작가 나 딘 Woitasky와 피터 볼 크 기술 지원에 대 한 감사. 또한, 저자는 원고를 준비 하 고 그녀의 도움에 대 한 부인 클 라우 디 아 로렌스 (의료 작가, ACCEDIS)을 감사 합니다. 이 원고 DFG (Schlu 324/7-1)에 의해 재정적으로 지원 되었다.

조사 관리 및 사용의 실험실 동물은 미국 국립 보건원 (NIH 간행물 번호 85-23, 개정 1996)에 의해 출판에 대 한 가이드에 따라 실시 됩니다. 일반적으로, 남성 wistar 쥐 3 ~ 4 개월을 세 고 250-350 g의 평균 무게와 더불어이 프로토콜에 대 한 사용 됩니다. 한 쥐 마음은 20 문화 요리에 대 한 충분 한 (접시 당 1 mL; 내부 직경: 35mm) 10 4 셀/1000 m m 2 x 1.5의 대략적인 셀 밀도와.
 1. 미디어의 준비 및 시 약 <ol><li>Creatine-carnitine-황소자리 매체 (CCT 매체) 참고: CCT 매체는 매체 199 creatine, carnitine, 그리고 황소자리의 추가 따라 복잡 한 매체 이다.
	<ol>매체 199의 <li>준비 1 L: 3.6 g Hepes, 1 시간에 대 한 믹스에 추가. 다음 655.5 mg creatine (5mm), 395.4 mg carnitine (2mm), 625.5 mg 황소자리 (5 m m)를 추가 합니다. Carnitine와 황소자리에 pH를 변경 &#60; 7. 어떤 오염 셀, 예를 들면 내 피 세포 또는 섬유 아 세포의 성장을 억제 하기 위해 매체에 10 µ M 시 토 신 β-D-arabinofuranoside를 추가 합니다. 7.4 및 살 균 필터 매체를 NaOH (2 mM)와 pH를 조정 합니다. CCT 매체 저장 4 ° c.</li>
	</ol></li> <li>파월 매체 <ol><li>1 L 파월 매체에 대 한 해산 6.43 g NaCl (110mm) 0.19 g KCl (2.5 m m), 0.16 g KH 2 포 4 (1.2 m m), 0.3 g MgSO 4 7 H 2 O (1.2 m m), 5.96 g Hepes (25 m m), 그리고 1.98 g (+ D )-아쿠아 살 균에서 포도 당 monohydrate (10 mM). 7.4 및 살 균 필터 매체를 NaOH (2 M)와 pH를 조정 합니다. 스토어 파월 매체 4 ° c.</li>
	</ol></li> <li>칼슘 염화 물 (CaCl 2) <ol><li>100mm CaCl 2 솔루션 (50 mL)을 준비 하 고 포함 된 500 µ L CaCl 2 aliquots를 준비. Aliquots-20에서 동결 ° c.</li>
	</ol></li> <li>문화 매체의 준비 <ol><li>준비 3 셀 문화 매체: 매체, 도금 매체, 및 세척 매체 중 도금. CCT 매체를 사용 하 여 모든 3 개의 매체 (표 1)에 대 한 기준으로. CCT 매체 문화 접시 당 1 mL로 계산 합니다. 따라서, 20 문화 요리 20 mL CCT 매체를 준비 (내부 직경: 35mm).</li>
		<li>셀 문화 접시: 각 셀 문화 플레이트 코트 (내부 직경: 35mm) 사전 도금 매체 1 mL와 함께. 사용 하기 전에 적어도 2 시간 또는 하룻밤 37 ° C에서 코팅된 판 저장.</li>
	</ol></li></ol> 2. 성인 Cardiomyocytes의 절연 <ol><li>Langendorff 준비 관류 시스템 <ol><li>열 도금 매체 및 세척 매체 37 ° C. Defreeze 500 µ L CaCl 2의 튜브와 콜라의 25 mg에 무게.</li>
		<li>플러시 Langendorff 관류 시스템과 아쿠아 살 균, 이후에 파월 중간 5 분에 대 한 시스템을 순환 하 게</li>
