다. </li><li> 두 번째 집게가 수막을 잡아 함께, 하나의 집게로 남아있는 후뇌를 사용하여 척수를 &quot;핀 내려&quot;. 척수의 주동이의 측면에서 시작하여 수막을 벗겨. </li></ol> 4.2 Commissural 신경 해부 <ol><li> 한 집게와 후뇌 핀치. </li><li> Commissural 신경 세포는 척수 (등쪽)의 대부분의 측면 부분에 위치하고 있습니다. 미세 메스이 측면 부분을 잘라. </li></ol> 주 : 척수의 지느러미 부분 셀 (D)의 차이에 의해 복부 부분으로부터 구별 될 수있다ensity, 복부 부분이 불투명하게되고. 참고 : 동일한 품질로 양쪽을 잘라, 주동이의 측면에서 시작하여 교대로 오른쪽과 왼쪽의 작은 길이를 잘라. <ol start="3"><li> 즉시 사용을위한 얼음에 Neurobasal 매체의 해부 조직을 보존. </li></ol> 5. FP의 CM과 Commissural 조직의 치료 참고 :이 절차는 무균 조건을 필요로하지 않습니다. 조직은 각각 1.5 ML 튜브에 수집되어야한다. 냉동 FP 센티미터 한 번만 사용해야합니다. 여러 재 냉동하지 마십시오. 따뜻한 FP의 CM을 준비합니다 (37 ° C). commissural 신경의 5.1먼트 <ol><li> 작은 가위로 commissural 조직을 Dilacerate. </li></ol> 참고 : 최대한 작게 조직을 잘라 세포의 접근성을 강화시킬 수 있습니다. <ol start="2"><li> 상당히 다른 실험 조건 제어 처리 및 FP 센티미터 치료 사이의 조직을 배포합니다. </li><li> 4 ℃에서 1 분 800 XG에서 조직 조각을 원심 분리기 </li><li> 튜브 사이의 재분할을 확인합니다. </li></ol> 참고 : 조각까지 다시 필요 재분배와 원심 분리기가 동일하게 분배하는 경우. <ol start="5"><li> 뜨는을 제거합니다. </li><li> 조직에 따뜻한 FP의 CM 및 제어 처리를 추가합니다. </li></ol> 주 : 볼륨 펠렛의 양을 조절할 수 있어야하며, 적어도 두번 펠릿의 양이어야한다. <ol start="7"><li> 30 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. </li></ol> 참고 : 부드럽게 매 10 ~ 15 분을 흔들 <ol start="8"><li> 1 분 800 XG에 원심 분리기 및 처리를 제거합니다. </li><li> 용해 버퍼를 추가 </li></ol> 주 : 볼륨을 조정해야펠릿의 실장 및 적어도 두 펠릿 볼륨이어야한다. <ol start="10"><li> 최대 피펫 아래로 펠렛을 재현 탁 할 수 있습니다. </li></ol> 참고 : 와류가 또한 사용될 수있다. <ol start="11"><li> 얼음에 15 분 알을 품다. </li><li> 4 ℃에서 15 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기 </li><li> 뜨는을 유지하고 브래드 분석 (9)와 단백질의 양을 측정합니다. </li><li> 배의 램리 버퍼를 추가합니다. </li><li> 단백질 함량을 변성 5 분 동안 95 ° C에서 알을 품다. </li></ol> 참고 : 샘플은 즉시 사용할 수 있습니다 또는 -80 ° C.에 저장할 수 있습니다 <ol start="16"><li> 웨스턴 블롯 (10)에 의한 처리의 효과를 평가한다. </li></ol> 참고 : 전체 단백질의 적어도 50 μg은 각 레인에로드해야합니다.

<ol>
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바닥 판 에어컨 매체의 생산은 바닥 판 출시 신호의 생물학적 특성을 평가하기위한 효율적이고 쉬운 방법을 제공합니다. 플라즈마 트롬빈 매트릭스는 조직의 생존을위한 최상의 조건​​을 제공합니다. 그럼에도 불구하고,이 풍부한 환경 실험의 몇 가지 유형에 대한 제한이있을 수 있습니다. 따라서, 바닥 판 조직은 또한 아가 로스 매트릭스에서 배양 될 수있다. 바닥 판 에어컨 매체의 품질은 GDNF (그림 2), 쉬와 네트 린 (11)로 알려진 바닥 판 출시 신호의 검출에 의해 평가 될 수있다. 에어컨 중간에서 자신의 존재는 서양 얼룩이나 점 오점에 의해 평가 될 수있다. 이 과정에서 세포는 그 나라의 미세 환경에서 공부하고 있습니다. 이 치료에 반응 조직에있는 세포의 종류에 대한 자세한 정보를 방지 할 수 있습니다. 바닥 판은 균일 한 구조, 행동의 농도가 아니므로같은 Wnts으로 살아야 구성 요소는 rostro - 꼬리 축을 따라 해부 지역에 따라 문화 사이에 차이가있을 수 있습니다. 신선한 dilacerated 조직에 생화학은 기본 미세 세포를 연구하는 장점을 보유하고있다. 따라서, 세포의 행동은 그 나라의 상황에 맞는 12 최대한 근접하게 요점을 되풀이 조건에서 조사 하였다. FP의 cm의 효과는 또한 배양 commissural 뉴런으로 평가 될 수 있도록 등쪽 척수는 commissural 뉴런을 포함하지 않는다. 배지는 세포 및 조직 배양의 다양한 유형에 적용될 수있다. 매개 변수의 큰 범위는 세포의 정체성, 세포 생존, 세포 사멸, 세포 분화에서 평가 될 수있다. 샘플은 단백질 체학에 처리 할 수​​ 있습니다. dilacerated 신선한 조직 제제의 중요한 매개 변수는 제어 및 실험적 처리를위한 조직의 재분할이다. 그것은 수입입니다개미는 하나의 튜브에 먼저 조직을 수집하고 샘플을 분리하는 집합 전에 조직을 dilacerate 할 수 있습니다. 이것은 샘플 사이 용해 후 검출 단백질 농도의 변화를 제한한다. HBSS - 포도당이 최대 한 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. Neurobasal 또한 4 ℃에서 한 달 동안 유지 될 수있다 B27 분취 량은 최대 1 주일까지 장기 -20 ° C에서 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 플라즈마 분주은 -20 ° C에서 보관해야하며, 사용 후 다시 냉동 할 수 있습니다. 트롬빈 분취는 -20 ° C에서 저장 될 수 있고, 다시 냉동 될 수 없다.

바닥 판은 조상과 postmitotic 세포 계통의 사양에 중요한 역할을 수행하고 축삭 탐색 7,8를 제어, 개발 척수의 잘 알려진 패턴 센터입니다. FP의 CM을 생산하기 위해 여기에 설명 된 실험 절차는 수사관 세포 패턴과 생존의 세포와 축삭 이주, 발달 과정의 다양한 상황에서 바닥 판에서 파생 된 신호의 기능적 특성을 평가할 수 있습니다. 이러한 FP의 CM의 사용을 설명하기 위해, commissural 신경 세포를 포함하는 등의 척수 조직은 해부 dilacerated 및 FP의 CM로 자극된다. 조직은 웨스턴 블롯 분석을 위해 처리 될 수있다. 이 바닥 판 발매 신호에 의한 축삭지도 기계의 규정을 조사 할 수 있습니다. dilacerated 신선한 조직의 치료 방법 일 이내에 세포 미세 환경을 보존하는 큰 장점을 보유전자 조직. 따라서 FP의 cm 의해 치료 또는 치료의 종류의 영향은 세포 및 조직 배양 조건에서보다 더 많은 생리적 방법으로 평가된다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS REQUIRED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, Ca2+/Mg2+- free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14170-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-3266</td>
			<td>1mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-4648</td>
			<td>10mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes (260g/mol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E-5513</td>
			<td>0,5M pH8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCL2</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>2189</td>
			<td>1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>24388.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Protease inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04 693 116 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>distilled H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. Reagents required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TOOLS AND MATERIAL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Fine Tips forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro knives</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10136-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. Tools and material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<table border="1">
				<tbody>
					<tr>
						<td colspan="2">Dissection and FP culture</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Ethanol 70%</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>dissection hood</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>dissection microscope</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Petri dishes</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>glass coverslips</td>
						<td>18mm x 18mm</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Bunsen gas burner</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>24 well plate</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>tissue culture incubator (37&#176;C, 5% CO2, humidity controlled)</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Centrifuge</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td colspan="2">RECIPES</td>
					</tr>
					<tr>
						<td colspan="2">FP culture media</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Neurobasal</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>B27</td>
						<td>1/50e dilution from stock</td>
					</tr>
					<tr>
						<td colspan="2">HBSS - Thrombin</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>HBSS</td>
						<td>1 ml</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Thrombin 10mg/ml</td>
						<td>30 &#956;l</td>
					</tr>
					<tr>
						<td colspan="2">Lysis Buffer pH7,4</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Hepes (260 g/mol)</td>
						<td>25mM</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>EDTA (pH8)</td>
						<td>5mM</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>MgCL2</td>
						<td>1mM</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Glycerol</td>
						<td>10%</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>IGEPAL (NP40)</td>
						<td>0.10%</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
						<td>1X</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Sodium Orthovanadate</td>
						<td>0,2M</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>H2O</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td colspan="2">Laemmli Buffer</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Tris 0,5M, pH 6,8</td>
						<td>375 mM</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>SDS</td>
						<td>6%</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Glycerol</td>
						<td>60%</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>DTT</td>
						<td>0,6M</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Bromophenol blue</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>H2O</td>
						<td></td>
					</tr>
				</tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of isolated floor plate tissue and production of conditioned medium to assess functional properties of floor plate-released signals

