우리는 그들의 지원과 결실 토론을 위해, 우리 팀의 구성원, 기술 지원, 특히 MC Blache뿐만 아니라 M Irla와 B Imhof 감사드립니다. 건식 및 감금에 대한 수치는 자연 방법의 호의를 재현. 이 프로젝트는 CNRS, INSERM과 마르세유 대학에서 그리고 지역 프로방스 - 알프스 - 코트 - d&#39;Azur, Institut 국립 뒤 암, 회사 직원 Nationale 드 라 공들인 (특정 보조금에 의한 제도적 교부금에 의해 지원됩니다 ANR-08-PCVI- 0034-02, ANR 2010 BLAN 1214 01) &amp; Fondation 뭔가 뿌린 라 공들인 Médicale (Equipe labélisée FRM-2009). VR은 리그 Nationale Contre 르 암의 화목에 의해 지원됩니다.

이 동영상에서 우리는 특정 막 수용체를 타겟으로 양자 - 도트를 사용하여 완전한 하나의 입자 추적 실험을 제시한다. 이 실험의 주된 목표는 라이브 세포의 플라즈마 막 내에서 측정된 분자 확산 행동의 차별 다른 종류로 구성되어 있습니다. 사실, 막에서 발생하는 분자의 움직임은 일반적으로 선형적으로 감독이나 예를 들어 nanodomains 26-29, 내에 국한 됨으로써 브라운 확산 이탈하실 수 있습니다. 우리는 살아있는 세포의 막 내에서 발생 역학에 발생하는 다양한 스냅샷을 제공하는 동시에 기술적으로 가능한 한 많은 수용체로서 다음과 같은 목표로하고 있습니다. 이것은 궁극적으로 세포 표면 수용체 신호 전달을 조절하는 메커니즘에 대해 파악하도록 기대된다. 1. 세포 배양 <ol><li> 세포 샘플을 준비 : endogenously 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 30을 표현 자기편 COS-7 세포를 사용합니다. 언제항생제는 준비 중에 항상 적절한 무균 기술을 사용하여 어떠한 잠재 하위 감지 오염이 없다 확실하게하지 않고도 실시간으로 세포와 협력. </li><li> 그들의을 가지고 돌보는 7퍼센트 CO 2와 37 ° C에서 완전한 매체 (10 % 송아지 혈청과 DMEM, 1 %의 글루타민, 1 %의 HEPES 및 1 %의 나트륨 pyruvate, 아래 특정 시약의 표 참조)에서 세포를 성장 실험실 - 테크에서 그들을 확산하기 전에 하위 합류, 지수 성장. </li><li> 당일 실험을하기 전에, 8 아니라 챔버 (실험실 - 테크)에서 / 잘 5,000 세포를 확산하고 밤새 품어. 세포를 계산하면 셀 당 양자 - 도트의 재현성 비율 따라서, 지속적인 세포 밀도를 보장합니다. </li></ol> 2. 휴대폰 라벨 특정 코팅과 양자-점들을 준비합니다. 양자-점들은 반도체로 구성된 형광 nanoparticles 있습니다. 그들은 고전에 비해 매우 밝고 photostable 때문에 이러한 nanoparticles는 높은이자를 제시단일 분자 이미징을위한 잡음 비율 (SNR)에 적절한 신호의 업적을 허용 형광 프로브 31,32. <ol><li> 이전 21 설명된대로 실험을하기 전에, papain으로 소화하여, 하이 브리 도마 세포주 (mAb 108 ATCC HB-9764)에서 EGFR에 대한 팹 조각을 생산하고 있습니다. </li><li> 어원이 같은 말 비오틴과 팹, 제조 업체의 지침 (EZ-링크 sulfo-NHS-LC-biotinylation 키트, 써모 과학, 그림 1A).마다 있습니다. </li><li> 605 nm의 (세포 autofluorescence의 재능, 감지 및 분리를위한 최적의 방출 파장)에 streptavidin (Invitrogen)과 발광으로 기능화 양자 - 도트를 사용합니다. </li><li> 양자 - 도트 주위 현재 streptavidins뿐만 아니라 집합과 세포 및 coverslip에 비 특정 바인딩을 막기 위해이 포화하기 위해서, (특정 시약 표 참조) 완전한 매체에 라벨 솔루션을 준비합니다. </li><li> 두 중급 솔루션을 준비 :양자 - 도트-streptavidin과 biotinylated 팹있는 또 하나, 20 nm의 각 한. </li><li> 이 두 솔루션의 동등한 볼륨을 섞어 : 양자 - 도트 단지 10 nm의 팹의 최종 작업 농도를 얻기 위해 1시 1분 비율로 팹과 함께 양자-점들을 섞는다. 몰 비율을 사용 일과 다른 양자 점 하나 biotinylated 팹 조각으로 구성된 모노 작용 단지의 형성을 좋아 하시더군요. 이 수용체 33,34을 가교에 의한 유물의 관찰을 제한, monovalent 라벨을 좋아 하시더군요. </li><li> 집합을 방지하기 위해 분당 1,200 회전에 뿌리를 사용하여 25 ° C에서 15 분 동안 품어. 혼합 후 살아있는 세포에서 사용할 수 있습니다. </li><li> 7% CO 2와 37 ° C에서 5 분간 혼합 100 μl의 세포를 품어. </li><li> 비 autofluorescent 영상 매체 (HBSS 버퍼, 1 % HEPES, 특정 시약의 표 참조) 37 시에 미리 예열 ° C.로 세포를 씻어 </li><li> 조심스럽게 취소를 방지하기 위해 레이블 초과를 제거필요가 광범위하게 영상 매체, 마지막 세탁 전에 적어도 5 분 지연으로 상온에서 일반적으로 5 회, 각 우물을 세척하여 아웃 포커스 양자-점들 때문에, 언바운드하여 SNR을 망치고있다. </li></ol> 3. 광학 설치 비디오 현미경 설치는 네 개의 주요 부분으로 구성되어 있습니다 : <ol><li> 특정 형광 큐브 (FF01-457/50 여기, FF495-Di02 이색성 및 FF01-617/73 방출 필터, Semrock)과 높은 수치 조리개 (1.3 또는 1.49) 기름 침지 100x 객관적으로 거꾸로 현미경. </li><li> 100 W 수은 램프 (thermoregulation 방해를 피하기 위해, 광섬유를 통해 현미경으로 결합). </li><li> 512 X 512 픽셀 고감도는 충분한 SNR을 달성하기 위해 카메라를 EMCCD. </li><li> 실험 기간 동안 37 ° C에서 생물 학적 샘플을 유지하는 인큐베이터. </li></ol> 4. 취득 <ol><li> 절연과 잘 확산 셀을 선택합니다. 이최고의 멤브레인 분자의 평면 운동을 찾도록 적응 좋은, 평면 lamellipodia의 확장자를 선호한다. </li><li> 전송된 광과 형광의 양쪽 모양으로 세포 생리 상태를 평가 : 강렬한 기공을 갖는 트래픽, 괴사성 또는 apoptotic 표지판, 낮은 autofluorescence, 평균 - 강력한 양자 - 도트 라벨링 (일반적으로 셀 당 최대 1,000 양자 - 도트 부재가 확인 그림. 1B, C). </li><li> 동시에 가능한 한 많은 수용체를 감시하는 중요 높은 라벨 밀도를 선택합니다. 이것은 실제로 모두에 의해 생리 (표면 표현, 에피토프 접근, 수평 운동)과 알고리즘 매개 변수 (비 중복 포인트 확산 함수 (PSF), 심지어 적절한 감지 및 다시 연결을 허용하도록, 운동으로 인한 계정 흐리게 고려). 제한됩니다 </li><li> 각 셀에 들어, 먼저 추가 세포 측면에 대해 확인할 수 있습니다 brightfield 필드 이미지를 (가능한 경우 우선적, DIC 사용) 취득그리고 lamellipodia의 공간적 한계. </li><li> 이러한 규칙과 함께, 이후 DIC라는 하위 폴더에, 비디오 스택 (예 : 예를 들어 cell1.tif &amp; cell1.stk 등)와 같은 이름을 사용하여이 이미지를 저장, 알고리즘은 자동으로 매칭되는 이미지를 다시 찾을 수 각 스택. </li><li> 일반적으로 36-MS 율이 카메라로 풀 프레임에 도달하는 가장 빠른 속도로 지속적으로, 세포 당 1-3 비디오를 습득. 하지만 하나는 증가 감도 및 / 또는 더 적은 픽셀로 전용 CCD를 이용하여 최대 1-MS 속도로, 더 높은 주파수에서 수집할 수 있습니다. 프레임 전송 기술은 프레임 사이의 무시할 지연을 제공합니다. </li><li> 전자 번식 강화는 항상 최소 20 DB (효율적인 피크 검출 1) 위, 충분한 SNR과 함께 일반적으로 주변 25~30dB을 단일 분자 감도를 달성하도록 최대 (단 채도 아래 관련되는 경우)로 설정되어야합니다. </li><li> 일반적으로 비디오, 죄 300 프레임을 습득CE의 탄도는 주로 긴 점멸 이벤트에 의해 제한 평균 ~ 100 프레임 이상 복원됩니다. 비디오 주파수와 길이는 인스턴스에 대한 긴 흔적을 요구할 수 주어진 측정 방식에 맞게 조정 할 수 있습니다. </li></ol> 5. MTT 분석 <ol><li> Matlab 또는 옥타브와 특정 데이터 집합을 평가하기 위해 비디오 파일이있는 디렉토리의 경로를 선택합니다. </li><li> 완전히 automatized 분석 1,35를 시작하려면 Matlab에서 옥타브, 또는 MTT23i에서 명령 detect_reconnex23을 입력합니다. 이 프로그램은 &quot;사용자 인터페이스, 버전 2.3&quot;를 나타내며 2.2 이전 버전과 함께 다운로드할 수 있습니다. 그림에서와 같이 먼저 사용되는 모든 매개 변수를 나열하는 그래픽 인터페이스를 표시합니다. 2. </li></ol> 6. 대표 결과 MTT가 자동으로 추가하여 보완 감지하고 예측 대상의 흔적을 전달하기 위해, 각 레코더의 비디오를 분석이러한 감금 검출 등 vestigations. 이것은 궁극적으로 세포 이미지 (그림 1C 및 3)을 통해 매핑 흔적이 있습니다. MTT 설명 핵심 MTT 분석은 3 가지 주요 작업을 (그림 3) 호출, 각각의 프레임을 통해 수행됩니다 : <ol><li> 슬라이딩이 가설은 비교 연속 각 픽셀 중심으로 하위 지역 내의 대상 (양자 점)의 존재 또는 부재가 탐지 : PSF로 존재하거나 신호는 이중 차원 가우스 피크로 modelized , 또는 프레임마다 미만 가짜 검출로, 낮은만큼 거짓 경보를 할려고 임계값을 사용하여 전용 소음. 이것은 탐지 확률의지도로 안내합니다. 각 지역 최대의 확률 수준이 잘못된 경보 (PFA)의 원하는 확률에 따라 설정된 최소 값보다 높으 않도록 할려고, putative 대상으로 간주됩니다. 이 제한은 효율적 시그마를 차별 정도로 낮게 설정됩니다소음으로부터 nals 여전히 감지 충분히 높은 확률을 허용하면서 이론적으로 예측된 최적의 1에 도달, 최고의 가짜 탐지 (기본 10 -6의 PFA, 512 X 512 픽셀의 이미지 미만 오류 확보)에서 피하는. 하위 영역을 사용하는 요구가 이미지 테두리 (7 X 7 픽셀의 기본 창 3 픽셀), 평가할 수 없다는 것을 의미합니다. </li><li> 이러한 서브 픽셀 위치 및 신호 강도 등 관련 매개 변수, 각각의 감지 대상에 대한 추정. 모든 검색 대상의 경우 최소 제곱 가우스 - 뉴튼의 끼워 맞춤은 다음 감지된 가우스의 위치, 너비 및 높이를 추정하기 위해 수행됩니다. 이것은 특히 염료의 하위 픽셀 위치 (일반적으로 SNR 값 및 움직이기 힘드는 또는 느리게 diffusing 염료 위해 10-20 nm의 정확도, 0.1 μm의 2 / s의 diffusing 염료에 대해 ~ 100 nm의 최대 증가)을 제공합니다. </li><li> 와 새로운 목표의 다시 연결흔적은 이미 이전의 프레임 위에 지어진. 새로운 목표의 집합은 이전의 흔적을 세트로 일치합니다. 이 목적을 위해, 추적 각 목표를 할당하는 순서에 따라 가능하면 감지 단계에서 얻은 가능한 모든 통계 정보가 자세뿐만 아니라, 사용, 또한 강도, 폭, 점멸 및 관련 통계가있다. 따라서 목표는 바로 가장 가까운 성분에 할당되지 않습니다 건너 흔적, 강도, 속도, 폭 및 점멸의 경우에는 간주됩니다. 이것은 통계적으로 최적 다시 연결 점수를 제공합니다. 가장 가까운 이웃으로 다시 연결을 바이어스 가능한 경우,이 전략은 방지됩니다. </li></ol> 탐지된 봉우리들은 추정 또는 재연결에 실패할 경우 거부 후천 될 수 있습니다. 특별 검사는 새로운 트레이스를 시작 것이 새로운 봉우리의 감지를 처리​​합니다. 이 테스트는 더 엄격한 PFA (10 -7)을 사용하여 추적 (Trace)에 피크를 다시 연결 이후 유효성 O로 사실상 해석될 수<html> F의 관련성 (이 기준은 새로운 봉우리에 대해 적용되지 정의가되는). 탄도 분석 가능한 과도 감금은 다음 반대 지역 확산 24-29에 관련된 함수에 의해 평가됩니다. 임계값을 적용하는 것은 에피소드를 협소한 정의하거나 않을 수 있습니다. 모든 추적을 통해 이들을 iterating함으로써 우리는 과도 감금 측면에서 / 이벤트를 느리게, 멤브레인 역학을 매핑할 수 있습니다. 이것은 또한 바이너리 또는 감금 지수의 이산 값 중 하나를 사용하여 표현할 수 있습니다. 기본적으로 MTT는 자동으로 텍스트 파일에 8 피크 매개 변수를 저장, 이러한 작업을 수행합니다 프레임 번호, I 및 J 위치, 신호 강도, 반경, 오프셋과 각 비디오 프레임 (7 행 그룹)과 추적 (열)에 대해 깜박 . 에 exemplified으로 이러한 출력 매개 변수, Matlab 또는 옥타브 더 즉 흔적이나 신호 강도를 분석하는 fread_data_spt 스크립트를 사용하여 다시로드 수<html> 부록의 &quot;http://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt&quot;&gt; MTT_example 스크립트. 더 자세한 분석은 각 셀 위에 흔적을 매핑 (그림 1C &amp; 3)와 관련 매개 변수 (예 : 피크 농도, SNR 또는 현지 확산 값 등)에 대한 히스토그램 분포를 제공하기 위해 이어진다. 각 파일의 내용은 의미와 각 매개 변수의 표준 편차는 histograms의 이미지와 함께 텍스트 파일에 저장됩니다. 이러한 R 2 제곱 변위에 대한 로그와 같은 배포판은 기하 평균을 초래할. 확산 계수 D가 엠에스디 곡선의 다섯 가지 첫째 점 이상 선형 발작으로 계산됩니다. 이 값은 세포 반응이나 막 조직에 영향을 미치는 제약 / 효소 치료의 예를 들어 운동을 위해 관련된 실험의 개요를 제공합니다. MTT는 오픈 소스 코드이므로,이 부분은 쉽게 어떤 헌신적인 수사에 적응 수 있습니다. 599fig1.jpg &quot;고도 =&quot;그림 1 &quot;/&gt; 1 그림. MTT에 의해 막 수용체 역학을 모니터링. 같은 EGFR과 같은 () 멤브레인 컴포넌트,,하고 biotinylated 팹 조각 (각 분자의 약 올바른 스케일링과 설계도를 그리기)에 결합 양자-점들을 적었. (B) 일반 형광 이미지는 개별적으로 표시된 수용체에 대응하는 회절 - 제한된 봉우리를 묘사, 36-MS의 노출 시간과 함께, 살아있는 COS-7 세포에서 인수했습니다. (C) MTT 분석의 출력 셀의 brightfield 이미지에 중첩 수용체의 재구성 궤도를 표시. <img src="/files/ftp_upload/3599/3599fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. MTT 입력 매개 변수. MTT23i를 실행하면 같은 우리의 이전 게시물 1에서 설명한 모든 입력 매개 변수 이름과 기본값을 나열하는 그래픽 사용자 인터페이스를 엽니다. 알고리즘, 공간 및 시간 매개 변수 (검색 창, 최대 반경, 최대 확산에<html> 그리고 점멸) 무차 표준 단위, 픽셀 및 프레임에 있습니다. 교정은 출력 결과를 변환하는 후천을 적용할 수 있습니다. 156 nm의 / pxl 및 프레임 지연 : : 36 MS / 프레임 100x 배율과 캐스케이드 512BFT에 해당하는 기본값은 픽셀 크기입니다. 수사관은 최대 기대 확산 계수 ( &quot;비교 최대&quot;)과 최대 점멸 실종 ( &quot;T OFF&quot;)와 같은 몇 가지 중요한 매개 변수를 최적화해야합니다. 이 두 공간과 시간 제한은 거의 주어진 실험 조건을 위해, 다른 사람은 강력한 기본값으로 설정되고 재고할 필요가 있거든요. 예를 들어, 잘못된 경보의 수를 직접 대부분의 경우 만족 프레임 당 하나 이상의 따라서 더 적은 백만 픽셀 당 미만 오류를 보장하기 위해 설정됩니다. 모든 매개 변수는 사용자가 분석에 사용되었다 어떤 설정을 나중에 확인할 수 있도록 출력 폴더의 텍스트 파일에 저장됩니다. s/ftp_upload/3599/3599fig3.jpg &quot;고도 =&quot;그림 3 &quot;/&gt; 그림 3. MTT 분석의 주요 단계. 형광 이미지의 실험 스택에서 시작은 봉우리가 순차적으로 그리고 자동으로 감지 가우스 발작 및 프레임 이상 다시 연결 (작업의 첫 번째 범위, 순서도의 위쪽 부분)에 의해 추정된다. 자국이 더욱 궁극적으로 관련 설명 (운영 초 범위, 낮은 부분)의 역동적인지도로 이어지는 예를 들어, putative 감금에 대해 분석할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3599/3599fig4.jpg" alt="그림 4" /> 4 그림. 상표 원자는 MTT에 영향을주지 않습니다. artefactual multivalent 라벨에 의해 도입된 가능한 편견을 평가하기 위해 MTT 분석은 궤도의지도를 생성하고 분석, 2 개의 서로 다른 스키마를 사용하여 태그를 내생 EGFR을 추적하기 위해 수행되었다. 프로토콜의 설명에 따라 (A) 수용체는 biotinylated 팹 및 양자-dots605-streptavidin 태그가되었다.이 경우에는 양자 - 도트와 streptavidins의 다중 결합은 단일 염료로 여러 수용체에 결합이 생길 수 있습니다. (B) 수용체를 직접 유기 염료, Atto647N에 결합 팹 태그가되었다. 이 경우 하나의 팹, 따라서 한 수용체는 두 개 이상의 염료를 결합 수 있습니다. (C) 평방 변위 (MSD) 곡선은 양자 점이나 Atto 염료 (왼쪽 및 오른쪽 그래프, 각각)로 중 분류, 각 세포의 모든 성분에 대해 계산되었습니다 평균입​​니다. 확산 계수는 엠에스디 (빨간 점선)의 다섯 가지 첫째 점 이상의 선형 발작에 의해 계산되었다. 유사한 확산 값 (중앙 그래프)로 이끌어 레이블링 각각의 구조. Qdot : 양자-dots605 (n은 = 5 셀), Atto : Atto647N (N = 7 셀), NS :하지 상당 (학생의 T-테스트 P 값&gt; 0.05).

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+digestion+of+monoclonal+antibodies.">Enzymatic digestion of monoclonal antibodies.</a> Methods Mol. Med. 40, 325-331 (2000).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission:+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 19, 780-782 (1994).</li><li>Klar, T. A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+resolution+in+far-field+fluorescence+microscopy.">Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 24, 954-956 (1999).</li><li>Meilhac, N., Guyader, L. L. e., Salome, L., Destainville, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+confinement+and+jumps+in+single-molecule+membrane+trajectories.">Detection of confinement and jumps in single-molecule membrane trajectories.</a> Phys. Rev. E. Stat. Nonlin. Soft. Matter Phys. 73, 011915 (2006).</li><li>Saxton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+effects+of+corrals.">Single-particle tracking: effects of corrals.</a> Biophys. J. 69, 389-398 (1995).</li><li>Serge, A., Fourgeaud, L., Hemar, A., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+activation+and+homer+differentially+control+the+lateral+mobility+of+metabotropic+glutamate+receptor+5+in+the+neuronal+membrane.">Receptor activation and homer differentially control the lateral mobility of metabotropic glutamate receptor 5 in the neuronal membrane.</a> J. Neurosci. 22, 3910-3920 (2002).</li><li>Simson, R., Sheets, E. D., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+temporary+lateral+confinement+of+membrane+proteins+using+single-particle+tracking+analysis.">Detection of temporary lateral confinement of membrane proteins using single-particle tracking analysis.</a> Biophys. J. 69, 989-993 (1995).</li><li>Jacobson, K., Dietrich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+lipid+rafts.">Looking at lipid rafts.</a> Trends Cell Biol. 9, 87-91 (1999).</li><li>Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confined+lateral+diffusion+of+membrane+receptors+as+studied+by+single+particle+tracking+(nanovid+microscopy).+Effects+of+calcium-induced+differentiation+in+cultured+epithelial+cells.">Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells.</a> Biophys. J. 65, 2021-2040 (1993).</li><li>Livneh, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+deletions+in+the+cytoplasmic+kinase+domain+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+do+not+affect+its+laternal+mobility.">Large deletions in the cytoplasmic kinase domain of the epidermal growth factor receptor do not affect its laternal mobility.</a> J. Cell Biol. 103, 327-331 (1986).</li><li>Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dot+bioconjugates+for+imaging,+labelling+and.">Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and.</a> 4, 435-446 (2005).</li><li>Wu, X., Bruchez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+cellular+targets+with+semiconductor+quantum+dot+conjugates.">Labeling cellular targets with semiconductor quantum dot conjugates.</a> Methods Cell Biol. 75, 171-183 (2004).</li><li>Mohammadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation-induced+activation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+protein+tyrosine+kinase.">Aggregation-induced activation of the epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase.</a> Biochemistry. 32, 8742-8748 (1993).</li><li>Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monovalent,+reduced-size+quantum+dots+for+imaging+receptors+on+living+cells.">Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells.</a> Nat. Methods. 5, 397-399 (2008).</li><li>Bertaux, N., Marguet, D., Rigneault, H., Serg&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-target+tracing+(MTT)+algorithm+probes+molecular+dynamics+at+cell+surface.">Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface.</a> Protocol Exchange. , (1038).</li><li>Groc, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+trafficking+of+neurotransmitter+receptor:+comparison+between+single-molecule/quantum+dot+strategies.">Surface trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 12433-12437 (2007).</li><li>Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+at+a+time,+live+tracking+of+NGF+axonal+transport+using+quantum+dots.">One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).</li><li>He, H. T., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+nanodomains+in+living+cell+membrane+by+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 417-436 (2011).</li><li>Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+complexes+and+clusters:+functional+advantages+and+methodological+hurdles.">Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles.</a> J. Cell. Sci. 123, 309-320 (2010).</li><li>Kao, H. P., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+of+single+fluorescent+particles+in+three+dimensions:+use+of+cylindrical+optics+to+encode+particle+position.">Tracking of single fluorescent particles in three dimensions: use of cylindrical optics to encode particle position.</a> Biophys. J. 67, 1291-1300 (1994).</li></ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

단일 입자 추적에서 세포와 현미경 측면 옆에, 분석 작업의 상당한 부분을 나타냅니다. , 검출 추정하고 각 프레임 이상의 봉우리를 다시 연결 : 이것은 세 가지 주요 작업을 수행하는 데 사용되는 알고리즘을 해결합니다. 그러나이 작품의 결과의 양상은 마지막 여분의 단계 (예 : 운동 모드, 상호 작용 또는 stoichiometry를 해독 등)에 대한 본질적으로 새로운 헌신 조사를 위해 적응해야 할 수도 알고?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 양 </td></tr><tr><td> 있으니까요-7 세포주 </td><td> ATCC </td><td> CRL-1651 </td><td> 5,000 세포 /도 </td></tr><tr><td> 칼슘이없는 HBSS + </td><td> GIBCO </td><td> 14,175 </td><td> 한 ML </td></tr><tr><td> 0.05 % 트립신 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> GIBCO </td><td> 25,300 </td><td> 한 ML </td></tr><tr><td> 실험실 - 테크 8도 </td><td> NUNC </td><td> 155,441 </td><td> 일 </td></tr><tr><td> QDot-605 streptavidin </td><td> Invitrogen </td><td> Q10101MP </td><td> 20 MM </td></tr><tr><td colspan="4"> Biotinylated 팹 (팹 합성을 위해, 참고 21 참조) </td></tr><tr><td> mAb 108의 팹 </td><td> ATCC </td><td> HB-9764 </td><td> 200 μg </td></tr><tr><td> 보건국-비오틴<html></td><td> 써모 과학 </td><td> 21,435 </td><td> 18.5 μg </td></tr><tr><td colspan="4"> 매체를 완료 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 41,965 </td><td> 500 ML </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 시그마 </td><td> F7524 </td><td> 50 ML </td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> GIBCO </td><td> 25,030 </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15,630 </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td> 나트륨 Pyruvate </td><td> GIBCO </td><td> 11,360 </td><td> 5 ML </td></tr><tr><td colspan="4"> 이미징 매체 </td></tr><tr><td> 칼슘 2 HBSS + </td><td> GIBCO </td><td> 14,025 </td><td> 25 ML </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15,630 </td><td> 250 μl </td></tr></tbody></table>1 &quot;&gt; <tbody><tr><td> 장비 </td><td> 회사 </td><td> 참고 </td></tr><tr><td> 거꾸로 현미경 </td><td> 니콘 </td><td> 이클립스 TE2000U </td></tr><tr><td> 형광등 </td><td> 니콘 </td><td> Intensilight C-HGFIE </td></tr><tr><td> 1.3 NA 100x 목적 </td><td> 니콘 </td><td> 형석 1.30 계획 </td></tr><tr><td> 1.49 NA 100x 목표 </td><td> 니콘 </td><td> APO TIRF 1.49 </td></tr><tr><td> 카메라 </td><td> Roper 과학 </td><td> 캐스케이드 512 B </td></tr><tr><td> Thermostated 박스 </td><td> 생활 이미징 서비스 </td><td> 박스 </td></tr></tbody></table> 부록 : MTT 보충 분석의 예제 스크립트 함수 MTT_example (FILE_NAME) MTT 출력 결과를 복구하는 방법을 보여주 %의 %는 기본 예제 %의 %는 각 trac의 주술전자와 히스토그램 구축 형광 강도의 %를 %의 % nargin &lt;1 %하더라도 FILE_NAME은 제공하지? 파일 = 디렉토리 ( &#39;* stk.&#39;); isempty (파일), disp ( &#39;현재 디렉토리에 데이터&#39;), 수익, 최종 경우 . FILE_NAME = 파일 (1) 이름, % 기본값 : 첫번째 stk 파일 disp ([ &#39;기본적으로&#39;FILE_NAME을 &#39;사용&#39;]) 끝 file_param = [FILE_NAME &#39;_tab_param.dat&#39;]; %의 출력 파일 % 실험로드 데이타 버전에 따라 CD ( &#39;output23&#39;) % 또는 ( &#39;output22&#39;), 사용 % 면책 조항 : 버전 2.2는 7 매개 변수를 생성 % 추가 파라미터, 잡음은, 버전 2.3에서 추가되었다 단일 테이블에서 한 번에 모든 매개 변수를 읽지 % % tab_param = fread_all_param (file_param); %의 타b_i = tab_param (2시 8분 : 끝 :); tab_j = ... 별도의 테이블에있는 모든 매개 변수 (frame_number 제외) 읽을 % % [tab_i, tab_j, tab_alpha, tab_radius, tab_offset, tab_blk, tab_noise] = fread_all_data_spt (file_param); tab_i = fread_data_spt (file_param, 3), 추적 번호 및 프레임 번호, 유익하지 않은가, 삭제되기 때문에 %의 색인은 3입니다! tab_j = fread_data_spt (file_param, 4); tab_alpha = fread_data_spt (file_param, 5); tab_blk = fread_data_spt (file_param, 8); 흔적 % 이상 %의 루프 N_traces = 크기 (tab_i, 1); %의 테이블은 N_frames의 colums 의한 N_traces 라인입니다 N_traces : itrc = 1 No_blk_index = tab_blk (itrc, :)&gt; 0;만을 % 이외의 점멸 단계 줄거리 (tab_i (itrc, No_blk_index), tab_j (itrc, No_blk_index)) &amp; NBSP, xlabel ( &#39;I (픽셀)&#39;), ylabel ( &#39;J (픽셀)&#39;) 제목 ([ &#39;트레이스 #&#39;num2str (itrc)]) disp ( &#39;앞으로 추적에 대한 열쇠를 칠하세요&#39;), 일시 정지 끝 %의 % Fluo 히스토그램 N_datapoints = SUM (tab_blk (:)&gt; 0); % 이외의 점멸 단계에서만 2sqrt (N) 방식을 사용 hist (tab_alpha (tab_blk&gt; 0), 2 * sqrt (N_datapoints)) % xlabel ( &#39;강도 (AU)&#39;), ylabel ( &#39;사건&#39;) 제목 ( &#39;입자 형광 강도의 히스토그램&#39;)

mapping molecular diffusion in the plasma membrane by multiple-target tracing (mtt)

우리의 목표는 서로 다른 생물 학적 기능에 세포의 세포막에서 발생하는 분자 공정의 포괄적인 설명을 얻을 것입니다. 다중 타겟 추적 (MTT) 1 : 우리는 고밀도로 단일 입자 추적 (SPT) 전용 분석 도구를 개발하여, 단일 분자 수준에서 복잡한 조직 및 플라즈마 막의 역학을 특성화 목표로하고 있습니다. 밀리초 및 nanometric 해상도 1-11을 제공하는 단일 분자 videomicroscopy은 정확하게 같은 세포 수용체의 현지화, 이동성, 감금이나 상호 작용과 같은 설명을 매핑하여 멤브레인 조직 12-14에 대한 상세한 표현이 가능합니다. 우리는 모두 실험적 및 algorithmically, SPT를 revisited. 실험적 측면 분자 역학 동적 스냅샷을 제공하기 위해, 최대한 라벨 밀도에 도달 특정 중심으로, 설치 및 셀 라벨을 최적화 포함의 그것은 멤브레인 내에 발생합니다. 봉우리 감지, 평가 및 재연결, 이미지 분석, 15,16에서 특정 도구에 의해 해결 : 알고리즘 문제의 탄도를 재건에 사용되는 각 단계를 우려. 감지 후 수축을 구현하는 구조 봉우리는 초기에 인근, 강한 봉우리에 의해 숨겨져 있습니다. 참고, 탐지를 개선하는 것은 바로 궤도 내에 격차를 줄임으로써, 다시 연결 영향을 미칩니다. 공연은 일반적으로 높은 spatiotemporal 해상도에서 병렬 측정을위한 두 가지 주요 한계를 나타내는 다양한 라벨 밀도와 소음 값에 대한 몬테 칼로 시뮬레이션을 이용하여 평가되었다. photoswitching 또는 비선형 광학에 / 오프 중 연속된을 사용하여 단일 분자를 위해 얻은 nanometric 정확도 17, 철저한 관찰을 제공할 수 있습니다. 이렇게 17 같은 스톰 18, 종려 19,20, RESOLFT 21 22,23을서도 전혀 두려움을 모르는 강인한, whi 같은 nanoscopy 방법의 기초채널은 종종 이미지 고정 샘플을 요구할 수 있습니다. 중앙 작업은 단일 분자에서 냄새가 나는데 회절 - 제한된 봉우리의 탐지 및 추정이다. 따라서 이러한 브라운 운동 대신 상수 위치 정확도를 취급하는 등 적절한 가정을 제공 MTT는 straightforwardly nanoscopic 분석에 적합합니다. 또한, MTT는 근본적으로 모든 규모에서 사용할 수 있습니다 분자에 대한, 또한 세포 또는 동물만이 아니라, 예를 들면. 따라서 MTT는 분자 및 세포의 비늘에서 응용 프로그램을 발견 강력한 추적 알고리즘이다.

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Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

다중 표적 추적은 살아있는 세포의 플라즈마 멤브레인 내에 개별적으로 분류된 분자를 추적용으로 개발된 수제 알고리즘입니다. 효율적으로 검출 nanoscale 멤브레인 역학을 조사하기 위해 사용자 친화적인, 포괄적인 도구를 제공하는 고밀도에서 시간에 따른 분자를 추정하고 추적.

다중 타겟 추적 (MTT)에 의해 플라즈마 막의 분자 확산을 매핑

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

17.1K 조회수.  Parc scientifique de Luminy. 다중 표적 추적은 살아있는 세포의 플라즈마 멤브레인 내에 개별적으로 분류된 분자를 추적용으로 개발된 수제 알고리즘입니다. 효율적으로 검출 nanoscale 멤브레인 역학을 조사하기 위해 사용자 친화적인, 포괄적인 도구를 제공하는 고밀도에서 시간에 따른 분자를 추정하고 추적.

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Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Astrocytes의 플라즈마 막 글로벌 세포내 칼슘 역학 니어 측정

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

연구

생물학

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

가역 Biotinylation에 의해 플라즈마 막 단백질 Endocytic 요금 측정

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

유동세포계측법에 의해 플라즈마 막에 GLUT4 Translocation의 양적 측정

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 결정화

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

플라즈마 레티놀 바인딩 단백질의 막 수용체의 레티놀 전송의 실시간 분석

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new insights to plasma membrane protein function and regulation. Recently, k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS)1&#160;was developed to enable routine measurements of diffusion coefficients directly from images of fluorescently tagged plasma membrane proteins, that avoided systematic biases introduced by probe photophysics. Although the theoretical basis for the analysis is complex, the method can be implemented by nonexperts using a freely available code to measure diffusion coefficients of proteins. kICS calculates a time correlation function from a fluorescence microscopy image stack after Fourier transformation of each image to reciprocal (k-) space. Subsequently, circular averaging, natural logarithm transform and linear fits to the correlation function yields the diffusion coefficient. This paper provides a step-by-step guide to the image analysis and measurement of diffusion coefficients via kICS.
First, a high frame rate image sequence of a fluorescently labeled plasma membrane protein is acquired using a fluorescence microscope. Then, a region of interest (ROI) avoiding intracellular organelles, moving vesicles or protruding membrane regions is selected. The ROI stack is imported into a freely available code and several defined parameters (see Method section) are set for kICS analysis. The program then generates a &#34;slope of slopes&#34; plot from the k-space time correlation functions, and the diffusion coefficient is calculated from the slope of the plot. Below is a step-by-step kICS procedure to measure the diffusion coefficient of a membrane protein using the renal water channel aquaporin-3 tagged with EGFP as a canonical example.

This paper provides a step by step guide to the fluctuation analysis technique k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS) for measuring diffusion coefficients of fluorescently labeled plasma membrane proteins in live mammalian cells.

K-공간 이미지의 상관 관계 분광학을 사용하여 EGFP-태그 플라즈마 막 단백질의 확산 계수의 간편한 측정

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

pTIRFM와 이미징 플라즈마 막 변형

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

형광 현미경으로 살아있는 세포의 잠재적 인 미토콘드리아의 칼슘과 미토콘드리아 막의 동시 측정

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

원형질 막 주변 관련 된 단백질에 대 한 분할 결정

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and activates the mixed lineage kinase-like domain pseudokinase, MLKL, to rupture or permeabilize the plasma membrane. Necroptosis is an inflammatory pathway associated with multiple pathologies including autoimmunity, infectious and cardiovascular diseases, stroke, neurodegeneration, and cancer. Here, we describe protocols that can be used to characterize MLKL as the executioner of plasma membrane rupture in necroptosis. We visualize the process of necroptosis in cells using live-cell imaging with conventional and confocal fluorescence&#160;microscopy, and in fixed cells using electron microscopy, which together revealed the redistribution of MLKL from the cytosol to the plasma membrane prior to induction of large holes in the plasma membrane. We present in vitro nuclear magnetic resonance (NMR) analysis using lipids to identify putative modulators of MLKL-mediated necroptosis. Based on this method, we identified quantitative lipid-binding preferences and phosphatidyl-inositol phosphates (PIPs) as critical binders of MLKL that are required for plasma membrane targeting and permeabilization in necroptosis.

We report methods for characterization of MLKL-mediated plasma membrane rupture in necroptosis including conventional and confocal live-cell microscopy imaging, scanning electron microscopy, and NMR-based lipid binding.