		<li>Langendorff 관류 시스템을 80 mL 파월 매체 채울 없이 어떤 공기 거품 및 가스 95% 산소 매체.</li>
		<li>40 mL 파월 매체와 튜브 (50 mL)를 준비 하 고, 37 ° C에가 열 하 고 95% 산소 가스.</li>
		<li>길이 약 25 ㎝의 스레드는 정 맥을 제거 마음을 연결에 대 한 준비.</li>
		<li>Degrease 면도날 알코올 (볼륨 70%) 하 고 헬기에 그것을 건다. 헬기에 플라스틱 디스크 클램프.</li>
	</ol></li> <li>심장의 추출 <ol><li>4% ~ 5 %isoflurane 남성 wistar 쥐를 Anesthetize 하 고 자 궁 경부 전위와 희생. 늑 골 아치 뒤에 복 부는 복 부 전단으로 열고, 흉 강 여 다이어 프 램을 통해 잘라가 위의 동일한 쌍.</li>
		<li>흉 강에 매우 두개골 thymus 위에서 절단 하 여 폐와 흉 선, 심 혼을 제거합니다. 얼음 처럼 차가운 소금물에 자료를 즉시 전송.</li>
		<li>해 시저 (대형)와 심장에서 폐와 흉 선 제거 및 캡슐 집게와 자료를 편집증으로 전송 후자 새로운 염.</li>
	</ol></li> <li>격리 <ol><li>캡슐 집게 해 시저 (크거나 작은)을 사용 하 여 심장에서 thymus, 기관, 지방, 결합 조직의 잔류물 처럼 과잉 조직을 제거. 대동맥을 폭로 하 고 첫 번째 및 두 번째 아가미 arch. 사이 해 시저 (크거나 작은)와 그것을 끊다</li>
		<li>는 Langendorff 관류 시스템의 떨어지는 시작. Langendorff 관류 시스템의 정에 마음을 놓고 먼저 준비 스레드 나중 악어 클램프와 그것을 흥분 시키는. 그것은 혈액의 무료 때까지 마음을 린스.</li>
		<li>25mg 콜라 5-6 mL 따뜻한 파월 매체에 녹이 고 12.5 µ L CaCl 2 (30 µ M).</li>
		<li>는 떨어지는 마음 위에 Langendorff 관류 시스템과 연결 되어 유리 깔때기를 이동 하 여 순환 닫고 관류 시스템 해결된 콜라를 추가 합니다. 초당 1 방울의 드롭 속도 25 분 동안 관류 시작. 
		참고: 관류, 하는 동안 심장 팽창 되며 밀랍 모양의 얻을.</li>
		<li>25 분 후 관류를 중지 하 고 마음 Langendorff 관류 시스템에서 제거. 심장에서 대동맥, 심 방, 및 결합 조직 제거 하 고 오른쪽과 왼쪽 심 열.</li>
		<li>잘라 두 번 90 °의 각도에서 심장 (절단 폭: 0.7 m m, 속도: 0.15 cm/s). 10 두 scalpels와 수동으로이 과정을 반복 s 각 면.</li>
		<li>새 튜브 (50 mL)에 관류 매체의 12 mL를 전송합니다. 37 또 다른 5 분 동안이 매체 및 다이제스트 셀에 셀 슬러리를 붓고 ° C. 믹스 솔루션 매분마다.</li>
		<li>새 튜브 (50 mL)에 나일론 메쉬 (200 µ m)를 통해 소화 마음으로 솔루션 필터.</li>
		<li>원심 29 x g 3 분 삭제에 필터링된 솔루션은 상쾌한 고 12.5 µ L CaCl 2 (250 µ M) 셀 펠 릿을 포함 하 여 6 mL 따뜻한 파월 매체를 추가 합니다. 부드러운 진동 운동을 통해 펠 릿 resuspend 다시 2 분 삭제는 상쾌한 29 x g에서 원심을 6 mL 따뜻한 파월 매체 대체 25 µ L CaCl 2 (500 µ M)를 추가 합니다. 부드러운 진동 운동을 통해 셀 펠 릿을 녹이 고 12 mL 따뜻한 파월 중간 포함 120 µ L CaCl 2 (1 mM) 추가. 1 분 16 x g에서 3 시간 동안 원심 분리기. 다시는 상쾌한 제거.</li>
		<li>미리 따뜻하게 도금 매체와 셀 펠 릿 혼합.</li>
		<li>배양 배지에서 사전 도금 매체를 제거합니다. 전송 매체, 절연된 cardiomyocytes 각 문화 접시를 포함 하 여 도금 1 mL. 1 헤 37 ° C에서 신선한 절연된 cardiomyocytes 품 어</li>
