이 방법은 세포 대 세포 접촉에서 접착 또는 인식을 중재하는 수용체와 특정 리간드가 상호 작용을 유발하는지 여부와 같은 세포 대 세포 상호 작용 분야의 주요 질문을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 고정 또는 중단이 필요없는 살아있는 세포에서 직접 그러한 상호 작용을 조사 할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 배양 된 세포 사이의 상호 작용을 조사하는 데 사용되지만 다른 시스템 모노 멤브레인 소포 또는 소형 모델 유기체에도 적용 될 수 있습니다.
일반적으로 이 방법을 새로 사용하는 개인은 세포 이동과 느린 신호 변동을 주의 깊게 검사하여 몇 분 동안 수집할 수 있을 만큼 샘플이 충분히 안정적이다는 것을 확인해야 합니다. 첫째, 배설 전 날 6웰 플레이트의 적어도 4개의 우물에서 적절한 수의 세포를 시드한다. DMEM 배지에서 섭씨 37도5%의 이산화탄소를 10%의 FBS와 1%L-글루타민으로 보충하여 세포를 배양합니다.
녹색 또는 노란색 형광 단백질및 별도의 우물에서 적색 형광 단백질에 융합된 관심있는 단백질에 대한 기본 실험 트랜스펙트 플라스미드를 수행한다. 4 시간 후 성장 매체를 제거하고 세척 하는 동안 세포의 분리를 방지 하기 위해 잘 가장자리에 마그네슘과 칼슘 떨어지는 PBS로 보충 PBS의 1 밀리 리터와 함께 각 잘 씻어. 그런 다음 PBS를 제거합니다.
EDTA 용액의 약 50 마이크로리터를 각 웰에 현명하게 떨어뜨려 세포의 분리를 용이하게 합니다. 2 분 동안 섭씨 37도에서 배양 한 후, 천천히 세포를 분리하기 위해 측면으로 6 웰 판을 흔들어. 다음으로, 각 우물에 950 마이크로리터의 성장 배지를 추가하고 몇 번 위아래로 파이프하여 모든 세포를 우물 바닥에서 분리하여 세포를 다시 중단합니다.
셀이 제대로 다시 중단되고 재발 후 큰 셀 응집체가 없는지 시각적으로 확인하여 서로 분리되는지 확인합니다. 하나의 셀 용액을 해당 우물로 전달합니다. 위아래로 몇 번 파이프를 통해 부드럽게 섞는다.
그런 다음 혼합 세포를 35mm 유리 바닥 접시에 넣고 1일 동안 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 종자 세포를 배양합니다. 레이저 스캐닝 공초점 현미경 소프트웨어에서 광학 경로를 설정합니다. 스펙트럼 크로스토크를 피하기 위해 두 개의 별도 트랙을 선택하여 mEGFP 또는 mEYFP 및 mCherry 또는 mCardinal를 순차적으로 감지하고 모든 라인을 스위치 트랙을 선택합니다.
탐지를 위해 두 채널모두에 적합한 필터를 사용합니다. 혼합 된 세포가 들어있는 접시를 샘플 홀더에 놓습니다. 온도 평형을 보장하고 초점 드리프트를 줄이기 위해 10 분을 기다린 후 찾기 메뉴에서 전송 광을 사용하여 셀에 집중하십시오.
서로 접촉하는 빨간색과 녹색 셀 쌍을 검색합니다. 다음으로, 자르기 버튼을 사용하여 셀 간 접촉에 수직으로 스캔 경로를 선택합니다. 확대/축소하여 50~200나노미터의 픽셀 크기를 달성하고 스캔 모드에서 선을 선택합니다.
프레임 크기를 1픽셀씩 128으로 설정합니다. 스캔 속도를 허용값으로 설정합니다. 그런 다음 사이클을 100, 000에서 500, 000으로 설정합니다.
이 에 따라, 적절한 레이저 힘을 선택합니다. 검출기를 Photon 카운팅 모드로 설정합니다. 시작 실험을 눌러 인수를 시작합니다.
원시 데이터 파일을 원시 데이터 형식으로 RGB TIF 이미지로 내보냅니다. 이 파일에는 이미지의 G와 R이라고 불리는 채널의 녹색 및 빨간색 채널 데이터가 있는 키모그래프가 각각 포함됩니다. 다음으로, 적절한 분석 소프트웨어와 TIF 파일을 가져오고 분석을 수행합니다.
세그먼트별 시간 평균을 500~1000줄의 블록으로 정렬합니다. 각 블록의 멤브레인 위치를 결정합니다. 그런 다음 모든 블록을 동일한 측면 위치로 이동합니다.
시간 축을 따라 정렬된 모든 선을 요약하고 가우시안 함수를 사용하여 평균 강도 프로파일에 맞습니다. 멤브레인 위치에 해당하는 픽셀을 멤브레인 위치의 플러스 또는 마이너스 2.5 시그마 내의 모든 픽셀로 정의하고 각 회선에 대해 단일 형광 신호 값을 얻는 각 라인의 이러한 픽셀의 강도를 합산합니다. 사진 표백이 관찰되면 멤브레인 형광 시계시리즈를 이중 지수 기능으로 피팅하고 적절한 교정 공식을 적용하여 표백 보정을 적용하십시오.
적절한 방정식에 따라 자동 및 상관 관계 간 함수를 계산합니다. 분석의 신뢰성을 개선하고 아티팩트를 피하기 위해 총 측정의 10~20개 세그먼트에 대한 계산을 수행합니다. 각 세그먼트의 형광 시계열 및 상관 관계를 검사하고 명확하게 왜곡된 세그먼트를 제거합니다.
마지막으로 왜곡되지 않은 모든 세그먼트를 평균값으로 값값으로 구분합니다. 데이터를 분석하는 동안 각 세그먼트의 강도 시계열 및 상관 관계를 주의 깊게 검사하여 멤브레인 주변의 세포내 소포로 인해 왜곡을 방지합니다. MYristolyated-팔미토일레이트-mEYFP 또는 mCardinal를 발현하는 HEK 293T 세포의 강도 이미지가 여기에 나와 있다.
자동 상관 기능으로 인해 플라즈마 멤브레인에서 골수-팔미토일레이트-mEYFP 및 mCardinal의 확산을 위해 10~20밀리초의 특징적인 붕괴 시간을 표시하는 동안 0에 가까운 상대교차 상관관계가 관찰되었다. 막 고정 된 이종수 심근을 발현하는 HEK 293T 세포의 sFCCS 측정의 교차 상관 기능은 양진폭을 보였으며 자기 상관 관계 기능과 유사한 부패 시간을 보였다. APLP1-mEYFP와 APLP1-mCardinal 발현 세포 사이의 세포 대 세포 접촉에 대한 sFCCS 측정은 0.45의 양극상대 상호 상관관계를 초래하였다.
세포-세포 접촉에서 APLP1 클러스터에 걸쳐 측정에서 얻은 sFCCS 상관 기능 큰 지연 시간에 진동에서 큰 부패 시간에서 분명 하 고 강하게 감소 된 역학을 보였다. 아연 이온을 추가하면 상대적 상호 상관관계가 평균 0.8로 증가했습니다. 또한 분자 밝기는 작은 올리고머에서 각 세포에 10~50개의 단량체로 구성된 더 큰 멀티머로 크게 증가했습니다.
과도 성 불안정은 음의 값 또는 높은 거짓 긍정 교차 상관 관계를 갖는 상관 관계 간 함수를 초래할 수 있습니다. 해당 상관 관계 함수는 일반적으로 대부분의 세그먼트에서 강하게 이탈합니다. sFCCS 교차 상관 번호 및 밝기에 대한 보완적인 접근법으로 단백질 단백질 상호 작용을 감지하는 데 사용할 수 있습니다.
이 절차를 시도하는 동안 전염된 세포의 혼합이 중요한 단계라는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 세포를 부드럽게 혼합하고 형질 전환 효율성을 최적화하여 접촉시 적색 및 녹색 세포를 찾을 확률을 높입니다. 개발 후이 기술은 면역학 분야의 연구원에 의해 사용되어 면역학 시냅스에서 신호 분자의 상호 작용을 탐구합니다.