개발하는 동안, 조상 및 사후 유사 분열 뉴런은 자신의 운명을 통제 인접 지역에서 신호를 수신합니다. 바닥 판은 복부 위치에 뇌실막 운하 안감 glial 세포의 그룹입니다. 바닥 판은 척수에있는 세포 계통의 패턴에 기여 키 morphogens을 표현한다. 나중에 발달 단계에서, 바닥 판은 commissural 축삭 1로 동측의 축삭과 제어 중간 선 횡단의 횡단을 방지하기 위해 장벽 역할을 척수에있는 축삭의 탐색을 조절한다. 이 기능은 여러지도 단서의 분비를 통해 달성된다. 다른 사람들이 현지지도 단서 2,3에 축삭의 감도를 조절하는 지침 수용체 및 다운 스트림 신호를 조절하면서 이러한 신호의 일부는 성장 축삭에 대한 유인 및 방충제 역할을합니다. 여기에서 우리는 deve을의 다양한 바닥 판 파생 된 신호의 특성을 조사 할 수있는 방법을 설명합니다바닥 플레이트 에어컨 매체 (FP의 CM) 4-6의 생산에 따라 lopmental 상황. 우리는 그 다음 축삭의 맥락에서이 FP의 cm의 사용을 예증. 첫째, 척수는 E12.5에서 마우스 배아에서 분리되어 바닥 판은 밖으로 해부 및 플라즈마 트롬빈 매트릭스 (그림 1)에서 재배된다. 둘째 이틀 후, commissural 조직은 E12.5 배아로부터 해부 분쇄 및 FP의 CM에 노출되어 있습니다. 셋째, 조직은 commissural 마커의 웨스턴 블롯 분석을 위해 처리됩니다.

Commissural 조직은 FP의 CM에 의해 처리하고, 시료는 웨스턴 블롯에있는 수용체 수준의 분석을 위해 처리되었습니다. FP의 CM의 응용 프로그램 (그림 2)을 교차 한 후 중간 선 구충제 Semaphorin3B에 commissural 축삭의 감도를 매개 안내 수용체, PlexinA1의 수준을 높일 것으로 나타났다. 이 FP에 의해 발표 신호가 PlexinA1 수준에게 4,6를 조절하는 것으로 나타났다. <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50884/50884fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50884/50884fig1.jpg" /> 그림 1. 바닥 플레이트를 분리하는 절개 절차의 계획은. 해부와 문화 과정의 다른 단계가 설명된다. 1) 배아의 머리를 잘라, 2-3)는 피부를 제거, 4) 수막을 열고, 5-6) 배아에서 척수를 제거; 7) 남자를 제거inges는, 8-9) 바닥 판을 해부, 10) FP-플라즈마 믹스 트롬빈을 추가하고 배지를 추가하기 전에 실온에서 10 ~ 15 분을 기다립니다. 11 ~ 12) 등의 뉴런을 해부, 13) 조직을 dilacerate. A : 태아의 앞쪽에 극. P : 배아의 후방 극. 화살표가 이동 방향을 묘사하는 것은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50884/50884fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50884/50884fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50884/50884fig2.jpg" /> 그림 2. 대표 결과. A) 지느러미 척추 조직을 수집 dilacerated 바닥 판 에어컨 매체 제어 매체를 자극했다. 샘플은 용해 및 웨스턴 블롯에 대한 처리되었습니다. 단백질은 항체 안티 PlexinA1과 프로빙 및 β-액틴했다. P이네는 그것의 제어 매체에 비해 점 오점이 FP에 GDNF의 식을 보여줍니다 바닥 판 에어컨 매체. B)와 CM 자극 샘플 PlexinA1 수준의 증가를 보여줍니다.

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Culture of Isolated Floor Plate Tissue and Production of Conditioned Medium to Assess Functional Properties of Floor Plate-released Signals

바닥 플레이트, 척수 개발 조상에 확산 신호를 제공하고 분화 신경의 중요한 구조이다. 우리는 바닥 플레이트 조정 배지를 생산하는 신선한 척수 조직에 적용하는, 생화학 의해 그 단백질에 영향을 평가하는 방법을 서술.

바닥 플레이트 출시 신호의 기능적 특성을 평가하기 위해 에어컨 중간의 절연 층 플레이트 조직과 생산의 문화

During development, progenitors and post-mitotic neurons receive signals from adjacent territories that regulate their fate. The floor-plate is a group of ...

culture-isolated-floor-plate-tissue-production-conditioned-medium-to

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.9K 조회수.  University of Lyon 1.  바닥 플레이트, 척수 개발 조상에 확산 신호를 제공하고 분화 신경의 중요한 구조이다. 우리는 바닥 플레이트 조정 배지를 생산하는 신선한 척수 조직에 적용하는, 생화학 의해 그 단백질에 영향을 평가하는 방법을 서술. 

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A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

문화 접시에있는 기능성 모터 단위 : 척수의 Explants와 근육 세포의 공동 문화

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

연구

신경과학

Recording Human Electrocorticographic (ECoG) Signals for Neuroscientific Research and Real-time Functional Cortical Mapping

Neuroimaging studies of human cognitive, sensory, and motor processes are usually based on noninvasive techniques such as electroencephalography (EEG), magnetoencephalography or functional magnetic-resonance imaging. These techniques have either inherently low temporal or low spatial resolution, and suffer from low signal-to-noise ratio and/or poor high-frequency sensitivity. Thus, they are suboptimal for exploring the short-lived spatio-temporal dynamics of many of the underlying brain processes. In contrast, the invasive technique of electrocorticography (ECoG) provides brain signals that have an exceptionally high signal-to-noise ratio, less susceptibility to artifacts than EEG, and a high spatial and temporal resolution (i.e., &lt;1 cm/&lt;1 millisecond, respectively). ECoG involves measurement of electrical brain signals using electrodes that are implanted subdurally on the surface of the brain. Recent studies have shown that ECoG amplitudes in certain frequency bands carry substantial information about task-related activity, such as motor execution and planning1, auditory processing2 and visual-spatial attention3. Most of this information is captured in the high gamma range (around 70-110 Hz). Thus, gamma activity has been proposed as a robust and general indicator of local cortical function1-5. ECoG can also reveal functional connectivity and resolve finer task-related spatial-temporal dynamics, thereby advancing our understanding of large-scale cortical processes. It has especially proven useful for advancing brain-computer interfacing (BCI) technology for decoding a user's intentions to enhance or improve communication6 and control7. Nevertheless, human ECoG data are often hard to obtain because of the risks and limitations of the invasive procedures involved, and the need to record within the constraints of clinical settings. Still, clinical monitoring to localize epileptic foci offers a unique and valuable opportunity to collect human ECoG data. We describe our methods for collecting recording ECoG, and demonstrate how to use these signals for important real-time applications such as clinical mapping and brain-computer interfacing. Our example uses the BCI2000 software platform8,9 and the SIGFRIED10 method, an application for real-time mapping of brain functions. This procedure yields information that clinicians can subsequently use to guide the complex and laborious process of functional mapping by electrical stimulation.
Prerequisites and Planning:
Patients with drug-resistant partial epilepsy may be candidates for resective surgery of an epileptic focus to minimize the frequency of seizures. Prior to resection, the patients undergo monitoring using subdural electrodes for two purposes: first, to localize the epileptic focus, and second, to identify nearby critical brain areas (i.e., eloquent cortex) where resection could result in long-term functional deficits. To implant electrodes, a craniotomy is performed to open the skull. Then, electrode grids and/or strips are placed on the cortex, usually beneath the dura. A typical grid has a set of 8 x 8 platinum-iridium electrodes of 4 mm diameter (2.3 mm exposed surface) embedded in silicon with an inter-electrode distance of 1cm. A strip typically contains 4 or 6 such electrodes in a single line. The locations for these grids/strips are planned by a team of neurologists and neurosurgeons, and are based on previous EEG monitoring, on a structural MRI of the patient's brain, and on relevant factors of the patient's history. Continuous recording over a period of 5-12 days serves to localize epileptic foci, and electrical stimulation via the implanted electrodes allows clinicians to map eloquent cortex. At the end of the monitoring period, explantation of the electrodes and therapeutic resection are performed together in one procedure.
In addition to its primary clinical purpose, invasive monitoring also provides a unique opportunity to acquire human ECoG data for neuroscientific research. The decision to include a prospective patient in the research is based on the planned location of their electrodes, on the patient's performance scores on neuropsychological assessments, and on their informed consent, which is predicated on their understanding that participation in research is optional and is not related to their treatment. As with all research involving human subjects, the research protocol must be approved by the hospital's institutional review board. The decision to perform individual experimental tasks is made day-by-day, and is contingent on the patient's endurance and willingness to participate. Some or all of the experiments may be prevented by problems with the clinical state of the patient, such as post-operative facial swelling, temporary aphasia, frequent seizures, post-ictal fatigue and confusion, and more general pain or discomfort.
At the Epilepsy Monitoring Unit at Albany Medical Center in Albany, New York, clinical monitoring is implemented around the clock using a 192-channel Nihon-Kohden Neurofax monitoring system. Research recordings are made in collaboration with the Wadsworth Center of the New York State Department of Health in Albany. Signals from the ECoG electrodes are fed simultaneously to the research and the clinical systems via splitter connectors. To ensure that the clinical and research systems do not interfere with each other, the two systems typically use separate grounds. In fact, an epidural strip of electrodes is sometimes implanted to provide a ground for the clinical system. Whether research or clinical recording system, the grounding electrode is chosen to be distant from the predicted epileptic focus and from cortical areas of interest for the research. Our research system consists of eight synchronized 16-channel g.USBamp amplifier/digitizer units (g.tec, Graz, Austria). These were chosen because they are safety-rated and FDA-approved for invasive recordings, they have a very low noise-floor in the high-frequency range in which the signals of interest are found, and they come with an SDK that allows them to be integrated with custom-written research software. In order to capture the high-gamma signal accurately, we acquire signals at 1200Hz sampling rate-considerably higher than that of the typical EEG experiment or that of many clinical monitoring systems. A built-in low-pass filter automatically prevents aliasing of signals higher than the digitizer can capture. The patient's eye gaze is tracked using a monitor with a built-in Tobii T-60 eye-tracking system (Tobii Tech., Stockholm, Sweden). Additional accessories such as joystick, bluetooth Wiimote (Nintendo Co.), data-glove (5th Dimension Technologies), keyboard, microphone, headphones, or video camera are connected depending on the requirements of the particular experiment.
Data collection, stimulus presentation, synchronization with the different input/output accessories, and real-time analysis and visualization are accomplished using our BCI2000 software8,9. BCI2000 is a freely available general-purpose software system for real-time biosignal data acquisition, processing and feedback. It includes an array of pre-built modules that can be flexibly configured for many different purposes, and that can be extended by researchers' own code in C++, MATLAB or Python. BCI2000 consists of four modules that communicate with each other via a network-capable protocol: a Source module that handles the acquisition of brain signals from one of 19 different hardware systems from different manufacturers; a Signal Processing module that extracts relevant ECoG features and translates them into output signals; an Application module that delivers stimuli and feedback to the subject; and the Operator module that provides a graphical interface to the investigator.
A number of different experiments may be conducted with any given patient. The priority of experiments will be determined by the location of the particular patient's electrodes. However, we usually begin our experimentation using the SIGFRIED (SIGnal modeling For Realtime Identification and Event Detection) mapping method, which detects and displays significant task-related activity in real time. The resulting functional map allows us to further tailor subsequent experimental protocols and may also prove as a useful starting point for traditional mapping by electrocortical stimulation (ECS).
Although ECS mapping remains the gold standard for predicting the clinical outcome of resection, the process of ECS mapping is time consuming and also has other problems, such as after-discharges or seizures. Thus, a passive functional mapping technique may prove valuable in providing an initial estimate of the locus of eloquent cortex, which may then be confirmed and refined by ECS. The results from our passive SIGFRIED mapping technique have been shown to exhibit substantial concurrence with the results derived using ECS mapping10.
The protocol described in this paper establishes a general methodology for gathering human ECoG data, before proceeding to illustrate how experiments can be initiated using the BCI2000 software platform. Finally, as a specific example, we describe how to perform passive functional mapping using the BCI2000-based SIGFRIED system.

Recording Human Electrocorticographic ECoG Signals for Neuroscientific Research and Real-time Functional Cortical Mapping

We present a method for collecting electrocorticographic signals for research purposes from humans who are undergoing invasive epilepsy monitoring. We show how to use the BCI2000 software platform for data collection, signal processing and stimulus presentation. Specifically, we demonstrate SIGFRIED, a BCI2000-based tool for real-time functional brain mapping.

Neuroscientific 연구 및 실시간 기능성 두피 매핑을위한 인적 Electrocorticographic (ECoG) 신호를 녹음하기

Neuroimaging studies of human cognitive, sensory, and motor processes are usually based on noninvasive techniques such as electroencephalography (EEG), ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

의 해부, 문화, 및 분석<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; 배아 망막 조직

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation of the guidance receptors is the first step of the signaling mechanisms allowing axon tips, the growth cones, to respond to the ligands. As such, the modulation of their availability at the cell surface is one of the mechanisms that participate in setting the growth cone sensitivity. We describe here a method to precisely visualize the spatio-temporal cell surface dynamics of an axon guidance receptor both in vitro and in vivo in the developing chick spinal cord. We took advantage of the pH-dependent fluorescence property of a green fluorescent protein (GFP) variant to specifically detect the fraction of the axon guidance receptor that is addressed to the plasma membrane. We first describe the in vitro validation of such pH-dependent constructs and we further detail their use in vivo, in the chick spinal chord, to assess the spatio-temporal dynamics of the axon guidance receptor of interest.

We describe here the use of a pH-sensitive green fluorescent protein variant, pHluorin, to study the spatio-temporal dynamics of axon guidance receptors trafficking at the cell surface.&#160;The pHluorin-tagged receptor is expressed both in cell culture and in vivo, using electroporation of the chick embryo.

세포 배양과 병아리 배아에서 축슨 유도 수용체의 역학을 평가하기 위해 pHluorin의 사용

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation of a given stimulus might be dependent on context and history. If this is actually the case, bi-directional interactions between the brain (or if need be a reduced model of it) and sensory-motor system can shed a light on how encoding and decoding of information is performed. Here an experimental system is introduced and described in which the activity of a neuronal element (i.e., a network of neurons extracted from embryonic mammalian hippocampi) is given context and used to control the movement of an artificial agent, while environmental information is fed back to the culture as a sequence of electrical stimuli. This architecture allows a quick selection of diverse encoding, decoding, and learning algorithms to test different hypotheses on the computational properties of neuronal networks.

In this paper, an experimental framework to perform closed-loop experiments is presented, in which information processing (i.e., coding and decoding) and learning of neuronal assemblies are studied during the continuous interaction with a robotic body.

폐쇄 루프 신경 로봇 실험은 신경 네트워크의 전산 등록을 테스트하는

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called &#8220;concentric&#8221; ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.

We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.

뇌 조직에서 측정 세포 외 이온의 신호에 대한 두 번 질주과 동심 미소 전극

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain tissue itself must be well characterized at various length and time scales. Like many biological tissues, brain tissue exhibits a complex, hierarchical structure. However, in contrast to most other tissues, brain is of very low mechanical stiffness, with Young&#39;s elastic moduli E on the order of 100s of Pa. This low stiffness can present challenges to experimental characterization of key mechanical properties. Here, we demonstrate several mechanical characterization techniques that have been adapted to measure the elastic and viscoelastic properties of hydrated, compliant biological materials such as brain tissue, at different length scales and loading rates. At the microscale, we conduct creep-compliance and force relaxation experiments using atomic force microscope-enabled indentation. At the mesoscale, we perform impact indentation experiments using a pendulum-based instrumented indenter. At the macroscale, we conduct parallel plate rheometry to quantify the frequency dependent shear elastic moduli. We also discuss the challenges and limitations associated with each method. Together these techniques enable an in-depth mechanical characterization of brain tissue that can be used to better understand the structure of brain and to engineer bio-inspired materials.