		<li>배양 배지에서 도금 매체를 제거합니다. 각 문화 접시를 세척 1 mL를 추가 하 고 매체를 변경 하지 않고 6 일 37 ° C에서 접시를 저장.</li>
		<li>다른 화학 물질과 ARVC에 치료의 영향 조사, 먼저 매체를 세척 하 고 그 후 다른 화학 물질을 추가 하 여 도금 매체를 새로. 
		참고: 가벼운 현미경 검사 법 평가: 각 셀 준비, 150 ~ 300 cardiomyocytes 모니터링 해야 하루 가벼운 현미경 검사 법에 의해. 모든 계산된 cardiomyocytes 그들의 모양에 따라 그룹으로 세분화 (예를 들어, &#34; 막대 모양 &#34;, &#34; 다운 라운드 &#34;, &#34; 확산 &#34;, 및 &#34; 특이 한 모양을 &#34;). 카테고리 &#34; 확산 &#34; pseudopodia와 같은 구조를 가진 모든 cardiomyocytes 포함. &#34; 특별 한 모양을 &#34;는 불규칙 한 표면 가진 모든 ARVC 및 없음 감지 그대로 세포 막.</li>
	</ol></li></ol> 3. 예를 들어 실험 <ol><li><ol><li>분석 형태학 및 구조 변환 ARVC의 공초점 레이저 현미경 검사 법에 의해 재배 중 형광/면역 형광 성인 cardiomyocytes의 얼룩. Phalloidin-TRITC를 사용 하 여 F-말라 구조 조사 &#34; 막대 모양 &#34;, &#34; 다운 라운드 &#34;, 및 &#34; 확산 &#34; ARVC. 제조 업체에 따라 얼룩 수행 &#39; s 프로토콜. Phalloidin-TRITC 얼룩에 대 한 예로 참조 Nippert 외에 주어진 11. 면역 형광 형광/얼룩과 차이에 드-하 고 다시-differentiation 재배 성인 cardiomyocytes 실험적 치료 (예를 들어,와 사이에서 수축 성 기구의 Swiprosin-1, ionomycin) 조사 수.</li>
	</ol></li> <li>실시간 양적 RT-PCR (qRT-PCR) <ol><li>다른 유전자의 mRNA 표현에서 변화를 조사 하기 위해 qRT-PCR을 수행 (예를 들어, OSM, Swiprosin-1, β-MHC) ARVC의 재배 중. 충분 한 샘플 크기에 대 한 더 큰 문화 요리 사용 (내부 직경: 60 m m) 2 mL 볼륨. 5 문화 요리 ARVC 한 샘플을 생성합니다. MRNA의 절연 및 변환 제조 업체에 따르면 cDNA의 수행 &#39; s 프로토콜.</li>
	</ol></li> <li>Immunoblot 기법 <ol><li>수행 서 몰아내고 단백질 식 (예를 들어, Swiprosin-1) ARVC의 경작 동안에 변화를 조사. 샘플 당 하나의 문화 접시 (1 mL)을 사용 하 여.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Schl&#252;ter, K. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cardiomyocytes - Active Players in Cardiac Disease. , (2016).</li><li>Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+calcium+stable+adult+cardiac+myocytes.">Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).</li><li>Schl&#252;ter, K. -. 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표시 된 결과 프란체스카 Nippert의 박사 논문의 일부입니다.

