이 작품은 EU (STREP 프로젝트 241577 &quot;큰 마음,&quot;제 7 회 유럽 프레임 워크 프로그램, CP), MENARINI 국제 운영 룩셈부르크 (AM), 텔레 톤 GGP07133 (CP)과 길르앗 과학 (AM)에 의해 지원되었다.

인체 조직에 대한 실험 프로토콜은 Careggi 대학 병원 (, 2009 년 갱신 2006 / 0024713)의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 각 환자는 서면 동의서를 주었다. 1. 솔루션 및 장비 제조 용액은 표 1에 기재되어있다. 세포 격리 절차의 간략화 흐름도는도 1에서 발견된다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> 해결 </td><td> CP </td><td> DB </td><td> KB </td><td> TB </td><td> PS </td><td> EB1 </td><td> EB2 </td></tr><tr><td rowspan="23"> 시약 (MM) </td><td> KH 2 PO 4 </td><td> (50) </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 망초 </td><td> 8 </td><td> 1.2 </td><td> 5 </td><td></td><td></td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 </td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 아데노신 </td><td> 5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> (140) </td><td> 10 </td><td> (20) </td><td> 10 </td><td></td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 만니톨 </td><td> (100) </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 타우린 </td><td> 10 </td><td> (20) </td><td> 5 </td><td></td><td></td><td> (20) </td><td> (20) </td></tr><tr><td> 염화나트륨 </td><td></td><td> 113 </td><td></td><td> 136 </td><td></td><td> 113 </td><td> 113 </td></tr><tr><td> 의 KCl </td><td></td><td> 4.7 </td><td> 85 </td><td> 5.4 </td><td> 25 </td><td> 4.7 </td><td> 4.7 </td></tr><tr><td> MgCl2를 </td><td></td><td> &lt;/ TD&gt; <td></td><td> 1.2 </td><td> 5 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td></td><td> 0.6 </td><td> (30) </td><td></td><td></td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> 나 2 HPO 4 </td><td></td><td> 0.6 </td><td></td><td></td><td></td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> 탄산 수소 나트륨 </td><td></td><td> 12 </td><td></td><td></td><td></td><td> 12 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> KHCO 3 </td><td></td><td> 10 </td><td></td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> NA-피루 베이트 </td><td></td><td> 4 </td><td></td><td></td><td></td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> BDM </td><td></td><td> 10 </td><td></td><td></td><td></td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> BHBA </td><td></td><td></td><td> 5 &lt;/ TD&gt; <td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 숙신산 </td><td></td><td></td><td> 5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td></td><td> 0.5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> K 2 - ATP </td><td></td><td></td><td> 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 피루브산 </td><td></td><td></td><td> 5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 크레아틴 </td><td></td><td></td><td> 5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> KMES </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 115 </td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> 효소 (U / ㎖) </td><td> 콜라게나 유형 V </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 250 &lt;/ TD&gt; <td> (250) </td></tr><tr><td> 단백질 분해 효소 타입 XXIV </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 4 </td><td></td></tr><tr><td> pH를 </td><td></td><td> 7.4 KOH </td><td> 7.3의 NaOH </td><td> 7.1 KOH </td><td> 7.35의 NaOH </td><td> 7.2 KOH </td><td> 7.3의 NaOH </td><td> 7.3의 NaOH </td></tr></tbody></table> .. 표 1 표본 수집, 세포 분리 및 근육 세포의 기능 특성 CP = 심정지 솔루션에 사용되는 솔루션; DB = 해리 버퍼; KB는 = 크래프트 - Bruhe 솔루션; TB = 타이로드 버퍼; PS = 피펫 솔루션; EB1 = 효소 버퍼 1; EB2 = 효소 완충액 2. <ol><li> 심정지 (CP) 솔루션을 준비합니다. CP 솔루션은 최대 1 주일 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 칼슘 2 + 무료 해리 버퍼 (DB)를 준비합니다. 이 솔루션은 일 이내에 사용해야합니다. </li><li> 크래프트 - Bruhe (KB) 솔루션을 준비합니다. KB 솔루션은 최대 1 잠깐 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다K. </li><li> 칼슘 2 + 무료 타이로드 버퍼 (TB)를 준비합니다. 