We present a set of techniques to characterize the viscoelastic mechanical properties of brain at the micro-, meso-, and macro-scales.

원자 힘 현미경, 충격 들여 쓰기 및 유변학를 사용하여 뇌 조직의 멀티 스케일 기계 속성을 특성화

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain ...

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during development, homeostasis, and disease. Although macrophages have been studied in detail for decades, specialized features of microglia, the tissue-resident macrophages of the CNS, have remained largely mysterious, in part due to limitations in the ability to recapitulate mature microglial properties in culture. Here, we illustrate a straightforward procedure for the rapid isolation of pure microglia from the mature rodent brain. We also describe serum-free culture conditions that support high levels of microglial viability over time. Microglia cultured under these defined-medium conditions exhibit elaborate ramified processes and dynamic surveillance behavior. We illustrate some effects of serum exposure on cultured microglia and discuss how these serum-free cultures compare to both serum-exposed cultures as well as microglia in vivo.

Efforts to understand microglial function in detail have been hindered by the lack of microglial culture models that recapitulate the properties of mature in vivo microglia. This protocol describes an isolation and culture approach designed to maintain robust survival of highly ramified mature rat microglia under defined-medium conditions.

절연 및 동적 홍보 설치류 Microglia의 문화 Ramified 혈 청 자유로운 매체에 있는 외관

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, a multitude of novel clearing methodologies including CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis), SWITCH (system-wide control of interaction time and kinetics of chemicals), MAP (magnified analysis of the proteome), and PACT (passive clarity technique), have been established to further expand the existing toolkit for the microscopic analysis of biological tissues. The present study aims to improve upon and optimize the original PACT procedure for an array of intact rodent tissues, including the whole central nervous system (CNS), kidneys, spleen, and whole mouse embryos. Termed psPACT (process-separate PACT) and mPACT (modified PACT), these novel techniques provide highly efficacious means of mapping cell circuitry and visualizing subcellular structures in intact normal and pathological tissues. In the following protocol, we provide a detailed, step-by-step outline on how to achieve maximal tissue clearance with minimal invasion of their structural integrity via psPACT and mPACT.

Here, we present two novel methodologies, psPACT and mPACT, for achieving maximal optical transparency and subsequent microscopic analysis of tissue vasculature in the intact rodent whole CNS.

소설 수동 전체 CNS 조직에 광학 투명도의 급속 한 생산을 위한 방법 삭제

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

Presynapse Formation Assay Using Presynapse Organizer Beads and &ldquo;Neuron Ball&rdquo; Culture

During neuronal development, synapse formation is an important step to establish neural circuits. To form synapses, synaptic proteins must be supplied in appropriate order by transport from cell bodies and/or local translation in immature synapses. However, it is not fully understood how synaptic proteins accumulate in synapses in proper order. Here, we present a novel method to analyze presynaptic formation by using the combination of neuron ball culture with beads to induce presynapse formation. Neuron balls that is neuronal cell aggregates provide axonal sheets far from cell bodies and dendrites, so that weak fluorescent signals of presynapses can be detected by avoiding overwhelming signals of cell bodies. As beads to trigger presynapse formation, we use beads conjugated with leucine-rich repeat transmembrane neuronal 2 (LRRTM2), an excitatory presynaptic organizer. Using this method, we demonstrated that vesicular glutamate transporter 1 (vGlut1), a synaptic vesicle protein, accumulated in presynapses faster than Munc18-1, an active zone protein. Munc18-1 accumulated translation-dependently in presynapse even after removing cell bodies. This finding indicates the Munc18-1 accumulation by local translation in axons, not transport from cell bodies. In conclusion, this method is suitable to analyze accumulation of synaptic proteins in presynapses and source of synaptic proteins. As neuron ball culture is simple and it is not necessary to use special apparatus, this method could be applicable to other experimental platforms.

Presynapse formation is a dynamic process including accumulation of synaptic proteins in proper order. In this method, presynapse formation is triggered by beads conjugated with a presynapse organizer protein on axonal sheets of &#8220;neuron ball&#8221; culture, so that accumulation of synaptic proteins is easy to be analyzed during presynapse formation.

Presynapse 형성 분석 전시 냅 스 주최자 구슬과 "뉴런 공" 문화를 사용 하 여

During neuronal development, synapse formation is an important step to establish neural circuits. To form synapses, synaptic proteins must be supplied in ...