보조금 지원 : NIH CA165263, NIH CA150197, NIH CA150197S1 (HJ 쿵), NIH CA150197S1 (CA Changou), 바이오 포토닉스 과학 &amp; 기술 (DL 울프슨, FYS 추앙), DOD PC073420 (RJ 굵게)에 대한 NSF PHY-0120999 센터, 연구 노르웨이 의회, Leiv 에릭손 여행 그랜트 209286/F11 (BS Ahluwalia는). HJ 쿵푸는 오번 커뮤니티 암 기부 기금의 지원을 인정합니다. RJ 굵은는 J. 맥도날드 기부금의 지원을 인정합니다. 우리는 ADI의 관대 한 공급 박사 제니 웨이 - 젠 쿵푸와 DesigneRx 박사 보르 - 원자바오 우 감사합니다.

1. 1 부 : 세포 배양 및 면역 형광 라벨링 <ol><li> 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 글루타민을 포함하는 RPMI (Mediatech, VA) 6 - 잘 접시에 배치 유리 coverslips는 (# 1.5 170 μm의 두께)에 CWR22 RV1 인간의 전립선 암 세포를 성장. </li><li> 인산염 완충 식염수 (PBS)에있는 아르기닌 deiminase (ADI, 0.3 ㎍ / ㎖)를 선택한 샘플을 처리하여 autophagy를 유도. </li><li> RT에서 10 분 동안, coverslip에 100 μL, PBS에 희석 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA, 피셔 과학, NH)로 세포를 고정합니다. </li><li> 1 ML HBS / BSA와 배 세포를 씻으십시오. </li><li> RT에서 15 분 HEPES (HBS) / BSA, coverslip에 100 μL, 0.05 %의 사포닌 (시그마, MO)로 세포를 Permeabilize. </li><li> 이전 면역 라벨, HBS / BSA, coverslip에 100 μL, 2.5 % 카제인 (시그마, MO)와 실온에서 1 시간 동안 블록 샘플을합니다. </li><li> 2.5 % 카제인 / HBS / BSA, coversl 당 100 ㎕의 희석 일차 항체 고정 된 세포를 배양4에서 IP, O / N ° C. </li><li> 1 ML HBS / BSA와 배 세포를 씻으십시오. </li><li> RT에서 1 시간 동안 2.5 % 카제인 / HBS / BSA, coverslip에 100 ㎕의 희석 차 항체 고정 된 세포를 품어. </li><li> 1 ML HBS / BSA와 배 세포를 씻으십시오. </li><li> SlowFade 골드와 일반 유리 현미경 슬라이드에 준비의 coverslips를 탑재, 4를 포함하는 골드 antifade 시약 (Invitrogen 사, CA) &#39;,6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI)을 연장. </li><li> 매니큐어와 씰 coverslip을 사용하면 가장자리. 최고의 이미징 결과를, 반대로 퇴색 미디어 시간 (이상적으로 O / N) 철저하게 세포를 침투 할 수 있습니다. </li><li> 메탄올 및 / 또는 클로로포름 깨끗한 coverslip을 표면. </li><li> 침수 오일 (굴절률 1.520 영상 37 ° C, 또는 1.516 RT에서 영상) 60X 1.42 NA 대물 렌즈 (올림푸스, 일본) 있습니다. 추가 </li><li> 위치 현미경 무대에 슬라이드와 관심의 세포로 포커스를 설정합니다. </li></ol> 2. 2 부 : 라이브 영상을위한 준비 세포 <ol><li> CWR 성장35mm 폴리 - D - 라이신 코팅 유리 바닥 문화 요리 (MatTek, MA)에 10 % FBS와 1 % 항생제가 포함 된 RPMI 배양액에서 녹색 형광 단백질 결합 라이트 체인 3 (LC3-GFP)을 발현 22 RV1 세포. 세포는 빠르게 증식을 촉진하기에 충분한 밀도로 도금,하지만 너무 많은 세포가 자란 및 이미징의 시간에 응집 것을.해야한다 </li><li> PBS의 ADI (0.3 ㎍ / ㎖)을 선택한 셀 샘플을 처리합니다. </li><li> 영상에 앞서 약 1 시간이 LysoTracker 레드 DND-99 (Invitrogen 사, CA) 20 ML RPMI의 1.5 μl를 희석. 10 % FBS와 1 % 항생제를 포함. 선택한 샘플에 대한 ADI를 포함하는 솔루션을 사용합니다. ° C 전에 배양 접시에 추가하기 37 모든 미디어를 따뜻하게. </li><li> RPMI 37 ℃에서 15-45 분간 LysoTracker 레드 DND-99을 함유 세포를 배양 </li><li> 영상에 앞서 약 30 분, 웨더 환경 인클로저를 켜고 37 평형 할 수 있도록 ° C와 5 % CO 2 (humidif로처음 엔 공기). </li><li> PBS로 세포를 씻어 표준 RPMI는 10 % FBS와 1 % 항생제가 포함 된 용지를 교체하십시오. 표시된대로 샘플 ADI를 추가합니다. </li><li> 마운트 35mm는 커버 글라스 바닥 문화 정의 어댑터 (정밀, 주식, 워싱턴 적용)의 요리, 그리고 현미경 단계에 위치. 60X 1.42 NA의 대물 렌즈에 침수 오일 (굴절률 1.520)를 사용하고, 무대에 탑재 된 배양 접시를 놓습니다. </li></ol> 3. 제 3 부 : 디컨 볼 루션 현미경 및 분석 이 섹션의 프로토콜은 DeltaVision 개인 DV의 디컨 볼 루션 현미경 및 관련 SoftWorX 응용 프로그램 제품군 (응용 정밀, 주식 회사, WA)의 사용을 가정합니다. <ol><li> 취득 워크 스테이션과 악기 컨트롤러를 포함, 현미경 시스템을 켭니다. 크세논 광원에서 현미경 스테이지 및 회전을 초기화하는 Resolve3D 응용 프로그램을 엽니 다. 따뜻하게하고 안정 상태에 도달하는 광원 10 분을 허용합니다. </li><li> 추가침수 기름의 드롭 60X 1.42 NA의 대물 렌즈와 대물 렌즈를 통해 센터 슬라이드 표본 (아래 커버 슬립 얼굴)에 (37 라이브 샘플에 대한 굴절률 1.520 ° C 또는 실온에서 고정 된 샘플 1.516). </li><li> 침수 기름의 구슬 거꾸로 커버 유리와 접촉 할 때까지 두 시야 또는 외부 조명과 거친 초점 조절 노브를 사용하여, 천천히 대물 렌즈를 올립니다. (이 시점에서, 세포 층은 미세 초점 노브를 조정하는 몇 회전에서 초점이되어야합니다.) 슬라이드에 고정 된 샘플로 작업 할 때, 그것은 거품 모든 지역 내 또는 주변 세포를 방지하는 것이 좋습니다. 유리 바닥 접시에 살고 샘플 볼 때, 유리 coverslip에의 경계 외부의 대물 렌즈를 이동하지 마십시오. </li><li> Autophagosomes은 EGFP 신호 (녹색)에 의해 식별 할 수 있습니다. 리소좀은 LysoTracker 레드 (실시간 샘플) 또는 방지 램프 1 형광 항체 (고정 샘플)에 의해 식별됩니다. 세포 핵은 DAPI 성으로 식별됩니다(고정 샘플) aining. </li><li> 보기 원하는 필드를 선택합니다. 이상적으로, 세포가 적절한 모든 채널에서 좋은 형광 신호를 전시하며, 충분히 부착 세포 내용을 시각화하기 쉬운 수 있도록 coverslip을 표면에 확산. 측면 X, Y 및 Z 초점의 작은 조정은 Acquire3D 인터페이스를 사용하여 컴퓨터에 의해 제어 할 수 있습니다. 보기 원하는 필드 (더 많은 세포가 비닝 (binning)는 2 × 2로 설정되는 필드에서 볼 수있다)에 따라, 1X1 또는 2 × 비닝 (binning)을 설정합니다. </li><li> 셀의 중앙부를 통해 지정된 이미지의 경우 최대 픽셀 강도는 3,000 수를 초과하지 않는 등 노출 매개 변수 (예 : % 전송 전력 및 노출 시간)을 설정합니다. 일반적으로, % 전송은 1 초에 해당하는 노출 시간을 발생시키지 않고, 가능한 한 낮게 설정해야합니다. 최고 품질의 이미지를 얻기 위해 이미지에 표시 할 모든 형광 색상 및보기의 각 개별 필드에 대해이 절차를 반복합니다. </li><li> U를 설정각각의 세포 샘플의 상단과 하단에 단지 약간의 초점을 조절하여 Z-스택의 pper과 하한. 에서 이미지의 총 수는 Z-스택을 제공함으로써 이러한 제한에 의해 및 레이어 (0.2 μm의 기본값) 사이의 간격에 의해 결정됩니다. </li><li> 이미지 수집 중에 모션 아티팩트를 최소화하기 위해, 우리는 고정 샘플 &quot;그 파장 Z-스택&quot;및 &quot;다음에 z 스택 파장&quot;라이브 샘플로 이미지 획득 모드를 설정하는 것이 좋습니다. </li><li> 형광 이미지는 SoftWorX (응용​​ 정밀, WA)를 사용하여 deconvolved 이상 (퍼킨 엘머, MA 지금, 순발력) VoloCITY를 사용하여 분석됩니다. </li></ol> 4. 제 4 부 : 최고 해상도, 구조적 조명 (OMX) 현미경 이 섹션의 프로토콜은 OMX 구조적 조명 현미경의 사용 (응용 정밀, WA)에 적용됩니다. <ol><li> 주 전원 원하는 레이저 (410 nm의 488 nm의, 및 / 또는 532 nm의)에 전환합니다. 20 마일 기다립니다N 레이저 용 열 안정 수 있습니다. </li><li> 60X 1.42 NA의 대물 렌즈에 침수 오일 (RT에서 고정 된 샘플에 대한 굴절률 1.516)를 추가합니다. 거품이 기름 방울을 볼 경우, 목표를 청소하고 다시 오일을 추가합니다. </li><li> 무대에서하고 필요한 경우 샘플 슬라이드를 배치, 셀의 10 분은 coverslip을에 정착 할 수 있습니다. </li><li> 취득 프로그램을 초기화합니다. 셀의 날카로운 윤곽을 볼 수있을 때까지 초점을 조절하는 형광 조명을 사용합니다. (관리는 실제 이미지 획득 할 때까지, 형광 여기에 세포의 노출을 최소화하기 위해 항상주의해야한다). </li><li> 나선형 모자이크 스캔이 관심의 세포 나 지역을 선택하려면 샘플의 큰 영역을 미리 취득 할 수 있습니다. 이 샘플을 스캔 또는 대상을 찾는 동안 짧은 노출 시간 (1-10 밀리 초) 및 낮은 구동 전력 (0.1-1 % 전송)를 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> GFP-LC3의 형광에 의해 autophagosomes를 식별합니다. 알렉사 플 루어 555 안티 LAMP에 의해 리소좀을 식별(리소좀 - 관련 막 단백질)와 DAPI를 (고정 샘플)를 사용하여 세포 핵. </li><li> 여기 파장, 이미지 영역 (예를 들어 512x512 크기) 스택의 두께, 노출 시간 및 레이저 전송 비율 등의 실험 조건을 선택합니다. 슈퍼 해결 이미지의 구조화 된 조명 옵션이 활성화되어 있는지 확인합니다. OMX의 디컨 볼 루션 현미경, 기존 조명 옵션을 선택합니다. </li><li> 최고의 재건 결과, 최대 강도 계수가 획득 동안 10,000에서 15,000 명 사이가되도록 실험 조건을 선택합니다. photobleaching에이 문제가되는 경우, 낮은 노출 (5,000 ~ 10,000 사이의 카운트)의 이미지를 사용할 수 있습니다. 이상적으로, 수는 전체 수집 기간 동안 2 배 이상 감소하지 말아야하며, 네 배 이상에 의한 감소는 피해야한다. 필요한 경우, 지속적인 강도 수를 보장하기 위해 스택 두께를 줄일 수 있습니다. 카메라에 너무 최대 64,000 카운트에 포화긴장이를 초과해서는 안됩니다. 좋은 샘플을 위해, 우리는 1 % 레이저 전송을 10으로 실험 조건 ~ 50 밀리 초 노출 시간을 발견했다. 반복적으로 이미지화 할 수있는 밝고 photostable 샘플이 바람직하다. 안정 얼룩은 시간 경과, 슈퍼 해결할 이미지가 필요합니다. </li><li> 소음, 95MHz 판독 속도 (중간 속도 옵션), 2 밀리 이상 획득 시간을 단축하는 것이 좋습니다. 증가 된 유물은 샘플 수집하는 동안 이동 재구성 군데에서 얻을 수 있습니다. 이 영향으로 인해, 짧은 노출은 비 부착 또는 빠르게 움직이는 세포를 권장합니다. </li><li> 다중 채널 영상을 동시에 또는 순차적으로 수행 할 수 있습니다. Sequential (순차) 모드 수율 적은 크로스 토크 및 따라서 권장합니다. </li><li> photobleaching에 줄이기 위해 일반적으로 첫 번째 이상 여기 파장 (다음 532 nm의 488 nm의 410 nm의)에 이미지를 권장합니다. 그러나 그림 3의 실험 결과,이 순서는 반대했다이 특정 샘플의 광 안정성으로 인해 D (즉, 48 nm의 532 nm의 410 nm의). </li><li> 세포의 위 / 아래는 초점이 약간 때까지 현미경 스테이지를 이동하여 Z-스택의 상한 / 하한을 설정합니다. 복원 소프트웨어는 기본적으로이 값을 각 이미지 사이의 원하는 거리를, 최고 해상도 이미징을위한 0.125 μm의에서 일정하게 유지되어야한다. </li><li> SoftWorX (응용​​ 정밀, WA)를 사용하여 이미지 스택을 재구성하고 VoloCITY 6.0 (퍼킨 엘머, MA)를 사용하여 분석 할 수 있습니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+deiminase+as+a+novel+therapy+for+prostate+cancer+induces+autophagy+and+caspase-independent+apoptosis.">Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis.</a> Cancer Res. 69 (2), 700-708 (2009).</li><li>Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+growth+inhibition+of+human+tumor+cells+in+culture+by+arginine+deiminase+purified+from+a+culture+medium+of+a+Mycoplasma-infected+cell+line.">Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line.</a> Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).</li><li>Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-tumor+activity+of+arginine+deiminase+from+Mycoplasma+argini+and+its+growth-inhibitory+mechanism.">Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism.</a> Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).</li><li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+by+self-digestion:+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy.">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).</li><li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion.">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li><li>Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p,+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing.">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).</li><li>Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+macroautophagy+by+mTOR+and+Beclin+1+complexes.">Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes.</a> Biochimie. 90, 313-323 (2008).</li><li>Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BH3-only+proteins+and+BH3mimetics+induce+autophagy+by+competitively+disrupting+the+interaction+between+Beclin+1+and+Bcl-2/Bcl-X(L).">BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L).</a> Autophagy. 3, 374-376 (2007).</li><li>Crighton, D., Wilkinson, S., O'Prey, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRAM,+a+p53-induced+modulator+of+autophagy,+is+critical+for+apoptosis.">DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis.</a> Cell. 126, 121-134 (2008).</li><li>Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+distribution+of+argininosuccinate+synthetase+deficiency+in+human+cancers:+a+method+for+identifying+cancers+sensitive+to+arginine+deprivation.">Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation.</a> Cancer. 100, 826-833 (2004).</li><li>Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+transfer+of+HIV-1+via+virological+synapses+leads+to+endosomal+virion+maturation+that+activates+viral+membrane+fusion.">Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion.</a> Cell Host &amp; Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).</li><li>Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structured+illumination+microscopy+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrations.">Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations.</a> J. Struct. Biol. 171 (3), 382-388 (2010).</li><li>York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+live,+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy.">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).</li><li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination.">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Method. 8 (12), 1044-1046 (2011).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

LC3에 대한 형광 프로브로 표시된 세포의 직접 관찰이 널리 자식 작용 반응 6, 양적 3D 동일한 시스템 (우리가했던 것처럼)의 영상 세포 자식 작용의 복잡한 과정에 대해 전례없는 정보와 세부 정보를 제공합니다 확인하는 표준 방법으로 인정되고 있지만 . 특히, 우리는 살아있는 세포에있는 autophagosomes의 수백 (수천하지 않을 경우) autophagy를 유도 80 분 내에 형성되는 것을 관찰합니다. 마찬?...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine Deiminase (ADI)</td>
			<td>DesigneRx</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5890</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>4042</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4521</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa anti-mouse 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21422</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa anti-rabbit 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21244</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LysoTracker Red DND-99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L7528</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Lamp1</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>H4A3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Cadherin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#3195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlowFade Gold</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S36936</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35GC-1.5-1.4-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.1, 22 mm coverslip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#2865-22</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>1324G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of autophagy using advanced 3d fluorescence microscopy

수술은 발기 부전과 요실금의 중요한 위험을 수행하는 동안 전립선 암은 미국 남성들 사이 악성의 주요 형태이며, 기존의 화학 요법 방법은 대부분 실패했습니다. 호르몬 치료는 초기 단계에 효과적이지만, 종종 호르몬 불응 성 종양의 최종 개발에 실패합니다. 우리는 종양 세포의 특정 대사 결핍을 대상으로 치료제 개발에 관심이있다. 우리는 최근이 전립선 종양 세포는 특히 아미노산 아르기닌 (1)의 합성에 관여하는 효소 (argininosuccinate 합성 효소 또는 ASS)를 부족했다. 이 조건은 외생 아르기닌에 의존하는 종양 세포를 원인, 무료 아르기닌은 아르기닌 deiminase (ADI) 1,10가 고갈 될 때 신진 대사 스트레스를 겪는다. 사실, 우리는 인간의 전립선 암 세포 CWR22 RV1을 효과적으로 카스파 독립적 인 세포 사멸과 적극적인 autopha과 ADI에 의해 살해되는 것으로 나타났습니다GY (또는 macroautophagy) 1,2,3. 자식 작용은 세포가 4,5 영양 기아 동안 리소좀 고장에 의해 원치 않는 단백질을 대사 할 수 있도록 진화 - 보존 과정입니다. 이 통로의 필수 구성 요소가 6,7,8,9 잘 특성화되어 있지만, 분자 기계의 많은 부분은 여전히 불분명하다 - 특히 ADI의 치료 후 전립선 암 세포의 죽음 반응에 autophagy에의 역할을 무엇인가 ? 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 세포 자식 작용 반응의 수준과 범위를 측정하는 실험 방법을 필요 - 정확하게이 과정을 추적 할 수있는 알려진 분자 마커가 없기 때문에, 우리는 사용하여 영상 기반의 접근 방식을 개발하기로 결정했습니다 양적 3D 형광 현미경 11,12. autophagosomes과 리소좀 형광 프로브를 구체적으로 표지 된 CWR22Rv1 세포를 사용하여, 우리는 3D 이미지 스택 위스콘신 중 하나에 인수 보여defield의 ​​디컨 볼 루션 현미경 (이상, 최고 해상도, 구조적 조명 현미경)은 명확하게 autophagy에 유도의 초기 단계를 캡처 할 수 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 디지털 이미지 분석 응용 프로그램과 함께, 우리는 쉽게 autophagosome과 리소좀 수, 크기, 분포 및 이미지 한 셀에서 colocalization을 정도에 대한 통계 정보를 얻을 수 있습니다. 이 정보는 우리가 정확하게 살아있는 세포의 자식 작용의 진행 상황을 추적 할 수 및 암 화학 요법 autophagy에의 역할에 대한 지속적인 조사를 할 수 있습니다.

그림 1의 이미지 시퀀스는 autophagy에 유도의 첫 80 분 동안 CWR22 세포에서 발생하는 신체적 변화를 보여줍니다. 이것과 다른 연구 (미도시)에서 우리는 일관되게 관찰 : 거리 세포의 중심에서 핵 (1) 변위, 초점 접착 점 (2) 감소, 그리고의 중심을 향해 autophagosomes와 리소좀 (3) 일반 전좌 셀. 또한, 우리는 또한 나중에 지점에서 autophagosomes (녹색)와 리소좀 (적색) 사이 colocalization을의 작은 증...

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Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

자식 작용은 세포가 단백질과 세포 소기관을 분해하고 재활용 할 수있는 유비쿼터스 프로세스입니다. 우리는 시각화하고 작은 정량화 고급 형광 현미경을 적용하지만, autolysosomes로 형성과 autophagosomes와 리소좀의 배포, 자신의 융합 등 자식 작용의 유도와 관련된 필수, 물리적 변화.

고급 3D 형광 현미경을 사용하여 자식 작용의 정량 분석

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

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17.8K 조회수.  University of California, Davis. 자식 작용은 세포가 단백질과 세포 소기관을 분해하고 재활용 할 수있는 유비쿼터스 프로세스입니다. 우리는 시각화하고 작은 정량화 고급 형광 현미경을 적용하지만, autolysosomes로 형성과 autophagosomes와 리소좀의 배포, 자신의 융합 등 자식 작용의 유도와 관련된 필수, 물리적 변화.

비디오: Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

단일 분자 단지를 떠올리 VIVO에서 고급 형광 현미경을 사용하여

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

연구

생물학

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

분열 효모의 양적 라이브 세포 형광 - 현미경 분석

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

시간 경과 비디오 현미경을 이용한 세포의 무작위 마이 그 레이션의 정량 분석

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

형광을 사용하여 mRNA의 분자의 시각화 및 분석<em&gt; 제자리에서</em에서&gt; 하이브리드<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

신속한 분석 및 형광 현미경 이미지의 탐사

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular &#8216;self-eating&#8217;) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called &#8216;starvation pads&#8217; for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

자식 작용의 분석에<em&gt; 페니 chrysogenum</em&gt; 형광 현미경과 조합 기아 패드를 사용하여

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Here, a protocol is presented to identify Kinesin-1 cargos. A motorless mutant of the Kinesin-1 heavy chain (KIF5B) aggregates in the cytoplasm and induces aggregation of its cargos. Both aggregates are detected under fluorescence microscopy. A similar strategy can be employed to identify cargos of other motor proteins.

형광 현미경을 사용 키네신 -1-화물 식별

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

자동 형광 수명 이미징 현미경을 활용하여 오픈 소스 높은 콘텐츠 분석

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to understand where and when transcription is taking place within nuclear space and to visualize the relationship between episomes infected within the same cell's nucleus. Here, both immunofluorescence (IFA) and RNA-FISH have been combinedto identify actively transcribing Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) episomes. By staining KSHV latency-associated nuclear antigen (LANA), it is possible to locate where viral episomes exist within the nucleus. In addition, by designing RNA-FISH probes to target the intron region of a viral gene, which is expressed only during productive infection, nascent RNA transcripts can be located. Using this combination of molecular probes, it is possible to visualize the assembly of large viral transcription factories and analyze the spatial regulation of viral gene expression during KSHV reactivation. By including anti-RNA polymerase II antibody staining, one can also visualize the association between RNA polymerase II (RNAPII) aggregation and KSHV transcription during reactivation.

Viral transcriptional factories are discrete structures that are enriched with cellular RNA polymerase II to increase viral gene transcription during reactivation. Here, a method to locate sites of actively transcribing viral chromatin in 3D nuclear space by a combination of immunofluorescence staining and in situ RNA hybridization is described.

기능 이미징 3D 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 바이러스 성 녹음 방송 공장

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...