성인 cardiomyocytes에 vivo에서 의 행동은 다른 셀 (예:신경 세포, 내 피 세포, 섬유 아 세포, 염증 세포)와 그들이 형성 하는 전기 syncytium 많은 상호 작용에 의해 영향을1. 따라서, 성인 cardiomyocytes의 스트레스 적응을 독점적으로 공부 해야 분리와 ARVC의 재배 합니다. 분리 하 고 ARVC를 재배의 주요 효과: 1) 기질과 셀 연락처;에서 그들을 분리 2) 수축 자극;에서 그들을 분리 3...

Vivo에서 성인 cardiomyocytes는 전기 syncytium myocytes 사이 셀 연락처를 기반으로 작동 합니다. 또한, 그들은 심장 섬유 아 세포, 내 피 세포, 신경 세포, 염증 세포1같은 인접 한 세포에 의해 영향을 받습니다. 초기 단계를 선도 하 고 심장 마비, 분리와 성인 심 실 쥐의 심장 비 대, 동안 본 부하 조건 변경 cardiomyocytes의 능력을 그들의 세포내 조직 적응을 공부 하기 위하여 cardiomyocytes (ARVC)는 필요한2,,34. 역사적으로, cardiomyocytes가 했다 미 발달 병아리 마음5,6에서 격리 된 처음. 몇 년 후, 말기 차별화 cardiomyocytes의 첫 번째 절연 칼슘 고갈7을 사용 하 여 설명 했다. 그러나, 이러한 성인 cardiomyocytes 칼슘 허용 되었고 따라서 하지 사용 될 수 있는 기능 분석 실험. 마지막으로, 1976 년에 새로운 프로토콜 활성화 파월과 트위스트 생리 조건8에서 성인 심 실 cardiomyocytes 조사. 첫 번째 단계로 서, 그들은 낮은 칼슘 농도 및 생리 적인 농도 단계적 절차에서 그 후 증가 칼슘 성인 cardiomyocytes 고립. 오늘, 분리와 성인 cardiomyocytes의 재배에 대 한 대부분의 프로토콜이 칼슘 프로토콜을 사용 하 고 조밀한 셀 연락처1의 효소 소화에 콜라를 사용 합니다.
성공적인 재배 송아지 태아 혈 청 (FCS) 또는 oncostatin M (OSM)가 필요 합니다. ARVC 수행는 데-그리고 다시-differentiation sarcomere 해체와 개혁9,10,,1112를 포함 하 여 광범위 한 구조 변경 합니다. Β-myosin 무거운 체인 (β-MHC) 처럼 태아 형 유전자의 재 식이이 과정 동반 비, 및 pseudopodia 같은 구조, 퍼지는4,11, 이라고의 형성에서 알려진 13. swiprosin-1 (EFHD2), 새로 확인된 된 단백질 재배 ARVC11의 재 분화는 주요 역할을 수행 하는 또한. 그 결과, ARVC 문화에 광범위 하 게, 다형성 셀 문화2,4,14에서 2 ~ 3 주 후 저절로 수축을 표시 하는 변환.
최근의 발견을 심장 다시 de differentiation 모방 문화 조건 하에서 발생 하는 대로 본 기능 vivo에서 심장 개장10,15동안 밝혀졌다. 개장 하는 심장 심장 질환16동안 핵심 과정 이다. 심장 질환은 여전히 산업화 사회에서 죽음의 주요 원인, 성인 cardiomyocytes의 생물학의 더 나은 이해 중요 하다 (누가, 2015). 절연 및 ARVC의 새로운 전략 및 심장 질환의 치료에 대 한 의약품 개발을 도울 수 있다. 이 원고와 분리와 ARVC의 재배에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 또한,이 방법의 몇 가지 중요 한 부분 토론 섹션에서 강조 표시 됩니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Langendorff perfusion system</td>
			<td>inhouse construction</td>
			<td></td>
			<td>double-walled with a water 
			based heating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue chopper Mc Ilwain</td>
			<td>Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aortic Cannula, OD 1,8 mm</td>
			<td>inhouse construction</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abdominal shears</td>
			<td>Aeskulap</td>
			<td>BC772R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsule forceps</td>
			<td>Eickemeyer</td>
			<td>171307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissor large</td>
			<td>Aeskulap</td>
			<td>BC562R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissor small</td>
			<td>Aeskulap</td>
			<td>BC163R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mash with Polyamid</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>4-1413</td>
			<td>mash size 200 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic disc</td>
			<td>Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Typ II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and cultivation of adult rat cardiomyocytes