이 솔루션은 일 이내에 사용해야합니다. </li><li> 사용 전에 주사기 필터를 사용하여 모든 해법 필터. </li><li> 소화 장치 (그림 2), 전기 모터에 의해 회전 중 하나는 실리콘 엘라스토머의 마주 보는 두 브러쉬, 만든 긁는 용기를 준비합니다. 소화 장치가 정의되어 있습니다. 소화 장치에 대한 세부 사항은 그림 8에있다; 장치의 이미지는 그림 2 C 및 2D에 있습니다. 70 %의 에탄올과 물과 조직 챔버를 씻으십시오. </li></ol> 심근 샘플 2. 수집 및 처리 <ol><li> 50 ML 튜브에 cardiplegic (CP) 용액 40 ㎖를 붓고는 세포 격리 실험실에 수술 방에서 표본 교통 얼음에 저장합니다. </li><li> 얼음 추위로 씻어, 즉시 절제 후 수술 방에서 심실 심근 표본을 수집CP 솔루션과 튜브에 저장합니다. 심장 수술시 상단 간 심실 중격, 가중치&gt; 100 밀리그램 절제 심 내막 표본을 사용합니다. </li><li> 급속 랩 영역으로 시험편을 전송; 시편 절단에서 10 분 이내에 시료 처리를 시작합니다. </li><li> 아이스 콜드 CP 버퍼의 표본을 유지하면서, 신중하게 실체 현미경 하에서 미세 가위를 사용하여 심 내막 섬유 성 층을 제거; 그 후, 작은 조각 (긴 2-3mm)에 심근 조직을 잘라. 조직 샘플의 크기에 따라, 각각의 분리를 위해 100 밀리그램 1g 사이의 심실의 심근의 총 금액을 잘라. </li><li> 조직 닦지 완료되면 깨끗한 얼음 차가운 CP 솔루션, 소화 장치에 심근 청크를 전송합니다. 더 이상 전체 조직의 1g 이상을 사용하지 않고, 심근 덩어리 두 개의 실리콘 브러쉬의 전체 볼륨 (3-4 ㎖)에 작성하지 마십시오. </li></ol> 3. 세탁 및 심근 덩어리의 소화 <ol><li> 선미덩어리가 소화 장치의 스크 레이 핑 챔버로 전송 어, 차가운 칼슘 2 + 무료 해리 버퍼 (DB)와 챔버의 CP 버퍼를 변경합니다. </li><li> 욕조에서 가열 된 물 (그림 1)과 접촉 될 수있는 챔버에 대한 위해, 온도 조절 욕조에 소화 장치를 놓습니다. 37.5 ° C로 목욕을 설정하고 천천히 조직 챔버의 온도를 올리기 위하여, 전원을 켜십시오. 1 회전 / 초에 회전 속도를 설정, 소화 장치의 모터의 전원을 켭니다. </li><li> 매 8 분 깨끗한 DB와 챔버 내의 용액을 변경 DB로 3 회 세척을 수행한다. DB는 (37 ° C에서)를 따뜻하게하고 산소가 심근 덩어리와 접촉 얻기 전에 포화 상태입니다. </li><li> DB 솔루션에 콜라게나 유형 V와 4 U / ㎖ 프로테아제 유형 XXIV 250 U / ㎖를 추가하여 효소 버퍼 1 (EB1)를 준비합니다. DB 솔루션에 250 U / ㎖의 콜라게나 제 유형 V를 추가하여 효소 버퍼 2 (EB2)을 준비합니다. (37 ℃)과 oxygenat 워밍업전자 EB1과 EB2. </li><li> (37 ° C에서) 100 % 산소 EB1으로 회전 소화 장치에서 소화의 두 12 분주기를 수행합니다. 각주기에서 EB1의 ~ 3 ㎖를 사용합니다. 피펫 흡인하여 솔루션을 제거하고 각 사이클 후 폐기합니다. </li><li> 세포 수집 및 ~ 버퍼를 용출 감기 (4 ° C) KB 용액 80 ㎖를 위해 6 ~ 15 ML 튜브를 준비합니다. </li><li> 37 ℃에서 3 ㎖ 100 % 산소 EB2로 처음 15 분 소화주기를 수행 소화 사이클 후, 15 ㎖의 튜브에서 제 해리 근세포를 포함하는 용액을 수집하고 12 ml의 차가운 KB 용액으로 세포 현탁액을 희석. 실온에서 튜브를 보관. </li><li> 다음 소화 사이클 동안 콜라게나 V의 농도를 반감하기 위해 DB의 동일한 양으로 잔존 EB2 용액을 희석. </li><li> 37 ° C에서 3 ㎖의 EB2와 다른 5 12 분 소화주기를 수행; 각각 후 15 ML 원뿔 튜브에 버퍼를 포함하는 심근 세포의 수집12 ML의 KB 솔루션을 희석. 실온에서 30 분 동안 6 셀 함유 튜브를 저장한다. </li></ol> 4. 셀의 재 부상과 칼슘 2 + Readaptation <ol><li> 20 ㎖ 칼슘 2 + 무료 타이로드 버퍼 (TB)에 1 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민 (BSA)를 추가합니다. 솔루션을 필터링합니다. </li><li> 해결하는 심근 세포를 강제로 5 분 100 XG에 여섯 심근 포함하는 원뿔 튜브를 원심 분리기. 뜨는을 제거하고 실온에서 TB를 포함하는 BSA의 (수율에 따라 1-3 ML) 변수 양의 각각의 튜브에 세포를 재현 탁. </li><li> 점차적으로 100 밀리몰 / L의 염화칼슘 용액을 작은 분량 씩 추가하여 셀이 포함 버퍼에 칼슘 2 + 농도를 증가시킨다. 제 1 및 제 2 단계에서 칼슘 2 + 농도는 각각 50 μmol / L, 100 μmol / L까지 발생합니다. 다음 칼슘 2 + 추가 단계는 5 분마다 수행하고 농도는 각 단계 t에서 100 μmol / L에 의해 발생합니다0.9 밀리몰 / L의 OA 최종 농도 </li><li> 분리 과정의 수율을 평가. 현미경의 유리 바닥 챔버에 심근 함유 용액 0.5 ㎖를 전송합니다. 10 배 목표 배율에서 15 현미경 필드를 평가하고 (클리어 줄무늬와 유의 흠 예를 들어, 막대 모양의 세포, 그림 2) 건강한 심근 세포의 비율을 계산합니다. 예상 수익률은 약 20 %이다. </li></ol> 고립 된 심근 5. 기능 평가. 다음 프로토콜은 활동 전위와 세포 내 칼슘 이온 플럭스의 동시 등을 포함하여 인간의 심근 세포 기능 평가의 예입니다. <ol><li> 천공 패치 구성의 패치 클램프 실험을 위해 피펫 솔루션 (PS)을 준비합니다. 이 솔루션은 최대 3 개월 동안 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 칼슘 2 + 무료 타이로드 버퍼 (TB)에 1.8 밀리몰 / L의 염화칼슘을 추가합니다. 유SE 패치 클램프 / 형광 실험 도중 심근 superfusion이 솔루션입니다. </li><li> 1.5 ML 튜브로 전송 세포 현탁액 1 ㎖를 10 μmol / L Fluoforte 10 μL의 Powerload 집중을 추가합니다. RT에서 30 분 동안 품어. 그 후, 수직으로 튜브를 설정하고 5 분 동안 정착 셀을 떠나; 캘리포니아에있는 세포를 재현 탁 2 + TB를 포함. </li><li> (: 37 ± 0.5 ° C의 온도)의 작은 (0.5 ㎖)에 세포 현탁액 0.25 ㎖의 전송, 온도 조절 현미경은 0.3 ㎖ / 분의 유속으로 가열 microperfusor 시스템 중력 superfused 기록 챔버를 탑재. </li><li> 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 3 ~ 5 ㎛의 팁 직경 PS 가득 3 M 4.5에의 저항으로 패치 클램프 피펫을 준비합니다. </li><li> PS (250 ㎍ / ㎖)의 배치에 암포 테리 신 B를 추가하고 전극을 채우기 위해 사용합니다. </li><li> 흠없는 명확한 줄무늬가있는 막대 모양의 세포, FO를 선택접속 저항이 20 MΩ을 떨어질 때까지 RM, 5 ~ 10 분 기가 씰을 기다립니다. </li><li> 자극의 상이한 주파수 (Hz에서 0.2, 0.5 Hz에서 1 Hz의 각 주파수에서 1 분)에서 짧은 펄스 (&lt;3 밀리 초)를 사용하여 전류 클램프 모드에서 활동 전위를 유도. 녹음 단계에서 492 ± 3 nm의 시야 조명을 켜고 505-520 nm에서 Fluoforte 형광을 감지합니다. 형광을 획득하고 Digidata 1440A와 pClamp 10.0 소프트웨어를 사용하여 잠재적 인 신호를 멤브레인. 필요한 경우 기록 순서를 여러 번 반복; 그러나, 각 셀에 대한 15 분 아래의 총 녹화 시간을 유지. </li></ol>

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	<li>Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+cardiac+myocytes.+I.+Preparation+of+adult+myocytes+and+their+homology+with+the+intact+tissue.">Isolated cardiac myocytes. I. Preparation of adult myocytes and their homology with the intact tissue.</a> Cardiovascular Research. 15, 483-514 (1981).</li><li>Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+cardiac+myocytes.+II.+Functional+aspects+of+mature+cells.">Isolated cardiac myocytes. II. Functional aspects of mature cells.</a> Cardiovascular Research. 15, 549-579 (1981).</li><li>Harding, S. 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J., Nabauer, M., Erdmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+K++currents+in+isolated+human+ventricular+myocytes+from+patients+with+terminal+heart+failure.">Alterations of K+ currents in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure.</a> Circulation Research. 73, 379-385 (1993).</li><li>Virag, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slow+component+of+the+delayed+rectifier+potassium+current+in+undiseased+human+ventricular+myocytes.">The slow component of the delayed rectifier potassium current in undiseased human ventricular myocytes.</a> Cardiovascular Research. 49, 790-797 (2001).</li><li>Nanasi, P. P., Varro, A., Lathrop, D. 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O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+mechanism+of+delayed+afterdepolarizations+in+ventricular+cells+isolated+from+human+end-stage+failing+hearts.">Ionic mechanism of delayed afterdepolarizations in ventricular cells isolated from human end-stage failing hearts.</a> Circulation. 104, 2728-2733 (2001).</li><li>Cerbai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+hyperpolarization-activated+current,+I(f),+in+ventricular+myocytes+from+human+failing+heart.">Characterization of the hyperpolarization-activated current, I(f), in ventricular myocytes from human failing heart.</a> Circulation. 95, 568-571 (1997).</li><li>Kohncke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+kv+channel+recordings+in+murine+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Isolation and kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).</li><li>Tomaselli, G. 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M., Rudy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+IKr+and+IKs+heterogeneity+on+action+potential+duration+and+its+rate+dependence:+a+simulation+study.">Effects of IKr and IKs heterogeneity on action potential duration and its rate dependence: a simulation study.</a> Circulation. 99, 2466-2474 (1999).</li><li>Volders, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+contribution+of+IKs+to+canine+ventricular+repolarization:+key+role+for+beta-adrenergic+receptor+stimulation.">Probing the contribution of IKs to canine ventricular repolarization: key role for beta-adrenergic receptor stimulation.</a> Circulation. 107, 2753-2760 (2003).</li><li>Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K., Scott, A., Siegl, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoproterenol+antagonizes+prolongation+of+refractory+period+by+the+class+III+antiarrhythmic+agent+E-4031+in+guinea+pig+myocytes.+Mechanism+of+action.">Isoproterenol antagonizes prolongation of refractory period by the class III antiarrhythmic agent E-4031 in guinea pig myocytes. Mechanism of action.</a> Circulation Research. 68, 77-84 (1991).</li><li>Coppini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+approach+to+treatment+of+hypertrophic+cardiomyopathy:+pre-clinical+rationale+and+design+of+a+prospective+randomized+pilot+trial+with+ranolazine.">A translational approach to treatment of hypertrophic cardiomyopathy: pre-clinical rationale and design of a prospective randomized pilot trial with ranolazine.</a> Circulation. 125, 1 (2012).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

우리는 기술과 인간의 심실의 심근의 수술 샘플에서 실행 가능한 심근 세포를 분리하는 방법을 확인했다. 성공적으로 병에 걸린 심실의 심근에서 하나의 실행 가능한 심근 세포의 분리가 개발 및 미세 조정 된 수 있도록 심방 외과 샘플, 기술에서 고립 된 세포에 사용되었던 이전에 설명한 프로토콜에서 시작. 초기 보고서는 선택적으로, 생리 학적 자극 8,24에 변경된 전기 생리학 특성 및 ...

심근의 전기 생리학 속성의 해부는 하나의 심장 근육 세포의 분리를위한 기술의 개발 이후에 현저하게 진행되고있다. 심장 흥분 수축 커플 링 (EC-커플 링)의 이해의 최근 발전은 그대로 조직의 모든 생리 학적 특성을 보유 가능한 단일 심근를 분리하는 능력에 의해 가능하게되었다. 패치 클램프 방법은 일상적 sarcolemmal 심장 이온 전류의 함수 및 약리학 적 변조를 연구하기 위해 사용된다. 칼슘 2 +에 민감한 염료와 세포 내 칼슘 역학의 녹음은 정기적으로 EC-커플 링의 생리에뿐만 아니라 내 Ca 2 +의 병리학 적 변화에 중요한 데이터를 제공하고, 건강하고 병에 걸린 다양한 모델에서 하나의 심장 근육 세포에서 수행됩니다 기계적 손상과 심장 질환의 증가 부정맥 부담으로 이어지는 항상성. 인포이 연구에서 기 임상 설정에서 약물의 전기 생리학 및 기계적 효과를 이해하는 데 매우 중요합니다. 그러나, 횡단 전류와 심장 활동 전위와 심장 역학의 특정 기능을 설명 EC-커플 링 단백질의 종 특정 차이가 있습니다. 비 인간의 포유 동물에서 분리 된 심근 세포의 연구는 생물 물리학 적 특성과 특정 횡단 이온 채널과 EC-결합 단백질의 생리 학적 역할을 밝혀 반면 따라서, 그들은 반드시 인간의 심장 근육 세포의 관련 모델을 제공하지 않습니다. 인간의 심근에서 실행 가능한 심근 세포의 분리는 완전히 심장 질환의 병태 생리를 이해하고 새로운 치료 방법을 확인하는 것이 필수적이다. 심방 부속기는 종종 수술 과정에서 폐기 될 때 인간의 심방 조직을 쉽게 사용할 수 있습니다. 성인의 심장 활동 전위와 이온 CU의 초기 양적 연구rrents는 효소 고립 심방 세포 1-4을 채택했다. 활동 전위 또는 격리 된 성인의 심실 세포에서 전류의 기록은 이후 3,5-10을보고되었습니다. 이러한 연구의 대부분은 외식 마음에서 얻은 고립 된 세포를 얻기 위해 콜라하는 관상 동맥 세그먼트 또는 절제된 조직의 상대적으로 많은 양의 노출의 콜라게나 제 관류 중 하나를 활용 한 세포를 사용했습니다. 이러한 연구는 건강한 마음에서 인간의 심실의 심근에서 터미널 심부전 환자에서 횡단 이온 전류의 수의 상세한 특성을 허용했다. L 형의 기록은 칼슘 2 + 전류 (I CA-L) 5-7, 일시적인 외부 칼륨 전류 (I가) 8, 정류기의 칼륨 내향 전류 (I가 κ1) 8, 지연 정류기의 칼륨 전류의 다른 구성 요소는 (나는 κ ) 9가보고되었습니다. 발전 및 정제분리 절차 (10)는, 활동 전위 연장 (11)를 포함하는 단말기 심장 마비의 증가 부정맥 가능성의 이온 기준의 명확한 특성을 허용 depolarizations 12 후 지연 및 이완기 탈분극과 조기 박동을 선도 재미 현재 13 증가. 성인 심장 근육 세포는 일반적으로 다양한 효소 혼합물과 온 마음, 칼슘 2 + 허용 전지 (14)의 높은 수율을 생산하는 기술의 역 행성 관류 작은 동물에서 격리됩니다. 조직의 파편에서 심장 근육 세포의 분리는 아마 때문에 관상 동맥의 관류에 의해 달성과 비교하여 각각의 근육 세포에 효소의 제한된 액세스의 본질적으로 덜 성공합니다. 인해 미사용 도너 하트 매우 제한된 가용성, 정기적으로 통상의 인간 심실 세포를 얻는 유일한 실용적인 방법은 효소 digestio입니다선택적 수술 중에 절제 종종 매우 작은 조직 조각의 명. 철저하게 세포 수준에서 특징으로 한 인간 질병 모델은 이식 마음에 접근성으로 인해 터미널 심장 마비입니다. 그러나 터미널 심장 마비 환자의 소수에서 발생하고 종종 근본적인 원인 (15)의 상대적으로 독립적 인 심근 세포의 심한 개조의 일반적인 경로를 포함한다. 질병의 초기 단계에서 비 실패한 환자에서 단일 심장 근세포의 기능을 평가하는 능력은 다른 상속 또는 취득 조건의 구체적인 기전을 이해하는 것이 중요하다. 비후성 심근증 (HCM)는 말하고 예입니다. HCM은 일반 (1 / 500 개인) 심장 비대 특징으로 상속 심장 조건으로 인해 유출로 협착 및 이완기 기능 장애 16 부정맥 위험과 수축 변경을 증가합니다. HCM의 마음에서 심근 U셀 구조의 변화 (비대, 근원 섬유 혼란)과 EC-커플 링 (17)을 포함하는 복잡한 리모델링 프로세스를 ndergo. 그러나, HCM의 심장 세포 기능 장애의 대부분의 정보는 형질 전환 동물 모델에서왔다. HCM 환자의 소수에 불과 터미널 심부전으로 발전과 심장 이식을 필요로하기 때문에, HCM 마음은 표준 방법과 세포의 분리에 매우 드물게 사용할 수 있습니다. 그러나, HCM 환자의 30 % 이상은 수축기 (HCM) 18시 대규모 중격 비대 바꾸는 유출 요로 혈액의 흐름에 의한 폐색 증상을 개발할 수 있습니다. HCM에 방해의 기복을위한 가장 효과적인 가능한 치료 옵션은 수술 중격 절제술​​입니다 :이 수술하는 동안, 상단 격막의 변수 크기의 부분은 트랜스 대동맥 접근 방식에 의해 제거된다. 비대 격막의이 부분은 신선한 조직에서 세포 분리를위한 따라서 사용할 수 있습니다. 인간 ventricula의 분리를위한 방법R 하나의 작은 경정맥 심 내막 심근 생검 조직에서 근육 세포는 이전에 개발 된 19를 발표하고있다. 우리는 중격 절제술​​ 및 밸브 교체 절차를받은 환자를받은 HCM 환자를 포함하여 심장 수술을받은 환자에서 심실의 심근 샘플에서 단일 중격 근육 세포를 분리하는 방법을 구현했습니다. 분리 프로토콜, 대표적인 전기 생리학 및 CA 2 + 형광에 대한 자세한 설명뿐만 아니라 측정은 고립 된 인간의 심실의 심근 세포의 생존 및 패치 클램프 및 세포 내 칼슘 2 + 연구의 가능성을 보여되게됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1059">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:495px;">Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;"><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p9791?lang=it&amp;region=IT">P9791&#160;</a></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4 * 7H2O)</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/m1880?lang=it&amp;region=IT">M1880&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h3375?lang=it&amp;region=IT">H3375&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adenosine</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9251?lang=it&amp;region=IT">A9251&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8270?lang=it&amp;region=IT">G8270&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mannitol</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/m4125?lang=it&amp;region=IT">M4125&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taurine</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s7653?lang=it&amp;region=IT">S7653</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p9333?lang=it&amp;region=IT">P9333&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s7907?lang=it&amp;region=IT">S7907&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s6297?lang=it&amp;region=IT">S6297&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/237205?lang=it&amp;region=IT">237205</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p2256?lang=it&amp;region=IT">P2256&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,3-Butanedione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b0753?lang=it&amp;region=IT">B0753&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydroxide(NaOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s8045?lang=it&amp;region=IT">S8045&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/49601?lang=it&amp;region=IT">49601</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/107360?lang=it&amp;region=IT">107360</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-Hydroxybutyric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/166898?lang=it&amp;region=IT">166898</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adenosine 5&#8242;-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8937?lang=it&amp;region=IT">A8937</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Creatine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c0780?lang=it&amp;region=IT">C0780&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Succinic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s3674?lang=it&amp;region=IT">S3674&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/e0396?lang=it&amp;region=IT">E0396&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Albumin from bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a0281?lang=it&amp;region=IT">A0281</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8266?lang=it&amp;region=IT">M8266&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c9263?lang=it&amp;region=IT">C9263&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase, Bacterial, Type XXIV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium chloride solution, ~1 M in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/21115?lang=it&amp;region=IT">21115</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium chloride 0.1 M solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/53704?lang=it&amp;region=IT">53704</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium methanesulfonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/83000?lang=it&amp;region=IT">83000</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FluoForte Reagent</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ENZ-52015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Powerload concentrate, 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P10020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Perfusion Fast-Step System</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>VC-77SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amphotericin B solubilized</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9528?lang=it&amp;region=IT">A9528&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multiclamp 700B patch-clamp amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digidata 1440A</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pClamp10.0&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="108">
			<td height="108" style="height:108px;">Digestion Device</td>
			<td>CUSTOM</td>
			<td>CUSTOM</td>
			<td style="width:255px;">The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Fig 1 C-D and in Fig.7. We can provide further details if requested</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone elastomer for the digestion device&#39;s brushes</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>SYLGARD&#174; 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Variable speed rotating motor for the digestion device</td>
			<td>Crouzet</td>
			<td>Crouzet 178-4765&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Mold for brushes casting</td>
			<td>N.A.</td>
			<td>N.A.</td>
			<td style="width:255px;">The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and functional characterization of human ventricular cardiomyocytes from fresh surgical samples

병에 걸린 심장에서 심근 세포는 세포 구조의 변화, 여진 수축 결합 및 막 이온 전류를 포함하는 복잡한 리모델링 과정을 실시한다. 이러한 변화는 증가 부정맥 위험과 심장병 환자의 수축기 및 이완기 기능 장애로 이어지는 수축 변경에 대한 책임을 져야 할 가능성이있다. 그러나, 심장 질환에서 심근 기능의 변화에​​ 대한 대부분의 정보는 동물 모델에서왔다. 여기에 우리가 설명하고 심장 수술 작업을받은 환자에서 심실의 심근의 작은 수술 샘플에서 실행 가능한 심근 세포를 분리 할 수​​있는 프로토콜을 확인합니다. 프로토콜 상세하게 설명한다. 전기 생리학 및 세포 내 칼슘 측정이 방법으로 얻은 인간의 심실의 심근에서 단일 세포 측정의 숫자의 타당성을 입증하는 것으로보고있다. 이 프로토콜은 그에게보고다시 다른 심장 질환의 존재에서 인간의 마음의 기능 변경의 세포 및 분자 단위의 미래 연구에 유용 할 수 있습니다. 또한,이 방법은 세포 수준에서 새로운 치료 표적을 식별하고 직접 병진 값으로, 인간의 심장 근세포에서 신규 화합물의 효과를 시험하는데 사용될 수있다.

비 실패한 비 비후성 수술 환자 (21)와 비교하여 상술 한 방법은, 조작 절제술을 시행 비대성 심근증 (HCM)를 가진 환자의 심실 중격으로부터 격리 심근의 기능적 이상을 특성화하기 위해 사용 하였다. 이 섹션에 포함 된 결과를 해당 워크 (21)로부터 유도되며이 기술은 심장 질환 조건에서 심근 세포 기능의 변화를 특성화하는 데 사용될 수있는 방법의 예로서 여기에 도시되어있다. <...

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Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

심장 질환의 세포 기준으로 현재의 지식은 주로 동물 모델에 대한 연구에 의존한다. 여기에서 우리는 기술과 인간의 심실의 심근의 작은 수술 샘플에서 하나의 실행 가능한 심근을 얻기 위해 새로운 방법을 확인합니다. 인간 심실 근세포은 전기 생리학 연구와 약물 검사를 위해 사용될 수있다.

신선한 수술 샘플에서 분리 및 인간의 심실 심근 기능 특성

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

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17.1K 조회수.  University of Florence.  심장 질환의 세포 기준으로 현재의 지식은 주로 동물 모델에 대한 연구에 의존한다. 여기에서 우리는 기술과 인간의 심실의 심근의 작은 수술 샘플에서 하나의 실행 가능한 심근을 얻기 위해 새로운 방법을 확인합니다. 인간 심실 근세포은 전기 생리학 연구와 약물 검사를 위해 사용될 수있다. 

비디오: Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

환자 유래 세포 배양 및 CD133의 절연<sup&gt; +</sup흑종에서&gt; Putative 암 줄기 세포

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

연구

의학

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

인간의 전립선 암 샘플에서 암 줄기 세포의 분리

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

컬렉션, 격리, 인간 자궁 경부 샘플의 유세포 분석

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension and Assessment of Right Ventricular Function in the Piglet

An original piglet model of Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) associated with chronic Right Ventricular (RV) dysfunction is described. Pulmonary Hypertension (PH) was induced in 3-week-old piglets by a progressive obstruction of the pulmonary vascular bed. A ligation of the left Pulmonary Artery (PA) was performed first through a mini-thoracotomy. Second, weekly embolizations of the right lower pulmonary lobe were done under fluoroscopic guidance with n-butyl-2-cyanoacrylate during 5 weeks. Mean Pulmonary Arterial Pressure (mPAP) measured by ritght heart catheterism, increased progressively, as well as Right Atrial pressure and Pulmonary Vascular Resistances (PVR) after 5 weeks compared to sham animals. Right Ventricular (RV) structural and functional remodeling were assessed by transthoracic echocardiography (RV diameters, RV wall thickness, RV systolic function). RV elastance and RV-pulmonary coupling were assessed by Pressure-Volume Loops (PVL) analysis with conductance method. Histologic study of the lung and the right ventricle were also performed. Molecular analyses on RV fresh tissues could be performed through repeated transcutaneous endomyocardial biopsies. Pulmonary microvascular disease in obstructed and unobstructed territories was studied from lung biopsies using molecular analyses and pathology. Furthermore, the reliability and the reproducibility was associated with a range of PH severity in animals. Most aspects of the human CTEPH disease were reproduced in this model, which allows new perspectives for the understanding of the underlying mechanisms (mitochondria, inflammation) and new therapeutic approaches (targeted, cellular or gene therapies) of the overloaded right ventricle but also pulmonary microvascular disease.

Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) and Right Ventricular (RV) dysfunction were induced in piglets by progressive obstruction of the pulmonary arteries. Consequences were remarkably similar to those observed in CTEPH patients. This animal model would be a very useful tool for pathophysiology and therapeutic experiments on CTEPH and RV failure.

만성 혈전 색 전성 폐 고혈압과 돼지에서 마우스 오른쪽 심실 기능의 평가

An original piglet model of Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) associated with chronic Right Ventricular (RV) dysfunction is described. ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum (SR) serves as a Ca2+ reservoir for contraction, which reuptakes intracellular Ca2+ during relaxation. The SR Ca2+ reserve available for beats is determinate for cardiac contractibility, and the removal of intracellular Ca2+ is critical for cardiac diastolic function. Under some pathophysiological conditions, such as diabetes and heart failure, impaired calcium clearance and SR Ca2+ store in cardiomyocytes may be involved in the progress of cardiac dysfunction. Here, we describe a protocol to evaluate SRCa2+ reserve and diastolic Ca2+ removal. Briefly, a single cardiomyocyte was enzymatically isolated, and the intracellular Ca2+ fluorescence indicated by Fura-2 was recorded by a calcium imaging system. To employ caffeine for inducing total SR Ca2+ release, we preset an automatic perfusion switch program by interlinking the stimulation system and the perfusion system. Then, the mono-exponential curve fitting was used for analyzing decay time constants of calcium transients and caffeine-induced calcium pulses. Accordingly, the contribution of the SR Ca2+-ATPase (SERCA) and Na+-Ca2+ exchanger (NCX) to diastolic calcium removal was evaluated.

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Here, we describe a protocol to evaluate sarcoplasmic reticulum Ca2+ reserve and diastolic calcium removal function in cardiomyocytes by a calcium imaging system.

격리 된 심 실 Cardiomyocytes에 Sarcoplasmic 그물 칼슘 예비 및 세포내 확장기 칼슘 제거의 평가

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise investigation of the behavior of these cells under specific treatments and environments is possible. This manuscript presents a protocol for successful isolation and cultivation of adult rat ventricular cardiomyocytes (ARVC).
The rat is sacrificed by cervical dislocation under deep anesthesia. Then, the heart is extracted and the aorta is uncovered. Subsequently, perfusion on the Langendorff perfusion system with calcium depletion and collagenase treatment is performed. Afterwards, ventricular tissue gets minced, re-circulated, and filtered, followed by three centrifugation steps with gradual addition of CaCl2 until physiological calcium concentration is reached. ARVC are plated on cell culture dishes. After refreshing the cell culture medium, ARVC can be cultivated for up to six days without changing the serum-containing culture medium. Isolation of ARVC is a calcium sensitive process. Small changes in the intracellular calcium concentration cause a decrease in the quality and viability of the isolated cells.
Freshly isolated ARVC are rod shaped. Within the first days of cultivation they lose the rod-shaped morphology and form pseudopodia-like structures (spreading). During this morphological formation ARVC initially degrade their contractile elements followed by a reformation through actin stress fibers and de novo sarcomerogenesis. After one week of cultivation, most ARVC show a widespread appearance with a clearly detectable cross striation. This process is sensitive to intracellular calcium concentration, as treatment with ionomycin attenuates spreading. Key markers in this process of de- and re-differentiation are &#946;-myosin heavy chain (&#946;-MHC), oncostatin M (OSM), and swiprosin-1 (EFHD2). Recent studies have suggested that cardiac re- and de-differentiation occurring under culture conditions mimics features seen in vivo during cardiac remodeling. Therefore, isolation and cultivation of ARVC play a key role in understanding the biology of cardiomyocytes.

Here, we present a protocol for the isolation and cultivation of adult rat ventricular cardiomyocytes (ARVC). Isolated ARVC can be used for short and long-term cultivation. The isolation and cultivation of ARVC can play a key role in developing new treatment regimens for cardiac diseases.

절연 및 성인 쥐 Cardiomyocytes의 재배

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state against self-antigens as well as antigens derived from commensal organisms. The disruption of this immune homeostasis can lead to chronic inflammation and to the development of autoimmunity. Dendritic cells (DCs) are the professional antigen-presenting cells of the innate immune system involved in activating na&#239;ve T cells to initiate immune responses against foreign antigens. However, DCs can also be differentiated into TolDCs that act to maintain and promote T cell tolerance and to suppress effector cells contributing to the development of either autoimmune or chronic inflammation conditions. The recent advancement in our understanding of TolDCs suggests that DC tolerance can be achieved by modulating their differentiation conditions. This phenomenon has led to tremendous growth in developing TolDC therapies for numerous immune disorders caused due to break in immune tolerance. Successful studies in preclinical autoimmunity murine models have further validated the immunotherapeutic utility of TolDCs in the treatment of autoimmune disorders. Today, TolDCs have become a promising immunotherapeutic tool in the clinic for reinstating immune tolerance in various immune disorders by targeting pathogenic autoimmune responses while leaving protective immunity intact. Although an array of strategies has been proposed by multiple labs to induce TolDCs, there is no consistency in characterizing the cellular and functional phenotype of these cells. This protocol provides a step-by-step guide for the development of bone marrow-derived DCs in large numbers, a unique method used to differentiate them into TolDCs with a synthetic triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic acid-difluoro-propyl-amide (CDDO-DFPA), and the techniques used to confirm their phenotype, including analyses of essential molecular signatures of TolDCs. Finally, we show a method to assess TolDC function by testing their immunosuppressive response in vitro and in vivo in a preclinical model of multiple sclerosis.

Here, we present a protocol to develop and characterize tolerogenic dendritic cells (TolDCs) and evaluate their immunotherapeutic utility.

개발 및 Murine Tolerogenic 수지상 세포의 기능적 특성

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state ...

Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) provide a valuable human source for studying the basic science of calcium (Ca2+) handling and signaling pathways as well as high-throughput drug screening and toxicity assays. Herein, we provide a detailed description of the methodologies used to generate high-quality iPSC-CMs that can consistently reproduce molecular and functional characteristics across different cell lines. Additionally, a method is described to reliably assess their functional characterization through the evaluation of Ca2+ handling properties. Low oxygen (O2) conditions, lactate selection, and prolonged time in culture produce high-purity and high-quality ventricular-like cardiomyocytes. Similar to isolated adult rat cardiomyocytes (ARCMs), 3-month-old iPSC-CMs exhibit higher Ca2+ amplitude, faster rate of Ca2+ reuptake (decay-tau), and a positive lusitropic response to &#946;-adrenergic stimulation compared to day 30 iPSC-CMs. The strategy is technically simple, cost-effective, and reproducible. It provides a robust platform to model cardiac disease and for the large-scale drug screening to target Ca2+ handling proteins.

Here we describe and validate a method to consistently generate robust human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and characterize their function. These techniques may help in developing mechanistic insight into signaling pathways, provide a platform for large-scale drug screening, and reliably model cardiac diseases.

칼슘 취급 특성화를 위한 심실 유사 HiPSC 유래 심근세포 및 고품질 세포 제제 의 생성

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) provide a valuable human source for studying the basic science of calcium (Ca2+) ...

Functional Characterization of Endogenously Expressed Human RYR1 Variants

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia susceptibility, core myopathies and centronuclear myopathy. Because of the diverse phenotypes linked to RYR1 mutations it is fundamental to characterize their functional effects to classify variants carried by patients for future therapeutic interventions and identify non-pathogenic variants. Many laboratories have been interested in developing methods to functionally characterize RYR1 mutations expressed in patients&#39; cells. This approach has numerous advantages, including: mutations are endogenously expressed, RyR1 is not over-expressed, use of heterologous RyR1 expressing cells is avoided. However, since patients may present mutations in different genes aside RYR1, it is important to compare results from biological material from individuals harboring the same mutation, with different genetic backgrounds. The present manuscript describes methods developed to study the functional effects of endogenously expressed RYR1 variants in: (a) Epstein Barr virus immortalized human B-lymphocytes and (b) satellite cells derived from muscle biopsies and differentiated into myotubes. Changes in the intracellular calcium concentration triggered by the addition of a pharmacological RyR1 activators are then monitored. The selected cell type is loaded with a ratiometric fluorescent calcium indicator and intracellular [Ca2+] changes are monitored either at the single cell level by fluorescence microscopy or in cell populations using a spectrofluorometer. The resting [Ca2+], agonist dose response curves are then compared between cells from healthy controls and patients harboring RYR1 variants leading to insight into the functional effect of a given variant.

Here methods used to study the functional effect of RYR1 mutations endogenously expressed in Epstein Barr Virus immortalized human B-lymphocytes and muscle biopsy derived satellite cells differentiated into myotubes are described.

내인성 표현 인간의 RYR1 변종의 기능적 특성화

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia ...

Modifications of the Langendorff Method for Simultaneous Isolation of Atrial and Ventricular Myocytes from Adult Mice

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction and electrical activity. Hence, isolating viable, high-quality cardiomyocytes from the heart is the initial and most crucial experimental step. Comparing the various protocols for isolating the cardiomyocytes of adult mice, the Langendorff retrograde perfusion is the most successful and reproducible method reported in the literature, especially for isolating ventricular myocytes. However, isolating quality atrial myocytes from the perfused heart remains challenging, and few successful isolation reports are available. Solving this complicated problem is extremely important because apart from ventricular disease, atrial disease accounts for a large part of heart diseases. Therefore, further investigations on the cellular level to reveal the mechanisms are warranted. In this paper, a protocol based on the Langendorff retrograde perfusion method is introduced and some modifications in the depth of aorta cannulation and the steps that may affect the digestion process to isolate atrial and ventricular myocytes were simultaneously made. Moreover, the isolated cardiomyocytes are confirmed to be amenable to patch clamp investigation.

This protocol describes modifications of the Langendorff method including the depth of aorta cannulation for simultaneous Isolation of atrial and ventricular myocytes from adult mice.

성인 마우스에서 심방 및 심실 근세포의 동시 격리를위한 랑엔도르프 방법의 수정

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction ...