이 작품은 국립 보건원 (OJTM에 KGP, OJTM 및 R01HL101972에 U54CA143906)와 오레곤 의료 연구 재단 초기 임상 연구자 상 (KGP)에서 교부금에 의해 지원되었다. OJTM는 미국 심장 협회 (American Heart Association) 설립 탐정 (13EIA12630000)입니다. 우리는이 작업에 사용 된 세포 샘플을 준비하는 나이트 암 연구소의 박사 에릭 앤더슨 감사합니다.

1. 현미경 사양 올바른 방식으로 이미징을 수행하기 위해 현미경은 다음과 같은 사양을 가지고 있어야합니다 : <ol><li> 미분 간섭 대비 (DIC) 및 시야 (BF) 대비 모두를 가지고있다. </li><li> 컴퓨터로 제어되는 Z 축 이동을해야합니다. </li><li> 집광 렌즈의 개구 수를 변경하는 조절 조리개가 있습니다. 등급 판정 규칙 또는 전자 판독 가진 조리개 개구 수의 값을 알 필요가있다. 개구 NIQPM 0.1에서 HTDIC 0.9 (또는 그 이상)까지 다양합니다. </li><li> 현미경 시야 촬상에 이용되는 협 대역 색상 필터를 가져야한다. 이 필터는 굴절 증가, NIQP에 대한 질량 밀도의 위상을 변환하는 데 사용되는 파장에 의존 골절을 해결하기 위해 필요합니다. </li></ol> 2. 미분 간섭 대비 (DIC) Z-스택 취득 <ol><li> SlideBook 소프트웨어를 엽니 다차 이미지 컬렉션에 대한 새 슬라이드를 만들 수 있습니다. </li><li> 다음으로, 초점 창을 엽니 다. 필터 설정 섹션에서, DIC를 선택합니다. 범위 탭에서, 콘덴서 섹션에서 멀리 오른쪽 위치 (모든 길을 열어)에 조리개 슬라이드 막대를 조정합니다. 이는 높은 개구 조명을 제공하고, 시료의 광학 절편을 향상시킨다. </li><li> DIC의 목표를 사용하여 샘​​플에 초점을 맞 춥니 다. 샘플이 쉽게 보일 때까지 할로겐 램프의 강도를 조절합니다. 카메라가 포화되지 않는 보장하기 위해, 초점 창에 카메라 탭을 선택하고 픽셀 세기의 히스토그램이 카메라의 동적 범위 내에 있는지 확인합니다. </li><li> 이미지 캡처 창을 엽니 다. 캡처 유형 섹션에서 3D 상자를 선택합니다. 3D 캡처 섹션에서, 센터 주변의 범위를 선택하고 현재의 위치로 돌아 가기 </strong&gt; 박스 및 Z 방향의 범위, 평면의 수 및 스텝 사이즈를 지정한다. Z-방향 범위는 전체 샘플을 포함한다. </li><li> 이미지 캡처 윈도우의 필터 설정 섹션에서 DIC의 상자를 선택하고 노출 시간을 지정합니다. 이미지 정보 섹션에서, (선택) 이미지 이름을 지정하고 영상을 시작하려면 시작을 선택합니다. </li></ol> 3. 시야 (BF) Z-스택 취득 <ol><li> 현미경은 시료의 DIC의 Z-스택을 수집 완료되면, 초점 창을 열고 필터 설정 섹션에서 열기를 선택합니다. 낮은 NA 조명을 제공하기 위해 (모든 방법을 폐쇄) 멀리 왼쪽 위치로 조리개 슬라이드 막대를 조정합니다. </li><li> 녹색으로 현미경 빛 경로 필터를 변경합니다. 샘플이 보일 때까지 할로겐 램프의 강도를 조절합니다. 선택하여 카메라의 더 채도가 없는지 확인 <st룽&gt; 카메라 초점 창에서 탭 및 픽셀 세기의 히스토그램이 지정된 범위 내에 있는지 검사합니다. </li><li> 이미지 캡처 창을 엽니 다. DIC Z-스택을 수집에서 3D 캡처 설정이 표시됩니다. </li><li> 이미지 캡처 윈도우의 필터 설정 섹션에서 열기 확인란을 선택하고 노출 시간을 지정합니다. 이미지 정보 섹션에서, (선택) 이미지의 이름, 및 Z-스택의 이미지 수집을 시작하려면 시작을 선택합니다. </li></ol> 4. Z-스택 이미지 내보내기 <ol><li> Z-스택 캡처를 엽니 다. 100 %로보기를 변경합니다. 공 사이에 표시되는 화소 값의 히스토그램 및 카메라의 최대 화소 값 (4095 12 비트 카메라, 16 비트의 경우 65,535.) 조정한다. </li><li> 보기&gt; 내보내기&gt; TIFF 시리즈를 선택합니다. 이 TIFF 이미지의 일련의 Z-스택을 내 보냅니다(각 Z 평면에 대해 하나). 말 (즉, &quot;DIC 스택 1_&quot;)의 밑줄이있는 이름으로 별도의 폴더에 TIFF 시리즈를 저장합니다. 각 DIC 또는 BF Z-스택이 작업을 반복합니다. </li></ol> 5. 볼륨 측정 <ol><li> &quot;JoVE_HTDIC_v1.m&quot;라는 제목의 HTDIC MATLAB 프로그램을 엽니 다. </li><li> HTDIC 프로그램 제 0에서 종속 디렉토리 변수를 업데이트합니다. 복사 &quot;dependencies_directory =&quot;다음 작은 따옴표 사이에있는 탐색기에서 hilbert_transform_dic.m 및 sobel_edge_detect.m 파일 (PC)를 포함하는 디렉토리를 붙여 넣습니다. JoVE_HTDIC_v1.m 프로그램의 ExecuteSection 0. </li><li> 제 1 항에서 &quot;images_directory&quot;을 업데이트합니다. 다시 말하지만, 복사 따옴표 사이에. TIF 형태를 통해 초점 이미지를 포함하는 디렉토리를 붙여 넣습니다. 만 ONCE 제 1 절을 실행합니다. </li><li> 정렬 힐버트에 대한 이미지의 회전은 실행을 코드의 2 절을 변환 할 수 있습니다. &quot;HTDIC 매개 변수 정의&quot;라는 제목의 대화 상자가 나타납니다. 다섯 번호 18RS는 사용자로부터 요구된다 : 샘플의 DIC 이미지의 초점이 초점면 번호는, 측 방향 해상도 (화상 μM / 픽셀), 축 방향의 해상도 (이 0.1 μm의 축선 단계에서 영상 획득을 위해 0.1이다), DIC 화상의 회전 각도는 힐버트 변환을 수행하기 위해 필요한, ​​전형적인 값은 45, -135이다. 마지막으로, 그 크기의 지역을 입력,이 매개 변수를 이후에 나타납니다 상자의 측면의 길이를 정의 - 일반적인 값은 400입니다. 확인을 클릭합니다. </li><li> 초점면 번호로 지정 DIC 초점면의 이미지는 청색 상자로 나타날 것이다. 셀 예를 들면, 그 기능에 상자를 배치합니다. 상자는 사각형 일 필요는 없다. 상자가 원하는 지역, 상자 안쪽을 두 번 클릭에 배치되면. </li><li> 또 다른 그림은 이제 나타납니다 :이 그림은 이전 단계에서 선택한 관심 영역의 자른 및 회전 된 이미지가 포함되어 있습니다. 화상의 콘트라스트는해야밝은 기능은 오른쪽에 표시하면서 그 어두운 기능은 왼쪽에 나타납니다. 관심 영역에 파란색 상자를 드래그하여, 필요에 따라 바꿀. </li><li> 3 장에서는 Z-스택 큐브에 대한 마스크를 생성합니다. 사각형 마스크 세포 주위에 사각형 손으로 그 셀 외곽선을 프리 핸드 툴을 만들 수 : 가능한 마스크의 두 가지 유형이 있습니다. </li><li> 직사각형 마스크의 주석 라인 167 및 주석 행 (170) (그 줄의 시작 부분에 &quot;%&quot;를 배치하여 줄을 주석으로) 생성합니다. 프로그램의 제 3 항을 실행합니다. 이미지를 클릭하고 사각형 마스크 정의를 시작하기 위해 마우스를 드래그합니다. 그것을 받아들이는 상자를 두 번 클릭합니다. </li><li> 손으로 그린​​ 마스크, 주석 행 167과의 주석 라인 (170)을 생성하고 3 절을 실행합니다. 클릭하고 마우스로 원하는 마스크를 그립니다. 그것을 받아들이는 마스크를 두 번 클릭합니다. </li><li> 힐버트를 구성 4to 실행 섹션 DIC 이미지 스택과 관심 영역의 해당 DIC 이미지 스택을 바꾸었다.3 장으로 구성 마스크는 DIC 스택과 &quot;maskON는&quot;라인 179에서 1로 설정되어 일반 DIC 스택을 변환 힐버트에 적용됩니다. 0 &quot;maskON&quot;을 설정하면 마스크를 적용하지 않고 이미지 스택을 구성합니다. </li><li> 관심 영역의 XZ의 단면 이미지의 이미지 분할을 최적화하기 위해 5 절을 실행합니다. 프로그램에 의해 생성 된 그림 500, 대조의 세 가지 유형의 표시가 나타납니다. 셀의 경계를 찾는 알고리즘의 성공은 사용 마스크 및 프로그램의 라인 (229)에서 &quot;임계&quot;값의 조합에 의존하고있다. 0.5의 값으로 시작합니다. 임계 값을 조정하고 적절한 개요이 열 중 하나에 도달 할 때까지 프로그램의이 부분을 다시 실행하십시오. </li><li> 개요는 1 열에서 가장 인 경우, DIC 이미지 분할을 사용하여 볼륨을 결정하기 위해 제 6를 사용합니다. 2 열은 최적의 결과를 제공 한 경우, 힐버트 변환 된 DIC 이미지에서 세포 부피를 결정하는 제 7을 실행합니다. 만약 3 열 GAV전자 최적의 결과를 실행 제 8 푸리에 필터링 힐버트 변환 된 DIC 이미지를 사용하여 볼륨을 결정합니다. </li><li> 입방 μM (FL)에보고 된 샘플의 부피는 측정, 체적 측정이 선택에 따라 프로그램에 의해 생성 된도 600, 700, 또는 800의 표제로 표시된다. </li></ol> 6. 질량 측정 <ol><li> &quot;JoVE_NIQPM_v1.m&quot;라는 제목의 NIQPM MATLAB 프로그램을 엽니 다. </li><li> NIQPM 프로그램 제 0에서 프로그램을 실행하는 데 필요한 세 개의 디렉토리의 위치를​​ 업데이트합니다. 이들은 &quot;dependencies_directory,&quot; &quot;brightfield_directory&quot;및 아르 &quot;dic_directory.&quot; </li><li> 다음, 제 1 항을 실행합니다. 이 코드 부분은 이미지의 전체 세트의 전체 필드의 시야 이미지 큐브를 생성합니다. 만 ONCE 제 1 절을 실행합니다. </li><li> 다음으로, 제 2를 실행합니다. &quot;NIQPM 매개 변수 정의&quot;라는 제목의 대화 상자가 나타납니다. 네 개의 숫자는 사용자의 필요 : 초점면 번호 위치의 시야 이미지샘플에 초점이, 측 방향 해상도 (화상 μM / 픽셀), 축 방향의 해상도 (이 0.1 μm의 축 단계로 화상 취득을 위해 0.1이다) 및 그 크기의 영역은,이 파라미터의 변의 길이를 정의 이후에 나타납니다 상자 - 일반적인 값은 200입니다. 확인을 클릭합니다. </li><li> 초점면 번호로 지정 시야 초점 평면의 이미지는 파란색 상자로 표시됩니다. <ol><li> 이미지에 포커스가없는 경우, 파란색 상자를 다시 실행 2 절에서 두 번 클릭하여 대화 상자에서 초점면의 수를 조정해야합니다. </li><li> 이미지의 초점이있는 경우, 이미지의 주위에 파란색 상자를 끌어 상자의 노드를 선택하고 필요에 따라 끌어 크기를 조정합니다. 셀 예를 들면, 그 기능을 주위에 상자를 배치합니다. 상자는 사각형 일 필요는 없다. 그것을 받아들이는 상자 안쪽을 두 번 클릭합니다. </li></ol></li><li> 다음으로, 실행 시야 이미지의 스택을 구성하는 제 3 절에서의 영역으로 자른의 terest. </li><li> 위상지도, 의사 DIC 이미지, 그리고 시야의 이미지와 실제 DIC 이미지에 대한 비교를 생성하려면, 섹션 4를 실행합니다. </li><li> 의사와 DIC와 질량 밀도지도, 전체 질량 및 세포 밀도의 히스토그램 최대한 유사 진정한 DIC 이미지 섹션 5A 또는 5B를 실행함으로써 결정될 수있다. 라인 300에 최적화 &quot;임계 값&quot;- - 섹션 5A 필드의 자동 보더 검출을 수행 일반적인 값은 0.1 ~ 1 사이에 다릅니다. 임계 값을 최적화하기 위해 필요에 따라이 부분을 다시 실행하십시오. 사용자가 관심있는 셀을 설명 후 절 (5b)는 등의 질량 측정을 수행한다. </li></ol>

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T., Wax, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-interference-channel+quantitative-phase+microscopy+of+live+cell+dynamics.">Dual-interference-channel quantitative-phase microscopy of live cell dynamics.</a> Opt. Lett. 34, 767-769 (2009).</li><li>Popescu, G., Park, Y., Lue, N., Best-Popescu, C., Deflores, L., Dasari, R. R., Badizadegan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+cell+mass+and+growth+dynamics.">Optical imaging of cell mass and growth dynamics.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 295, (2008).</li><li>Arnison, M. R., Cogswell, C. J., Smith, N. I., Fekete, P. W., Larkin, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+Hilbert+transform+for+3D+visualization+of+differential+interference+contrast+microscope+images.">Using the Hilbert transform for 3D visualization of differential interference contrast microscope images.</a> J. Microsc. 199, 79-84 (2001).</li><li>Baker, S. M., Phillips, K. G., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+label-free+imaging+technique+for+the+quantification+of+thrombus+formation.">Development of a label-free imaging technique for the quantification of thrombus formation.</a> Cell. Mol. Bioeng. 5, 488-492 (2012).</li></ol>

저자가 제시하는 일에 금전적 이해 관계가 없습니다.

일반적으로, NIQPM는 0.25-44.7에 이르기까지 광학 경로 길이에 대한 유효성을 검사 회절 제한 기술이다. 유효성 검사가 N에서 수행 하였다 = Fluoromount G 현탁 0.11-9.8 μM에서 직경 이르는 1.596 폴리스티렌 구체 (데이터는 도시되지 않음). 세포는 거의 0-7 범위의 광학 경로 길이를 가지고있다. 시편의 밀도 분포를 측정 할 때 하나는 밀도지도 원치 않는 기여를 보유하는 동안 의사 DIC ?...

광학 현미경의 사용은 이제 세포 생물의 조사에 유비 쿼터스입니다. 때문에 가시 광 스펙트럼을 통해 자신의 낮은 내생 흡수 약한 산란 특성에, 세포는 강하게을 통과하는 광 파의 진폭에 영향을 미치고, 따라서 표준 밝은 필드 현미경으로 몇 군데 때 반투명 표시되지 않습니다. 셀룰러 시험편은, 그러나, 선형 광이 이동하는 공간을 통해 특정 영역에있는 로컬 질량 밀도의 양에 관련된 방법들을 통해 여행 광파를 느리게 않는다. 이 이기종 시간 지연 또는 현미경 표본을 통해 전송 광 파도의 &quot;단계&quot;프로파일의 활용 먼저 프리츠 제르 니케 (1)에 의해 1935 년에 기술 된 실험적 Zernikein 1942 (2)에 의해 실현되었다. 니케는 이러한 성과에 대해 1953 년 노벨상을 수상했다. 혈구 1945 년 3이 양상을 상용화. 1955 년 스미스와 Nomarsk내가 미분 간섭 대비 (DIC) 현미경, 반대로기구로서 위상의 공간 구배를 사용하는 양상의 사용 4와 5의 이론에 자신의 초기 작품을 것입니다. DIC는 노멀 스키 6 1965in 긴밀한 협력 혈구에 의해 상용화되었다. 1981 년, 두 연구소는 DIC 현미경 7, 8의 광학 기차에 비디오 카메라의 장착으로 처음으로 기록 된 살아있는 세포 DIC 이미지를 보여 주었다. 라이브 세포 이미징의 시대가 탄생했습니다. 이 시간 이후, 상업 현미경에 위상 콘트라스트 및 DIC 모두의 실행은 큰 변화가 있었다. 형태, 세포 내 구조의 추적 및 멤브레인 역학 9의 조사 모니터링 :이 방법은 주로 정성적인 목적을 위해 세포의 이미지를 생산하는 생물 학자들에 의해 사용된다. 이 기술은 위상과 DI 모두 그들의 &quot;기성&quot;구성에서 질적C 이미지는 임의의 광원 강도의 함수, 조명 광학계 설정 및 CCD 카메라 이득, γ, 및 노출 설정이다. 물리학 자 및 광학 엔지니어의 작은 군단 상업 영상 기법으로 정량적하기 위해 노력하고있다. 첫 번째 노력 중 의사 출신 생물 물리학 자 로버트 Barer 시중에서 위상 현미경을 사용하여 이러한 종류의 세포를 통해 위상 변화를 추정하여 세포의 세포 건조 질량을 결정하는 위상 현미경의 사용을 입증하는 1952 년 1953 년 자연에 두 글자가 있었다 10, 11. 위상 현미경 10, 11, DIC 현미경 12-17, 광학 경로 길이, 상, 질량을 결정하는 시야 18 ~ 22 : 필드는 세 가지 기본 레이블이없는 반면 메커니즘을 기반으로 다음의 몇 년 동안 기술의 다수를 개발했다 밀도, 굴절률, 및 셀룰러 볼륨. 파라의llel, 사용자 정의 광학 기기의 큰 컬렉션은 1950 년대부터 개발되었으며, 기생충의 성장 (23) 응용 프로그램에서, 적혈구 (25)의 막 역학 조사에 세포주기 (24)를 문서화에 이르기까지 광학 측정 광범위한 만들었습니다. 특히, 지난 10 년 회절 위상 현미경 (26)의 형태, 단층 위상 현미경 (27), 디지털 홀로그램 현미경 28 단계 민감한 빛 간섭 현미경 29, 공간 광 간섭 현미경 (30), 힐버트에 라벨이없는 양적 현미경의 부를 볼 수있다 위상 현미경 31, 정량적 위상 현미경 32. 그들의 집단의 성공에도 불구하고,이 악기는 복잡한 장비 및 전산 요구 사항을 대부분, 때문에 생물학적 연구의 큰 분야에 전파되지 않았습니다. 여기에서 우리는 거라고명 시야 및 DIC 이미지에서의 조합을 통해 질량, 부피, 및 세포 검체에 대한 밀도의 정량 측정을 수행하기 위해 표준 광학 현미경의 사용을 방접원을 그리다. 두 가지 주요 접근법이 제시된다 : noninterferometric 정량적 위상 현미경 (NIQPM)는 전체 세포 덩어리 및 세포 내 밀도 분포의 측정을 수행하고, 힐버트 볼륨을 결정하기 위하여, 미분 간섭 콘트라스트 현미경 (HTDIC)을 변형. NIQPM 및 HTDIC의 주요 장점은 자신의 기술 접근​​성에 누워. 성공적인 실행에 필요한 촬상 조건은 대부분 시판 현미경의 정상 작동 범위 내에있다. 또한, 포스트 - 프로세싱 알고리즘이 안정된 퀵하고 견고 - 가능한 고속 푸리에 변환 (FFT) 기반 알고리즘을 사용하여 변환 MATLAB에서 구현 된 것으로. NIQPM 위상 및 CEL의 축 방향으로 집적 질량 밀도를 재구성하는 방법시야 이미지에서 lular 표본. 시험편의 면적 이상이 축 방향으로 집적 질량 밀도의 합산 시편의 총 건조 물질 함량을 준다. 이 셀의 위상 프로파일이 샘플을 통해 초점 시야 이미지에서 재구성 될 수 있다는 것을 입증되었던 - - NIQPM 프로토콜 Paganin 및 전트 (18, 19)에 의해 마련 실험적 토대에 기반하고 프랭크의 이론적 작품 , Altmeyer과 베르 니케 20 - 효율적인 FFT 기반 방식으로 근축 파 모델을 해결하십시오. 건조 질량 밀도상의 연결 Barer 10, 11 및 페스 쿠 (33)에 의해 워크에 기초한다. 체적 정보는 광축을 따라 시험편의 광학 절편을 활성화 높은 NA 조명 조건 하에서 관통 포커스 DIC 이미지에서 얻을 수있다. 힐버트 DIC 이미지 스택에서 변환 처리를 크게 향상배경의 사람들의 표본 강도의 회색 값을 구분하여 세 가지 차원에서 표본 국경의 지역화를위한 에지 검출 알고리즘. 우리가 대조 샘플의 자동화 된 체적 분석을위한 기반 소벨 에지 검출 방법을 향상시키기 위해 두 푸리에 필터링 방법을 도입하고 있지만이 작품 Arinson 외. 34 유래. 우리는 또한 회절 한계에서 최대 직경이 36에서 20 μm의 크기에 이르기까지 폴리스티렌 분야에서 이전에 HTDIC을 확인했다. NIQPM 및 HTDIC 모두 상용 현미경에 자신의 발전으로 인하여 기술적으로 액세스 할 수 있지만, 방법은 근본적 현미경 자체의 하드웨어 구성에 의해 제한된다. 이러한 기술의 주요 제한은 두 가지이다 : 반대로 인해 전체 시료 스테이지의 변환에, 상업용 스코프 느린 Z-스택 획득 시간 그대로 대물 렌즈를 행현재 빠른 약 1 프레임 / 분 이상 현상의 조사를 제한하고 둘째, 회절 효과는 각각 직경 10, 20 μm의 0.2에서 크기에 이르기까지 개체에 NIQPM 및 HTDIC의 유틸리티를 제한합니다. 따라서 관심의 표본과 관련 시간의 역학은 일반적으로 &quot;기성&quot;악기에 이러한 방법의 사용을 가능하게하기 위해 특정 크기와 시간 제약 조건을 충족해야합니다. 호쾌하게, 대부분의 고정 된 세포 표본은 쉽게 이러한 방법으로 조사 하였다. NIQPM 및 HTDIC 프로토콜의 개요를 그림 1에 나타내었다. 도 2에서 우리는 시야 및 DIC 이미징 모두 낮고 높은 두 NA 조명 조건 하에서 최적 및 차선 관통 포커스 이미징을 도시한다. 3,4 성공 및 실패의 구현을 강조 NIQPM 알고리즘의 파라미터 의존성을 보여 피규어. <strong&gt;도 5는 HTDIC 화상 처리 알고리즘에 관련된 단계를 도시 및 세포 용적을 결정하는 알고리즘의 최적 구현을 보여준다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="675">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager 2 microscope</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td>
			<td>Axio Imager D2</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green filter (&#955; = 540 &#177; 25 nm)</td>
			<td>Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont</td>
			<td>D540/25x</td>
			<td>Green filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBook 5.5 software</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado</td>
			<td></td>
			<td>Image acquistion software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microspheres</td>
			<td>Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN</td>
			<td>PS06N</td>
			<td>Polystyrene spheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech, Birmingham, Alabama</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative optical microscopy: measurement of cellular biophysical features with a standard optical microscope

우리는 밝은 필드와 미분 간섭 콘트라스트 이미지의 조합을 통해 질량, 부피, 및 세포 검체에 대한 밀도의 정량 측정을 수행하기 위해 표준 광학 현미경을 사용하는 방법을 설명한다. 두 가지 주요 접근법이 제시된다 : noninterferometric 정량적 위상 현미경 (NIQPM)는 전체 세포 덩어리 및 세포 내 밀도 분포의 측정을 수행하고, 힐버트 볼륨을 결정하는 차동 간섭 콘트라스트 현미경 (HTDIC)을 변형. 낮은 개구 수 (NA) 조명, 약한 산란 및 표본에 의한 빛의 약한 흡수 : NIQPM는 전파의 단순화 된 모델을 기반으로, 세 가지 기본 가정으로, 근축 근사라고합니다. 다행히, 흠없는 세포 표본은 이러한 가정을 만족하는 낮은 NA 조명 쉽게 상용 현미경에 달성된다. HTDIC 높은 NA의 illumin 아래를 통해 초점 DIC 이미지에서 체적 정보를 얻는 데 사용됩니다ATION 조건. 높은 NA 조명 광축을 따라 시험편의 향상된 절편을 가능하게한다. 힐버트 DIC 이미지를 변환 처리가 크게 스택 배경의 사람들의 표본 강도의 회색 값을 구분하여 세 가지 차원에서 표본 국경의 현지화 에지 검출 알고리즘을 향상시킵니다. NIQPM 및 HTDIC의 주요 장점은 &quot;기성품&quot;현미경을 사용하여 자신의 기술 접근​​성에 누워. 상용 범위에 느린 Z-스택 획득 시간은 빨리 1 프레임 / 분 이상 현상의 조사를 abrogates, 둘째, 회절 효과는 최대 10 0.2에서 개체에 NIQPM 및 HTDIC의 유용성을 제한하는 이러한 방법의 두 가지 기본 제한이 있습니다 각각 (NIQPM) 직경 20 (HTDIC) μm의. 따라서, 그 시험편과 연관된 시간 역학 이러한 방법의 사용을 가능하게하기 위해 특정 크기 및 시간 제약을 충족시켜야한다. 호쾌하게, 대부분의 고정 cellula연구 표본은 쉽게 이러한 방법으로 조사 하였다.

를 통해 초점 이미지 수집하는 동안 올바른 샘플 조명 NIQPM 차 HTDIC 알고리즘의 성공적인 구현에 매우 중요합니다. 그림 2에서 우리는 DIC와 폴리스티렌 구와 인간의 대장 선암 세포주 SW620에 대한 시야 대비 모두에서 낮은 높은 NA 조명을 보여줍니다. 2A 피규어, 2C, 2I, 그리고 2K가 NIQPM에 대한 최적의 영상을 보여줍니다. 2 층 2H 피규어, 2N 및 2P는 HTDIC?...

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Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

양이 광학 현미경 : 세포 생물 물리학의 측정​​ 표준 광학 현미경과 특징

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

quantitative-optical-microscopy-measurement-cellular-biophysical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.4K 조회수.  Oregon Health & Science University, School of Medicine. We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

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Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

입체 광학 해상도 Photoacoustic 현미경

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

연구

생체공학

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

세포 융합의 탐지를위한 Cre - 훈제 연어 P 재조합 접근법 VIVO에서</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

기본, 섬유 긴 간격 및 Segmental 긴 간격 콜라겐의 체외 합성에

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

운모의 준비 고해상도 광학 현미경 이미징 지질 이중층 지원

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

위한 도구로 리포좀 캡슐화 된 근적외선 형광의 형광 담금질<em&gt; 생체</em&gt; 광학 이미징

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

물방울 미세 유체에 대한 여러 가지 빛깔의 형광 검출 광학 섬유를 사용하여

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

액정 나노 입자 캐리어의 소수성화물 캡슐화의 대상 플라즈마 멤브레인 배달

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By replicating the imaging environment, costly animal experiments to validate a technique may be circumvented. Predicting and optimizing the performance of in vivo and ex vivo imaging techniques requires testing on samples that are optically similar to tissues of interest. Tissue-mimicking optical phantoms provide a standard for evaluation, characterization, or calibration of an optical system. Homogenous polymer optical tissue phantoms are widely used to mimic the optical properties of a specific tissue type within a narrow spectral range. Layered tissues, such as the epidermis and dermis, can be mimicked by simply stacking these homogenous slab phantoms. However, many in vivo imaging techniques are applied to more spatially complex tissue where three dimensional structures, such as blood vessels, airways, or tissue defects, can affect the performance of the imaging system. 
This protocol describes the fabrication of a tissue-mimicking phantom that incorporates three-dimensional structural complexity using material with optical properties of tissue. Look-up tables provide India ink and titanium dioxide recipes for optical absorption and scattering targets. Methods to characterize and tune the material optical properties are described. The phantom fabrication detailed in this article has an internal branching mock airway void; however, the technique can be broadly applied to other tissue or organ structures.

Optical tissue phantoms are essential tools for calibration and characterization of optical imaging systems and validation of theoretical models. This article details a method for phantom fabrication that includes replication of tissue optical properties and three-dimensional tissue structure.

제조 및 Macrostructure를 포함 하는 광학 조직 팬텀의 특성화

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. Traditional light-sheet techniques involve the use of a single illumination beam directed orthogonally at sample tissue. Images of large samples that are produced using a single illumination beam contain stripes or artifacts and suffer from a reduced resolution due to the scattering and absorption of light by the tissue. This study uses a dual-sided illumination beam and a simplified CLARITY optical clearing technique for the murine heart. These techniques allow for deeper imaging by removing lipids from the heart and produce a large field of imaging, greater than 10 x 10 x 10 mm3. As a result, this strategy enables us to quantify the ventricular dimensions, track the cardiac lineage, and localize the spatial distribution of cardiac-specific proteins and ion-channels from the post-natal to adult mouse hearts with sufficient contrast and resolution.

This study uses a dual-sided illumination light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) technique combined with optical clearing to study the murine heart.

Murine 심장 연구에 대 한 빛-시트 형광 현미경 검사 법

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

실시 한 형광 현미경으로 여러 영상 모드

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

양이 광학 현미경 : 세포 생물 물리학의 측정​​ 표준 광학 현미경과 특징

양이 광학 현미경 : 세포 생물 물리학의 측정 표준 광학 현미경과 특징