그대로 마음에 인접 한 셀 성인 cardiomyocytes 영향. 격리의 방법 및 성인 cardiomyocytes의 경작, 및 특정 환경에서 이러한 셀의 동작의 정확한 조사 가능 하다. 이 원고는 성공적인 격리와 성인 쥐 심 실 cardiomyocytes (ARVC)의 재배에 대 한 프로토콜을 제공합니다.
쥐 자 궁 경부 전위 깊은 마 취에 의해 희생 이다. 그런 다음 심장 추출 되 고 대동맥 적용 되지 않습니다. 그 후, 관류 칼슘 소모와 콜라 치료 Langendorff 관류 시스템에서 수행 됩니다. 나중에, 심 실 조직 되 면 다진, 다시 유통, 필터링, 생리 적인 칼슘 농도 도달할 때까지 점진적 추가 CaCl2 3 원심 분리 단계 뒤. ARVC 셀 문화 요리에 도금 된다. 세포 배양 후, ARVC 수 재배 최대 6 일 동안 혈 청에 포함 된 문화 매체를 변경 하지 않고. ARVC의 격리 칼슘 민감한 과정 이다입니다. 세포내 칼슘 농도 있는 작은 변화 일으킬 품질 및 고립 된 세포의 생존 능력에 있는 감소.
갓 절연 ARVC 막대 모양입니다. 재배의 첫 번째 일 이내 그들은 손실 막대 모양의 형태와 양식 pseudopodia 같은 구조 (확산). 이 형태 형성 동안 ARVC는 처음 이어서 걸 스트레스 섬유와 드 노 보 sarcomerogenesis 통해 개혁 그들의 수축 성 요소 저하. 재배의 1 주일 후 대부분 ARVC 명확 하 게 감지 크로스 줄무늬와 광범위 한 모습을 보여줍니다. 이 과정은 ionomycin와 치료 약하게 확산으로 세포내 칼슘 농도에 민감 하다. 이 과정을의 드-하 고 다시-differentiation 키 표식은 β myosin 무 겁 사슬 (β-MHC), oncostatin M (OSM), 및 swiprosin-1 (EFHD2) 있습니다. 최근 연구는 심장 개장 동안 기능 본 vivo에서 모방 심장 다시 de differentiation 발생 문화 조건 하에서 제안 했다. 따라서, 절연 및 ARVC의 재배 cardiomyocytes의 생물학 이해에 중요 한 역할을 재생 합니다.

문화에서 성인 cardiomyocytes: 그림 1 마지막 세척 후 갓 절연된 성인 cardiomyocytes 2 h에 대 한 개요를 보여 줍니다. 모든 cardiomyocytes의 약 75%는 막대 모양의 형태를 했다. 나머지 25%는 둥근 형태와 전혀 감지 그대로 세포 막 (그림 1) 특이 한 모습을 보여주었다. 최대 재배 (6 일)의 끝에 pseudopodia 같은 구조 없이 둥근 형태에 ...

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Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

여기, 우리는 분리와 성인 쥐 심 실 cardiomyocytes (ARVC)의 재배에 대 한 프로토콜을 제시. 단기 및 장기 재배에 대 한 고립 된 ARVC는 사용할 수 있습니다. 분리와 ARVC의 재배는 심장 질환에 대 한 새로운 치료 regimens 개발에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다.

절연 및 성인 쥐 Cardiomyocytes의 재배

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

15.4K 조회수.  Justus Liebig University Giessen. 여기, 우리는 분리와 성인 쥐 심 실 cardiomyocytes (ARVC)의 재배에 대 한 프로토콜을 제시. 단기 및 장기 재배에 대 한 고립 된 ARVC는 사용할 수 있습니다. 분리와 ARVC의 재배는 심장 질환에 대 한 새로운 치료 regimens 개발에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다.

비디오: Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

신선한 수술 샘플에서 분리 및 인간의 심실 심근 기능 특성

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

연구

의학

Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of metabolic syndrome (MetS)-related heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF). The prevalence of MetS-related HFpEF is rising, and atrial cardiomyopathies associated with atrial remodeling and atrial fibrillation are clinically highly relevant as atrial remodeling is an independent predictor of mortality. Studies with isolated single-cell cardiomyocytes are frequently used to corroborate and complement in vivo findings. Circulatory vessel rarefication and interstitial tissue fibrosis pose a potentially limiting factor for the successful single-cell isolation of ACMs from animal models of this disease.
We have addressed this issue by employing a device capable of manually regulating the intraluminal pressure of cardiac cavities during the isolation procedure, substantially increasing the yield of morphologically and functionally intact ACMs. The acquired cells can be used in a variety of different experiments, such as cell culture and functional Calcium imaging (i.e., excitation-contraction-coupling).
We provide the researcher with a step-by-step protocol, a list of optimized solutions, thorough instructions to prepare the necessary equipment, and a comprehensive troubleshooting guide. While the initial implementation of the procedure might be rather difficult, a successful adaptation will allow the reader to perform state-of-the-art ACM isolations in a rat model of MetS-related HFpEF for a broad spectrum of experiments.

Here, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes from a rat model of metabolic syndrome-related heart failure with preserved ejection fraction. A manual regulation of intraluminal pressure of cardiac cavities is implemented to yield functionally intact myocytes suitable for excitation-contraction-coupling studies.

심 방 Cardiomyocytes 보존된 방출 분수와 함께 대사 증후군 관련 심장 마비의 쥐 모델에서의 격리

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of ...

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by proteinuria which can eventually lead to chronic and end-stage renal disease. The glomerulus is a complex apparatus responsible for the filtration of plasma from the body. In disease, structural integrity is lost and allows for the abnormal leakage of plasma contents into the urine. A method to isolate and examine glomeruli in culture is critical for the study of these diseases. In this protocol, an efficient method of retrieving intact glomeruli from adult rat kidneys while conserving structural and morphological characteristics is described. This process is capable of generating high yields of glomeruli per kidney with minimal contamination from other nephron segments. With these glomeruli, injury conditions can be mimicked by incubating them with a variety of chemical toxins, including protamine sulfate, which causes foot process effacement and proteinuria in animal models. Degree of injury can be assessed using transmission electron microscopy, immunofluorescence staining, and western blotting. Nephrin and Wilms Tumor 1 (WT1) levels can also be assessed from these cultures. Due to the ease and flexibility of this protocol, the isolated glomeruli can be utilized as described or in a way that best suits the needs of the researcher to help better study glomerular health and structure in diseased states.

The main focus of this protocol is to efficiently isolate viable primary glomeruli cultures with minimal contaminants for use in a variety of downstream applications. The isolated glomeruli retain structural relationships between component cell types and can be cultured ex vivo for a short time.

그대로 Glomeruli 성인 쥐 신장에서 분리 하는 효율적인 체질 하 방법

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents responsible for the action potential can cause pro-arrhythmic substrates that underlie arrhythmias, such as atrial fibrillation, which are highly prevalent in many conditions and disease states. Isolating adult mouse atrial cardiomyocytes for use in patch-clamp experiments has greatly advanced our knowledge and understanding of the cellular electrophysiology in the healthy atrial myocardium and in the setting of atrial pathophysiology. In addition, studies using genetic mouse models have elucidated the role of a vast array of proteins in regulating atrial electrophysiology. Here we provide a detailed protocol for the isolation of cardiomyocytes from the atrial appendages of adult mice using a combination of enzymatic digestion and mechanical dissociation of these tissues. This approach consistently and reliably yields isolated atrial cardiomyocytes that can then be used to characterize cellular electrophysiology by measuring action potentials and ionic currents in patch-clamp experiments under a number of experimental conditions.

This protocol is used to isolate single atrial cardiomyocytes from the adult mouse heart using a chunk digestion approach. This approach is used to isolate right or left atrial myocytes that can be used to characterize atrial myocyte electrophysiology in patch-clamp studies.

성인 마우스에서 심방 근세포의 격리

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

왼쪽 전방 내림차순 관상 동맥의 영구 결찰을 사용하는 뮤린 심근 경색 모델

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary fibroblasts cannot divide indefinitely due to myofibroblast differentiation or senescence induction, new cultures must be established regularly. However, there are several obstacles to overcome during the processes of developing a reliable isolation protocol and primary fibroblast isolation itself: the method&#8217;s degree of difficulty (especially for beginners), the risk of bacterial contamination, the required time until primary fibroblasts can be used for experiments, and subsequent cell quality and viability. In this study, a fast, reliable and easy-to-learn protocol to isolate and culture primary adult fibroblasts from mouse heart, lung, liver and kidney combining enzymatic digestion and ultrasonic agitation is provided.

We present a protocol to isolate primary adult fibroblasts in an easy, fast and reliable way, performable by beginners (e.g., students). The procedure combines enzymatic tissue digestion and mechanical agitation with ultrasonic waves to obtain primary fibroblasts. The protocol can easily be adapted to specific experimental requirements (e.g., human tissue).

초음파 증강 원발성 섬유아세포 분리

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring apparatus and a motor to perform functional studies. These studies will allow measurement of cardiomyocyte stiffness (passive force) and its activation with different calcium (Ca2+)-containing solutions to determine, amongst others: maximum force development, myofilament Ca2+-sensitivity (pCa50), cooperativity (nHill) and the rate of force redevelopment (ktr). This method also enables determination of the effects of drugs acting directly on myofilaments and of the expression of exogenous recombinant proteins on both active and passive properties of cardiomyocytes. Clinically, skinned cardiomyocyte studies highlight the pathophysiology of many myocardial diseases and allow in vitro assessment of the impact of therapeutic interventions targeting the myofilaments. Altogether, this technique enables the clarification of cardiac pathophysiology by investigating correlations between in vitro and in vivo parameters in animal models and human tissue obtained during open heart or transplant surgery.

This protocol aims to describe step-by-step the technique of extraction and assessment of cardiac function using skinned cardiomyocytes. This methodology allows measurement and acutemodulation of myofilament function using small frozen biopsies that can be collected from different cardiac locations, from mice to men.

피부 심근세포를 이용한 심장 기능의 체외 평가

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats

Here we present an efficient method for isolating and culturing mandibular bone marrow mesenchymal stem cells (mBMSCs) in vitro to rapidly obtain numerous high-quality cells for experimental requirements. mBMSCs could be widely used in therapeutic applications as tissue engineering cells in case of craniofacial diseases and cranio-maxillofacial regeneration in the future due to the excellent self-renewal ability and multi-lineage differentiation potential. Therefore, it is important to obtain mBMSCs in large numbers.
In this study, bone marrow was flushed from the mandible and primary mBMSCs were isolated through whole bone marrow adherent cultivation. Furthermore, CD29+CD90+CD45&#8722; mBMSCs were purified through fluorescent cell sorting. The second generation of purified mBMSCs were used for further study and displayed potential in differentiating into osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Utilizing this in vitro model, one can obtain a high number of proliferative mBMSCs, which may facilitate the study of the biological characteristics, the subsequent reaction to the microenvironment, and other applications of mBMSCs.

This article presents a method that combines whole bone marrow adherence and flow cytometry sorting for isolating, cultivating, sorting, and identifying bone marrow mesenchymal stem cells from rat mandibles.

쥐에 있는 간골 골수 관진 줄기 세포의 격리 그리고 경작

Here we present an efficient method for isolating and culturing mandibular bone marrow mesenchymal stem cells (mBMSCs) in vitro to rapidly obtain numerous ...

Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells provide promising sources for cardiac disease modeling. For cardiomyopathies, sarcomere shortening is one of the standard physiological assessments that are used with adult cardiomyocytes to examine their disease phenotypes. However, the available methods are not appropriate to assess the contractility of PSC-CMs, as these cells have underdeveloped sarcomeres that are invisible under phase-contrast microscopy. To address this issue and to perform sarcomere shortening with PSC-CMs, fluorescent-tagged sarcomere proteins and fluorescent live-imaging were used. Thin Z-lines and an M-line reside at both ends and the center of a sarcomere, respectively. Z-line proteins &#8212;&#160;&#945;-Actinin (ACTN2), Telethonin (TCAP), and actin-associated LIM protein (PDLIM3) &#8212; and one M-line protein &#8212; Myomesin-2 (Myom2) &#8212;&#160;were tagged with fluorescent proteins. These tagged proteins can be expressed from endogenous alleles as knock-ins or from adeno-associated viruses (AAVs). Here, we introduce the methods to differentiate mouse and human pluripotent stem cells to cardiomyocytes, to produce AAVs, and to perform and analyze live-imaging. We also describe the methods for producing polydimethylsiloxane (PDMS) stamps for a patterned culture of PSC-CMs, which facilitates the analysis of sarcomere shortening with fluorescent-tagged proteins. To assess sarcomere shortening, time-lapse images of the beating cells were recorded at a high framerate (50-100 frames per second) under electrical stimulation (0.5-1 Hz). To analyze sarcomere length over the course of cell contraction, the recorded time-lapse images were subjected to SarcOptiM, a plug-in for ImageJ/Fiji. Our strategy provides a simple platform for investigating cardiac disease phenotypes in PSC-CMs.

This method can be used to examine sarcomere shortening using pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes with fluorescent-tagged sarcomere proteins.

형광 태그 사코레 단백질을 사용하여 다능줄기 세포 유래 심근 세포의 Sarcomere 단축.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...

Modifications of the Langendorff Method for Simultaneous Isolation of Atrial and Ventricular Myocytes from Adult Mice

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction and electrical activity. Hence, isolating viable, high-quality cardiomyocytes from the heart is the initial and most crucial experimental step. Comparing the various protocols for isolating the cardiomyocytes of adult mice, the Langendorff retrograde perfusion is the most successful and reproducible method reported in the literature, especially for isolating ventricular myocytes. However, isolating quality atrial myocytes from the perfused heart remains challenging, and few successful isolation reports are available. Solving this complicated problem is extremely important because apart from ventricular disease, atrial disease accounts for a large part of heart diseases. Therefore, further investigations on the cellular level to reveal the mechanisms are warranted. In this paper, a protocol based on the Langendorff retrograde perfusion method is introduced and some modifications in the depth of aorta cannulation and the steps that may affect the digestion process to isolate atrial and ventricular myocytes were simultaneously made. Moreover, the isolated cardiomyocytes are confirmed to be amenable to patch clamp investigation.

This protocol describes modifications of the Langendorff method including the depth of aorta cannulation for simultaneous Isolation of atrial and ventricular myocytes from adult mice.

성인 마우스에서 심방 및 심실 근세포의 동시 격리를위한 랑엔도르프 방법의 수정

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction ...