이 프로젝트는 NPU에 의해 지원 되었다 I, LO1417 (교육, 청소년 및 스포츠의 체코 공화국).

1입니다. 생물 자료의 준비
<ol><li>붙일 태그가 단백질 세포질 마커 뿐 아니라 관심의 표현 하는 생물 학적 자료를 준비 합니다. 소개에서 언급 하는 절차를 따릅니다.</li>
</ol>2. confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법
<ol><li>4-64 염료7제 1 fm 준비 자료를 얼룩.<ol>
<li>공부 자료에 대 한 적합 한 얼룩 프로토콜을 적용 합니다. 담배 BY-2 셀, 10mm FM의 0.2 μ와 200 μ 셀 서 스 펜 션의 dimethylsulfoxide에서 4-64 솔루션 얼룩. 참고: FM의 전형적인 착 색 농도 4-64 염료는 10 m m 재고 솔루션을 사용 하 여 dimethylsulfoxide에서 10 μ M에 대 한. 적절 한 얼룩에 대 한 FM 4-64의 가능한 가장 낮은 농도 사용 하 고 셀 얼음 (FM 4-64와 저온 수 플라즈마 멤브레인 속성에 영향을 미칠)에 품 어 하지 마십시오. 관찰 즉시 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 계속 합니다. 얼룩 및 이미지 수집 간격; 10 분 이상 하지 않아야 그렇지 않으면, 염료의 endocytosis 4-64 얼룩 FM 적용 됩니다.</li>
		<li>연속적으로, 여러 개의 샘플을 처리 하 고 실험의 시작 부분에 모든 샘플 얼룩이 되지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>한 셀 당 한 적도 confocal 섹션을 캡처하십시오.<ol>
<li>(첫 번째 채널에 있어야) 단백질 태그와 FM 4-64 (두 번째 채널에 있어야)로 사용 하는 발 색 단에 대 한 순차적 2 채널 스캔 설정 합니다. (10-20 픽셀/μ m) 높은 광학 해상도 설정 합니다. 예를 들어 설정: 63 X 기름 침수 목표, NA 1.3, 이미지 크기 1024 x 1024 픽셀. 원형질 막 비행기 획득된 이미지에 confocal 섹션 평면에 수직인 인지 확인 합니다.</li>
		<li>캡처 통계 평가 대 한 충분 한 데이터를 견본 당 적어도 20 셀 (가공된 소재에서 신호 변화에 따라 달라 집니다).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 필요한 소프트웨어 설치
<ol><li>피지 ImageJ 배포8와 주변 필요한 매크로 설치 합니다.<ol>
<li>사이트 https://fiji.sc/#download에서 소프트웨어를 다운로드 하 고 그들을 풀고 여 설치.</li>
		<li>압축 푼된 "Fiji.app" 디렉터리에 "ImageJ(.exe)" 파일을 두 번 클릭 하 여 피지를 시작 합니다.</li>
		<li>"주변" 매크로 다음 사이트에서 다운로드: http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/Peripheral_.ijm입니다.</li>
		<li>피지에 플러그인을 선택 | 매크로 | 설치... 메인 메뉴에서 "Peripheral_.ijm" 다운로드 한 파일의 경로를 지정 하 고 참고: 설치 매크로 "주변 장치"의 두 가지 새로운 도구 피지 도구 모음에 표시 됩니다: "받아 프로필 도구"와 "주변 단백질 메뉴."</li>
	</ol>
</li>
	<li>R 프로젝트 소프트웨어9및 필요한 패키지를 설치 합니다.<ol>
<li>R 프로젝트 설치에 대 한 사이트 https://cloud.r-project.org/에 지시를 따릅니다. 참고: 전체 분석 피지에서 수행 됩니다. R 소프트웨어만 내부적으로 호출할 수 것입니다 피지 매크로 계산 "주변 장치"에 의해.</li>
		<li>R GUI를 실행, 패키지를 선택 | 설치 패키지를... 메인 메뉴에서 가장 가까운 저장소 및 설치 패키지 "ggplot2" 지정. 참고: 또는, r 명령줄 입력: install.packages("ggplot2").</li>
		<li>대상에서 주변 R 패키지를 다운로드: http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz. 패키지를 선택 하 여 설치 | 로컬 파일에서 패키지를 설치. 참고: 또는 R 명령줄에이 명령을 입력: install.packages ("http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz", repo NULL 입력 = = "소스").</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 피지 이미지 분석
<ol><li>세포질 마커의 confocal 이미지를 처리 합니다.<ol>
<li>플러그인을 사용 하 여 피지를 가져오기는 이미지 | 바이오-형식 | 바이오-형식 가져오기 기본 설정으로 피지 메뉴에서.</li>
		<li>바이오-형식 가져오기 이미지 보정을 제대로 인식 경우 확인 하십시오. 상단 왼쪽된 정보 필드 이미지 창에 표시 된 그림 차원 원래 그림 크기를 같아야 합니다.</li>
		<li>치료는 잘못에서 잘못 된 이미지 보정 대화 창 분석에에서 올바른 매개 변수를 설정 하 여 개별적으로, 예를 들어, 크기 | 설정 규모... 피지 메뉴에서: 까지의 거리를 픽셀 단위로 필드와 거리 알려진 필드에 적절 한 길이 단위로 실제 너비에 이미지 너비 (픽셀) 입력). 참고: Leica LCS LEI 파일 잘못 교정 단계 4.2.1를 따라 라.</li>
	</ol></li>
	<li>분석 설정에 대 한 가져오기 옵션 매크로 실행 합니다. 세 가지 방법 중 하나에 의해 매크로 활성화: 플러그인을 선택 | 매크로 | 가져오기 옵션 [f1] 주 피지 메뉴에서 선택 같은 메뉴 도구 주변 단백질 메뉴, 클릭 한 후 항목을 누르거나 키보드 지름길 F1. 호출된 매크로 대화 창에서 매개 변수를 설정 합니다.<ol>
<li>Leica LCS LEI 형식 경우 Leica.lei 이미지 확인란을 활성화 하 여 부적 절 한 보정 해결. 이 옵션은 제대로 "lei" 확장자를 가진 파일에서 이미지 크기를 가져옵니다.</li>
		<li>가우스 블러 반경 (픽셀)필드에 적절 한 값을 정의 합니다. 이 그림 스무 딩 및 소음 감소 영향. 낮은 값 (1 픽셀) 충분 하 고 모든 이미지 정보 손실이 발생 하지 않습니다.</li>
		<li>프로 파일 선 두께 (픽셀)필드에 값을 설정 합니다. 두꺼운 라인 프로 파일 곡선의 높은 다듬기 발생 합니다. 기본값 10 픽셀 것이 좋습니다.</li>
		<li>"샘플 구분 기호" 와 "수출 항목." 의 정의 의해 구문 분석 이미지 제목 설정 참고: 이미지 제목 ( 예:확장명 없이 파일 이름: "실험-1_line-02_cell-11") "샘플 구분 기호" 필드에 나열 된 모든 문자가 주위 분할 됩니다 (예: "-_") 항목의 집합으로 ("실험", "1"," 라인","02","셀", 및"11") 요소를 그룹화 (샘플, 셀, 행, 또는 치료 정체성)에 다음과 같은 분석으로 사용할 수 있습니다. 항목을 "내보낸 항목." 출원으로 그들의 시퀀스 번호 ("0"의 첫 번째 항목에 대 한)를 입력 하 여 사용 됩니다 정의 공백으로 형식, 예를 들어, "3 5."을 사용 하 여 이 예제에서 항목 "02", "11" 참조 됩니다 "Fac_0" 및 "Fac_1" 라는 요소를 그룹화 하는 것으로 서 또한, 각 측정의 id로 "나" 요소를 메시지를 지칭 합니다.</li>
		<li>또는 빈 샘플 구분 기호 를 유지 하 고 전체 이미지 제목 유지 될 수 있습니다 경우 수출 항목 에 0을 입력.</li>
		<li>Windows 운영 체제에서 R 소프트웨어를 경로에 있을 것입니다 잘못 자동 검색 필드 R.exe 경로확인 합니다. 그렇지 않으면, 시스템 (예:"C:\Program Files\R\bin\R.exe")에서 R.exe 파일에 전체 경로 지정 합니다.</li>
		<li>확인을 클릭 합니다. 다음 대화 창에서 구문 분석 하는 제목을 확인 하 고 확인 또는 다시 재설정을 클릭 합니다. 참고: 모든 사진은 자동으로 부드럽게 그리고 결국 recalibrated 될 것입니다. 모든 내보낸된 그룹화 요인의 목록이 결과 창에 표시 됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>처리 된 이미지의 원형질 막 지역에 걸쳐 선형 선택 수행 하 고 형광 프로 파일을 측정.<ol>
<li>피지 도구 모음에서 직선 피지 도구를 선택 합니다. 이미지를 클릭 하 고 원형질 막 지역 선 끌어. 선 세포 외 공간에서 시작 해야 하며 플라즈마 멤브레인에 수직 이어야 한다. 대뇌 피 질의 세포질의 두꺼운 및 더 균질 층으로 영역을 선택 합니다. 선형 선택의 최적의 길이 5-10 μ m입니다.</li>
		<li>4.2 (단축키 "x") 단계에서 비슷한 방법으로 또는 프로필 도구 걸릴 피지 도구 모음에서 클릭 하 여 프로 파일 매크로 받아 실행 합니다. 두 채널에 형광 프로필의 자동 측정 수행 됩니다 하 고 데이터는 결과 창에 표시 됩니다.</li>
		<li>"X" 키를 사용 하 여 생소 간주 됩니다, 경우 텍스트 편집기에서 매크로 소스 파일 Peripheral_.ijm 를 열고, 줄에 "x" 기호 대체 ' 매크로 "걸릴 프로필 [x]" {' 더 유리한 기호 (하지로 피지 환경에서 사용 되는 활성 키보드 지름길) 저장 합니다. 매크로 (3.1.4 단계)를 재설치 하 고 이미지 가져오기에서 분석을 시작.</li>
		<li>개별 신호 변화에 따라 각 셀에 대 한 프로필의 대표 번호를 가져가 라.</li>
		<li>파일을 통해 데이터 저장 | 저장 다른 이름으로. 항상 사용 "csv" 확장; 그것은 적절 한 데이터 형식이 필요 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>프로필 데이터 매크로 플롯 (지름길 F5) 측정 된 프로필의 그래픽 시각화에 대 한 실행 합니다. 호출된 매크로 대화 창에서 매개 변수를 설정 합니다.<ol>
<li>체크 상자 사용 하 여 필터링 입력 데이터? 선택 되지 않은.</li>
		<li>줄거리는 단일 CSV 파일 또는 모든 CSV 파일에서 적절 한 라디오 단추를 클릭 하 여 지정된 된 디렉터리에 있는 결과 창에서 최근 데이터 에서 만들 수 경우 지정 합니다. 참고: 최근 결과에서 줄거리를 만드는 경우 데이터 저장 됩니다 먼저 (다른 이름으로 저장 대화 상자는 자동으로 활성화).</li>
		<li>그룹화 요소 는 적절 한 체크 박스를 선택 하 여 그래프에 사용 됩니다 지정 합니다. 모든 프로 독특한 플롯에 표시 해야 하는 경우 "i." 요소를 선택 합니다. 하나의 플롯에서 플롯 모든 데이터에 의해 해야 하는 경우 선택 하지 않은, 체크 박스를 유지. 주의: 플롯 작성 중 처리 결과 원인 오류에 존재 하지 않는 그룹화 요소의 선택 합니다.</li>
		<li>출력 파일 접두사 필드에서 음모를 저장할 때 파일 이름 지정 하 고 파일 높은 줄거리 와 플롯 폭에 그림 이미지 치수 를 정의 합니다. 참고: 결과 플롯 저장 됩니다 소스 데이터 디렉토리에 PNG 파일로.</li>
		<li>선택은 Pdf 출력? 확인란 추가 PDF 출력 생성 될 수 있습니다.</li>
		<li>확인을 클릭 합니다. 결과 대 한 경로 지정 가져오거나 결국 데이터에 대 한 다음 대화 창에서. 분석 수행된 R 코드를 보여주는 대화 창에서 확인 을 클릭 하 여 확인 합니다. 참고: 새 이미지 창에서 열 것 이다 음모 그리고 R 분석 출력 텍스트 창에 나열 됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>만약 일부 플롯된 프로필 과도 한 신호 (태그 단백질)에 대 한 세포 외 공간에 나 (4-64의 FM 신호)에 대 한 세포내 공간에서 프로 파일 필터링 설정 매크로 (지름길 F2) 실행 합니다. 호출된 매크로 대화 창에서 매개 변수를 설정 하 여 따르십시오. 참고: 필터링 지정 된 x 좌표에서 최대 허용된 강도 임계값에 따라 가난한 프로 파일의 제거를 수 있습니다.<ol>
<li>각 채널에 대 한 과도 한 세포 외 (세포내) 신호 측정을 제거하는 파일에 적절 한 강도 임계값을 설정 합니다. X 좌표에서 (보다) 낮은필드에서 강도 임계값 적용 될 영역을 지정 합니다.</li>
		<li>체크 상자는 프로필 데이터 매크로 플롯 (단계 4.4) 다시 실행 사용 하 여 필터링 입력 데이터? 선택; 모든 탈 프로필 성공적으로 제거 되었습니다 확인 하십시오. 그렇지 않으면, 필터링 매개 변수 (4.5.1 단계) 개선.</li>
	</ol></li>
	<li>실행 만들기 모델 매크로 (지름길 f 3) 원형질 막 및 교정 데이터에 따라 세포질 형광 분포 모델을 만듭니다. 호출된 매크로 대화 창에서 매개 변수를 설정 하 여 따르십시오.<ol>
<li>지정 하는 경우 입력된 데이터를 선택 하 여 필터링된 (4.5 단계) 있어야는 사용 하 여 필터링 입력 데이터? 체크 박스.</li>
		<li>4.4.2 단계 에서처럼 analogically 원본 데이터 를 지정 합니다.</li>
		<li>Μ m에서 간격 을 모델 "시작", "끝"의 정의 의해 예측 될 것 이다 하 고 "단계" 값을 지정 합니다. 참고: 모든 프로 파일 측정 지정 된 간격 보다 더 이상 이어야 한다.</li>
		<li>적절 한 분야에서 사용 chromophores의 형광의 파장 여기 및 방출 맥시 마를 지정 합니다. 4-64 조합 GFP와 FM에 대 한 기본값을 설정 합니다. 참고: "GFP" 단백질 (GFP, CFP, YFP, 등), 태그에 사용 되는 발 색 단을 나타내고 "FM4" 발 색 단 (일반적으로 4-64 FM) 얼룩 원형질 막에 대 한 사용을 나타냅니다.</li>
		<li>출력 파일 접두사 필드를 지정 합니다. 접두사 원본 데이터 디렉터리로 RData 파일 결과 모델 저장에 대 한 사용 됩니다.</li>
		<li>체크 박스를 선택 음모 모델? 그래픽 출력 필요한 경우. 경우와 또한 PDF 파일 PNG로 줄거리 저장 됩니다는 Pdf 출력? -확인란을 선택.</li>
		<li>확인을 클릭 합니다. 입력을 지정 또는 다음 대화 창에서 경로 출력 하 고 수행된 R 코드를 보여주는 대화 창에서 확인 을 클릭 하 여 분석을 확인 합니다. 참고: 줄거리는 모델의 세포질 및 주변 관련 단백질 형광의 막 화합물에에서 표시 됩니다 새 이미지 창 고 R 분석 출력 텍스트 창에 나열 됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>관심사의 단백질을 표현 하는 셀의 이미지를 처리 합니다.<ol>
<li>4.1 단계 에서처럼 analogically 이미지를 가져옵니다.</li>
		<li>4.2 단계 에서처럼 analogically 분석을 설정 합니다. 부드럽게 하 고 선 폭 동일 해야 합니다.</li>
		<li>측정 단계 4.3 에서처럼 analogically 프로필.</li>
		<li>(단계 4.4)을 그려서 프로필의 정확성을 확인 하 고 (4.5 단계) 원하는 경우 필터링 설정.</li>
	</ol></li>
	<li>원형질 막 사이 및 세포질 단백질 분할의 계산에 대 한 계산 배포 매크로 (지름길 F4)를 실행 합니다. 호출된 매크로 대화 창에서 매개 변수 설정에 따라.<ol>
<li>Analogically 이전 단계 (단계 4.4), 데이터 원본, 필터링 및 파일 이름 접두사를 지정 합니다.</li>
		<li>피지 (선택 체크 박스 최근 결과)에 "주변" 매크로의 최근 인스턴스에서 마지막 모델 계산 또는 RData 파일 (단백질 분포 계산에 대 한 모델 로드 됩니다 지정 "파일"에서체크 박스 선택) 합니다.</li>
		<li>확인란 활성화 원하는 결과 필터링 하는 경우 잔여 가변성 보다 큰 결과 제거 하십시오. 최대 허용 잔류 프로 파일 측정의 신호 분해에 의해 설명할 수 없는 수 있는 임계값을 지정 합니다. 예: 0.200 나타냅니다 프로필에 형광 강도의 총 다양성의 설명할 수 없는 변화 20% 보다 높은 모든 측정 삭제 됩니다.</li>
		<li>샘플 그룹화 요소, 상자-플롯 만들기 (단계 4.4)에 사용할 수 있습니다를 선택 합니다.</li>
		<li>체크 박스를 활성화 Pdf 출력? PDF 파일로 상자 그림을 저장 하기 위한.</li>
		<li>확인을 클릭 합니다, 그리고 지정 하는 입력 또는 출력 경로, 고 수행된 R 코드를 보여주는 대화 창에서 확인 을 클릭 하 여 분석을 확인 합니다. 참고: 새 이미지 창에 표시 됩니다 주변 관련 단백질 플라즈마 막과 세포질 사이 분할의 상자 그림 그리고 R 분석 출력 텍스트 창에 나열 됩니다.</li>
		<li>파일을 통해 결과 창에 표시 하는 결과 저장 하는 외부 처리에 대 한 | 저장 다른 이름으로... 창 메뉴.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Barbosa, I. C. R., Shikata, H., Zourelidou, M., Heilmann, M., Heilmann, I., Schwechheimer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+composition+and+a+polybasic+motif+determine+D6+PROTEIN+KINASE+polar+association+with+the+plasma+membrane+and+tropic+responses.">Phospholipid composition and a polybasic motif determine D6 PROTEIN KINASE polar association with the plasma membrane and tropic responses.</a> Development. 143 (24), 4687-4700 (2016).</li><li>Kato, M., Aoyama, T., Maeshima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ca2+-binding+protein+PCaP2+located+on+the+plasma+membrane+is+involved+in+root+hair+development+as+a+possible+signal+transducer.">The Ca2+-binding protein PCaP2 located on the plasma membrane is involved in root hair development as a possible signal transducer.</a> Plant J. 74 (4), 690-700 (2013).</li><li>Kubitscheck, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence Microscopy: From Principles to Biological Applications. , (2013).</li><li>Janecki, A. J., Janecki, M., Akhter, S., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+plasma+membrane+expression+of+a+fusion+protein+of+Na/H+exchanger+NHE3+and+green+fluorescence+protein+(GFP)+in+living+PS120+fibroblasts.">Quantitation of plasma membrane expression of a fusion protein of Na/H exchanger NHE3 and green fluorescence protein (GFP) in living PS120 fibroblasts.</a> J Histochem Cytochem. 48 (11), 1479-1492 (2000).</li><li>Peitzsch, R. M., McLaughlin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+acylated+peptides+and+fatty+acids+to+phospholipid+vesicles:+pertinence+to+myristoylated+proteins.">Binding of acylated peptides and fatty acids to phospholipid vesicles: pertinence to myristoylated proteins.</a> Biochemistry. 32 (39), 10436-10443 (1993).</li><li>Vosolsob&#283;, S., Petr&#225;&#353;ek, J., Schwarzerov&#225;, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+plasticity+of+plasma+membrane+interaction+in+DREPP+family+proteins.">Evolutionary plasticity of plasma membrane interaction in DREPP family proteins.</a> Biochim Biophys Acta - Biomembr. 1859 (5), 686-697 (2017).</li><li>Bolte, S., Talbot, C., Boutte, Y., Catrice, O., Read, N. D., Satiat-Jeunemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM-dyes+as+experimental+probes+for+dissecting+vesicle+trafficking+in+living+plant+cells.">FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells.</a> J Microsc. 214 (2), 159-173 (2004).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>R Development Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A language and environment for statistical computing. , (2008).</li><li>Logan, D. C., Domergue, O., Teyssendier de la Serve, B., Rossignol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+family+of+plasma+membrane+polypeptides+differentially+regulated+during+plant+development.">A new family of plasma membrane polypeptides differentially regulated during plant development.</a> Biochem Mol Biol Int. 43 (5), 1051-1062 (1997).</li><li>Ide, Y., Nagasaki, N., Tomioka, R., Suito, M., Kamiya, T., Maeshima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+properties+of+a+novel,+hydrophilic+cation-binding+protein+associated+with+the+plasma+membrane.">Molecular properties of a novel, hydrophilic cation-binding protein associated with the plasma membrane.</a> J Exp Bot. 58 (5), 1173-1183 (2007).</li><li>Nagasaki-Takeuchi, N., Miyano, M., Maeshima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plasma+membrane-associated+protein+of+Arabidopsis+thaliana+AtPCaP1+binds+copper+ions+and+changes+its+higher+order+structure.">A plasma membrane-associated protein of Arabidopsis thaliana AtPCaP1 binds copper ions and changes its higher order structure.</a> J Biochem. 144 (4), 487-497 (2008).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDP25,+A+Novel+Calcium+Regulatory+Protein,+Mediates+Hypocotyl+Cell+Elongation+by+Destabilizing+Cortical+Microtubules+in+Arabidopsis.">MDP25, A Novel Calcium Regulatory Protein, Mediates Hypocotyl Cell Elongation by Destabilizing Cortical Microtubules in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23 (12), 4411-4427 (2011).</li><li>Qin, T., Liu, X., Li, J., Sun, J., Song, L., Mao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+microtubule-destabilizing+protein+25+functions+in+pollen+tube+growth+by+severing+actin+filaments.">Arabidopsis microtubule-destabilizing protein 25 functions in pollen tube growth by severing actin filaments.</a> Plant Cell. 26 (1), 325-339 (2014).</li><li>Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+BY-2+Cell+Line+as+the+&amp;#34;HeLa&amp;#34;+Cell+in+the+Cell+Biology+of+Higher+Plants.">Tobacco BY-2 Cell Line as the &amp;#34;HeLa&amp;#34; Cell in the Cell Biology of Higher Plants.</a> Int Rev Cytol. 132, 1-30 (1992).</li><li>Hellens, R. P., Anne Edwards, E., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pGreen:+A+versatile+and+flexible+binary+Ti+vector+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation.">pGreen: A versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Mol Biol. 42 (6), 819-832 (2000).</li><li>Vermeer, J. E. M., Thole, J. M., Goedhart, J., Nielsen, E., Munnik, T., Gadella, T. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+phosphatidylinositol+4-phosphate+dynamics+in+living+plant+cells.">Imaging phosphatidylinositol 4-phosphate dynamics in living plant cells.</a> Plant J. 57 (2), 356-372 (2009).</li><li>La&#328;kov&#225;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Dynamics+of+Plant+Plasma+Membrane+Proteins+with+Fluorescence+Recovery+and+Raster+Image+Correlation+Spectroscopy.">Determination of Dynamics of Plant Plasma Membrane Proteins with Fluorescence Recovery and Raster Image Correlation Spectroscopy.</a> Microsc Microanal. 22 (2), 290-299 (2016).</li></ol>

저자는 공개 없다.

여기 설명 하는 방법을 원형질 막 형광 강도5측정에 따라 다른 방법에 비해 주변 관련된 단백질에 대 한 분할의 더 정확한 견적을 생성 합니다. 이 방법의 주요 향상은 그것 계정에 빛의 회절 및 원형질 막의 세포질 신호 중첩입니다. 비록 이러한 메서드 결과 평균 세포질 막 위치에서 형광 강도의 비교에 기반 하는 간단한 방법의 결과와 상관 관계에는 신호 (같이 이전<sup class="xre...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57837/determination-plasma-membrane-partitioning-for-peripherally">Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins</a>. The Affiliations section was updated.
One of the affiliations was updated from:
Department of Experimental Plant Biology, University of Science, Charles University
to:
Department of Experimental Plant Biology, Faculty of Science, Charles University

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57837/determination-plasma-membrane-partitioning-for-peripherally">Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins</a>. The Affiliations section was updated.

Erratum: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

주변 관련 된 플라즈마 막 단백질은 세포 신호 통로의 주요 구성 요소. 그들의 과도 플라즈마 멤브레인 협회와 분리, 플라즈마 막과 세포질 사이 신호 변환에 대 한 중요 한 그들의 기본적인 역할 중 하나입니다. 주변 관련 된 플라즈마 막 단백질 지질 앵커 (N-myristoylation, S-acylation, 또는 prenylation) 또는 지질 바인딩 도메인 (phosphatidylinositol 인산 염, phosphatidic 산, 와 상호 작용 하 여 원형질 막에 붙어 있을 수 있다 등).
이 단백질의 속성 수 플라즈마 멤브레인 바인딩 검사 vivo에서, 예를 들어, 붙일 태그가 단백질 핵심 아미노산의 사이트 감독 mutagenesis에 의해 수정 될 때 또는 때 그것에 영향을 미치는 다양 한 억제제 처리 됩니다. 지질 신호입니다. 주변 플라즈마 막 단백질의 분포는 주로 되 고 질적으로, 경우에 특히 때 평가 단백질 다시 메일은 분명 합니다. 제시 방법은 상황에 대 한 최적의 단백질 다시 배포만 부분 이며 양적 평가 필요한 때입니다. 플라즈마 멤브레인 협회 confocal에서 추정 되는 때 자주 사용된 접근 레이저 스캐닝 현미경 이미지의 원형질 막에 및 세포질1,2, 형광 강렬 비율 아니다 간단 하지만 정확한. 원형질 막에 형광 강렬 특정 형광 현미경 검사 법 기술과 사용 하는 광학 요소3에 대 한 빛의 회절 특성 때문 원형질 막 및 세포질 신호의 중첩을 반영합니다. 따라서, 세포질 신호 막 지역에도 포함 됩니다. 이러한 이유로, FM 4-64 얼룩 패턴 막 신호 선택4마스크로 사용할 수 없습니다. 또한, 막 신호 FM 4-64 항상 체계적으로 최대 얼룩에 의해 정의 된 위치에서의 간단한 측정 평가의 중첩으로 인해 주변 관련 된 플라즈마 막 단백질의 진짜 플라즈마 막 신호는 막 그리고 세포질 화합물입니다. 붙일 태그가 주변 관련 된 단백질에 대 한 관찰 된 신호의 최대 또한 공동 플라즈마 멤브레인 마커 (즉, FM 4-64 styryl 염료), 최대를 지역화 하지 않습니다 하지만 세포질 쪽으로 이동 된다. 또 다른 한계는 FM 4-64 방출 피크는 빛 회절3의 파장 의존성 때문 GFP 같은 녹색 형광 성 단백질을 위한 방출 봉우리에 비해 넓은 사실에 기반입니다.
여기에 설명 된 메서드에서 태그 단백질 신호 원형질 막 세포질 신호를 가상 배포를 설명 하는 것은 각각의 경험적 함수 두 개 장착 되어 있습니다. 이 신호 분해 수직 붙일 태그가 단백질 표현 confocal 섹션 일반, 2 채널 소스 이미지에서 원형질 막으로 세포 표면에 적용 되는 선형 형광 프로필에 적용 됩니다. 셀 FM 4-64 염료와 함께 표시입니다.
피팅을 사용 하는 첫 번째 함수는 셀 가장자리에 세포질 신호의 회절을 설명 합니다. 그것은 관심의 원형질 막 주변 관련 된 단백질으로 같은 발 색 단에 의해 표를 붙인 세포질 단백질 마커를 표현 하는 셀에 측정 되었다 이전 취득된 형광 프로필에서 얻은 것입니다. 원형질 막 신호의 회절을 설명 하는 두 번째 함수는 FM 4-64의 형광에서 파생 됩니다. 이 신호는 점 광원의 빛 회절의 대략적인 모델링에 사용 되는 가우스 함수에 의해 첫째로 직선 근사 줄. 둘째,이 모델, 빨간 FM 4-64 방출에 유효 수학적으로 원형질 막에 대 한 관심의 주변 관련 단백질의 태그에 사용 되는 발 색 단의 방출 파장에 대 한 관련 된 형식으로 변환 됩니다. 두 함수 모두 최대 강도 및 FM 4-64 신호 및 세포질 단백질 신호에 대 한 가장 높은 값의 10%에서 평균 각각 정규화 됩니다. 이 신호 분해 (비-선형 최소 평방 피팅 방법), 원형질 막의 비율과 시험된 단백질의 세포질 분수 수 수 추정 쉽고 정확 하 게. 분할 계수 계산된의 실제 물리적 차원은 세포질 볼륨 농도 표면 농도 플라즈마 멤브레인에 비해 마이크로미터의 범위입니다. 같은 양의 단백질은 원형질 막의 인접 한 지역에서 지역화 된 세포질에 플라즈마 막에서 거리를 정의 합니다. 이 값은 분할 계수 K2 도입 이전5. 방법은 매우 빠르고, 일상적인 confocal 레이저 스캐닝 현미경를 사용 하 여 인수만 단일 confocal 단면도 요구 하 고 그것은 계산 요구 하지. 분석 핵심 휴대용 R 패키지에 구현 된 고 추가 ImageJ 매크로에서 직관적인 대화 상자는 분석을 실행 하려면 그래픽 사용자 인터페이스를 제공 하기 위해 작성 되었습니다. 소프트웨어 및 방법의 자세한 설명 (이전 출판6) http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/에서 찾을 수 있습니다.
방법은 절연된 셀, protoplasts, 및 조직에 대 한 적합 한 개별 세포의 원형질 막 명확 하 게 구별할 수 어디에, 주변에 관련 된 단백질 검사의 붙일 태그 구문 표현. 발 색 단 호환 FM 4-64 얼룩을 사용 해야 합니다. FM 4-64에서 빨간 형광; 따라서, 검사 단백질 파란색, 녹색, 또는 황색 방출 (예를 들어, GFP, CFP, YFP)와 형광 단백질에 의해 태그가 될 수 있습니다. 생물학 물자의 안정적인 변화 단백질 분포의 덜 인공 하 고 쉽게 재현 가능한 관측을 수 있기 때문에 것이 좋습니다. 그것은 시험된 단백질 상대적으로 균질 세포질 배포 필요입니다. 바인딩과 그물 또는 다른 세포내 막 구획에 있는 단백질의 지 방화는 인공 결과 생성할 수 있습니다.
또한, 동일한 생물학 물자 세포질 마커를 표현 비교에 사용 해야 합니다. 셀 폐지 막 바인딩 용량 무료 chomophore (같은 사용 되는 태그, 예를 들어, 무료 GFP 주변 단백질)에 의해 또는 관심사의 태그 단백질에 의해 변환할 수 있습니다. 막 바인딩 용량 수 수 폐지, 예를 들어 막 바인딩 도메인의 트리밍 또는 주요 아미노산 잔류물 (예를 들어, 사이트에 대 한 N-myristoylation, S-acylation, 또는 prenylation, 등)의 사이트 감독 mutagenesis.
공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 법, 대 한 세포 FM 4-64 염료 처럼 막 마커로 표시 해야 합니다. FM (때문에 간섭 autofluorescence, 불 쌍 한 염료 침투 등) 공부 자료에 적합 하지 않으면 4-64 얼룩, 원형질 막 수 표시, 예를 들어 적절 한 chomophore (태그 통합 플라즈마 막 단백질에 의해 mCherry, RFP, 등). 마커 세포내 막 구획 (endomembranes)에서 무시할 현지화가 필수적 이다.
고정된 샘플 및 항 체를 사용 하는 경우 고칠 수 아날로그 FM 4-64FX 또는 플라즈마 멤브레인 라벨 적절 한 대상에 대 한 항 체에 의해 사용할 수 있습니다. 이 경우에, 고정 절차 단백질의 선택적 손실 세포질과 원형질 막에서 이어질 수 있기 때문에 매우 신중 하 게 결과 평가에 필수적 이다.

<table><tbody><tr><td>FM 4-64</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T13320</td><td>Plasma membrane dye</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540 Sigma</td><td>Dye solvent</td></tr><tr><td>Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes)</td><td></td><td></td><td>Equipment for cell labelling and microscopy</td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ordinary computer</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

determination of plasma membrane partitioning for peripherally-associated proteins

이 메서드는 원형질 막 어떤 붙일 태그가 주변 관련 단백질의 원형질 막에 걸쳐 형광 강도의 프로필을 사용 하 여 분할의 결정에 대 한 빠른 접근을 제공 합니다. 측정 된 형광 프로필 셀 주변에 수직으로 적용 하는 선 따라 막과 세포질 형광 분배 모델에 적합 하다. 이 모델은 FM 4 64 표시 된 원형질 막과 세포질 붙일 태그 마커를 표현 하는 참조 셀의 형광 강도 값에서 생성 됩니다. 다양 한 세포 유형 및 유기 체; 메서드를 적용할 수 있습니다. 그러나, 비 이웃 세포의 플라즈마 막만 평가할 수 있습니다. 이 빠른 현미경-기반 방법은 실험, 플라즈마 멤브레인 관련 마커의 미묘 하 고 동적 변화가 예상 된다 고 양이 정해질 필요가, 예를 들어, 억제제 치료 단백질의 돌연변이 체 버전의 분석에 적합 그리고 신호 변환 관측. 메서드는 사용자 친화적인 인터페이스 역할 ImageJ 매크로와 결합 된 멀티 플랫폼 R 패키지에 구현 됩니다.

DREPP10 식물 관련 주변 관련 된 플라즈마 막 단백질 N-myristoylation와 phosphatidylinositol 인산 염11, 와 정전기 상호 작용을 통해 플라즈마 막으로 연결 되는 12. DREPP으로 식물 세포에서 칼슘 신호 기계 구성 요소 설명 했다 그리고 또한 골격13,14와 상호 작용. 제시 실험에서 ?...

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Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

여기, 선물이 붙일 태그가 주변 관련 된 단백질에 대 한 원형질 막 협회의 레벨의 정량 분석을 수행 하는 프로토콜. 방법은 막의 전산 분해와 세포 원형질 막 형광 표식으로 표시에서 관찰 된 신호의 세포질 구성 요소를 기반으로 합니다.

원형질 막 주변 관련 된 단백질에 대 한 분할 결정

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

determination-plasma-membrane-partitioning-for-peripherally

Research

JoVE Journal

Biology

8.3K 조회수.  Faculty of Science, Charles University. 여기, 선물이 붙일 태그가 주변 관련 된 단백질에 대 한 원형질 막 협회의 레벨의 정량 분석을 수행 하는 프로토콜. 방법은 막의 전산 분해와 세포 원형질 막 형광 표식으로 표시에서 관찰 된 신호의 세포질 구성 요소를 기반으로 합니다.

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Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

연구

생화학

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate neurotransmission that occurs within synapses because it is highly regulated by dynamic protein-protein interactions and phosphorylation events. Accordingly, when any method is used to study synaptic transmission, a major goal is to preserve these transient physiological modifications. Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments. In other words, the protocol describes a biochemical methodology to carry out protein enrichment from presynaptic, postsynaptic, and extrasynaptic compartments. First, synaptosomes, or synaptic terminals, are obtained from neurons that contain all synaptic compartments by means of a discontinuous sucrose gradient. Of note, the quality of this initial synaptic membrane preparation is critical. Subsequently, the isolation of the different subsynaptic compartments is achieved with light solubilization using mild detergents at differential pH conditions. This allows for separation by gradient and isopycnic centrifugations. Finally, protein enrichment at the different subsynaptic compartments (i.e., pre-, post- and extrasynaptic membrane fractions) is validated by means of immunoblot analysis using well-characterized synaptic protein markers (i.e., SNAP-25, PSD-95, and synaptophysin, respectively), thus enabling a direct assessment of the synaptic distribution of any particular neuronal protein.

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments.

뇌막 분획 화 :<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Subsynaptic Protein Localization 평가 방법

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently tagged proteins have revolutionized the study of subcellular protein distribution. However, it is difficult to quantify the distribution with fluorescent microscopy, especially when proteins are partially cytosolic. Moreover, it is often important to study endogenous proteins. Biochemical assays such as immunoblots remain the gold standard for quantification of protein distribution after subcellular fractionation. Although there are commercial kits that aim to isolate cytosolic or certain membrane fractions, most of these kits are based on extraction with detergents, which may be unsuitable for studying peripheral membrane proteins that are easily extracted from membranes. Here we present a detergent-free protocol for cellular homogenization by nitrogen cavitation and subsequent separation of cytosolic and membrane-bound proteins by ultracentrifugation. We confirm the separation of subcellular organelles in soluble and pellet fractions across different cell types, and compare protein extraction among several common non-detergent-based mechanical homogenization methods. Among several advantages of nitrogen cavitation is the superior efficiency of cellular disruption with minimal physical and chemical damage to delicate organelles. Combined with ultracentrifugation, nitrogen cavitation is an excellent method to examine the shift of peripheral membrane proteins between cytosolic and membrane fractions.

Here we present protocols for detergent-free homogenization of cultured mammalian cells based on nitrogen cavitation and subsequent separation of cytosolic and membrane-bound proteins by ultracentrifugation. This method is ideal for monitoring the partitioning of peripheral membrane proteins between soluble and membrane fractions.

질소 현상과 차등 원심 분리 배양된 세포의 주변 막 단백질의 분포를 모니터링 가능

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

멤브레인 단백질-단백질 상호 작용 분석을 위한 기본 세포막 나노입자 시스템

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ranging from nanometers to micrometers and microseconds to minutes, respectively. Such a broad range of biological processes challenges conventional microscopy approaches. Here, we detail the procedure for implementing spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) measurements using a classical fluorescence microscope that has been customized. The protocol includes a specific performance check of the svFCS setup and the guidelines for molecular diffusion measurements by svFCS on the plasma membrane of living cells under physiological conditions. Additionally, we provide a procedure for disrupting plasma membrane raft nanodomains by cholesterol oxidase treatment and demonstrate how these changes in the lateral organization of the plasma membrane might be revealed by svFCS analysis. In conclusion, this fluorescence-based method can provide unprecedented details on the lateral organization of the plasma membrane with the appropriate spatial and temporal resolution.

This article aims to present a protocol on how to build a spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) microscope to measure molecular diffusion at the plasma membrane of living cells.

살아있는 세포의 원형질막에서의 분자 확산 분석을위한 스팟 변이 형광 상관 분광법

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

가역 Biotinylation에 의해 플라즈마 막 단백질 Endocytic 요금 측정

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

생물학

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-chip : 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용에 대한 라벨없는 연구

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

생체공학

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. Lipid rafts are membrane microdomains enriched in cholesterol and sphingolipids. They play a role in cellular physiological processes such as signalling, and trafficking1,2 but are also thought to be key players in several diseases including viral or bacterial infections and neurodegenerative diseases3.
Yet their existence is still a matter of controversy4,5. Indeed, lipid raft size has been estimated to be around 20 nm6, far under the resolution limit of conventional microscopy (around 200 nm), thus precluding their direct imaging. Up to now, the main techniques used to assess the partition of proteins of interest inside lipid rafts were Detergent Resistant Membranes (DRMs) isolation and co-patching with antibodies. Though widely used because of their rather easy implementation, these techniques were prone to artefacts and thus criticized7,8. Technical improvements were therefore necessary to overcome these artefacts and to be able to probe lipid rafts partition in living cells.
Here we present a method for the sensitive analysis of lipid rafts partition of fluorescently-tagged proteins or lipids in the plasma membrane of living cells. This method, termed Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS), relies on the disparity in diffusion times of fluorescent probes located inside or outside of lipid rafts. In fact, as evidenced in both artificial membranes and cell cultures, probes would diffuse much faster outside than inside dense lipid rafts9,10. To determine diffusion times, minute fluorescence fluctuations are measured as a function of time in a focal volume (approximately 1 femtoliter), located at the plasma membrane of cells with a confocal microscope (Fig. 1). The auto-correlation curves can then be drawn from these fluctuations and fitted with appropriate mathematical diffusion models11.
FCS can be used to determine the lipid raft partitioning of various probes, as long as they are fluorescently tagged. Fluorescent tagging can be achieved by expression of fluorescent fusion proteins or by binding of fluorescent ligands. Moreover, FCS can be used not only in artificial membranes and cell lines but also in primary cultures, as described recently12. It can also be used to follow the dynamics of lipid raft partitioning after drug addition or membrane lipid composition change12.

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

A technique to probe the lipid raft partitioning of fluorescent proteins at the plasma membrane of living cells is described. It takes advantage of the disparity in diffusion times of proteins located inside or outside of lipid rafts. Acquisition can be performed dynamically in control conditions or after drug addition.

지질 뗏목의 결정은 형광 상관 분광학 (FCS)에 의해 살아있는 세포에서 Fluorescently 태그가 추가된 프로브의 파티션

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

포유류 세포에서 효율 Resealing 원형질 막의 높은 처리량 측정

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

면역학 및 감염병학

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

비교 단백체 분석을위한 신진 대사 라벨링 및 막 분별<em&gt; 애기 장대</em&gt; 서스펜션 세포 배양

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

원형질 막 주변 관련 된 단백질에 대 한 분할 결정

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