작가 나 딘 Woitasky와 피터 볼 크 기술 지원에 대 한 감사. 또한, 저자는 원고를 준비 하 고 그녀의 도움에 대 한 부인 클 라우 디 아 로렌스 (의료 작가, ACCEDIS)을 감사 합니다. 이 원고 DFG (Schlu 324/7-1)에 의해 재정적으로 지원 되었다.

조사 관리 및 사용의 실험실 동물은 미국 국립 보건원 (NIH 간행물 번호 85-23, 개정 1996)에 의해 출판에 대 한 가이드에 따라 실시 됩니다. 일반적으로, 남성 wistar 쥐 3 ~ 4 개월을 세 고 250-350 g의 평균 무게와 더불어이 프로토콜에 대 한 사용 됩니다. 한 쥐 마음은 20 문화 요리에 대 한 충분 한 (접시 당 1 mL; 내부 직경: 35mm) 10 4 셀/1000 m m 2 x 1.5의 대략적인 셀 밀도와.
 1. 미디어의 준비 및 시 약 <ol><li>Creatine-carnitine-황소자리 매체 (CCT 매체) 참고: CCT 매체는 매체 199 creatine, carnitine, 그리고 황소자리의 추가 따라 복잡 한 매체 이다.
	<ol>매체 199의 <li>준비 1 L: 3.6 g Hepes, 1 시간에 대 한 믹스에 추가. 다음 655.5 mg creatine (5mm), 395.4 mg carnitine (2mm), 625.5 mg 황소자리 (5 m m)를 추가 합니다. Carnitine와 황소자리에 pH를 변경 &#60; 7. 어떤 오염 셀, 예를 들면 내 피 세포 또는 섬유 아 세포의 성장을 억제 하기 위해 매체에 10 µ M 시 토 신 β-D-arabinofuranoside를 추가 합니다. 7.4 및 살 균 필터 매체를 NaOH (2 mM)와 pH를 조정 합니다. CCT 매체 저장 4 ° c.</li>
	</ol></li> <li>파월 매체 <ol><li>1 L 파월 매체에 대 한 해산 6.43 g NaCl (110mm) 0.19 g KCl (2.5 m m), 0.16 g KH 2 포 4 (1.2 m m), 0.3 g MgSO 4 7 H 2 O (1.2 m m), 5.96 g Hepes (25 m m), 그리고 1.98 g (+ D )-아쿠아 살 균에서 포도 당 monohydrate (10 mM). 7.4 및 살 균 필터 매체를 NaOH (2 M)와 pH를 조정 합니다. 스토어 파월 매체 4 ° c.</li>
	</ol></li> <li>칼슘 염화 물 (CaCl 2) <ol><li>100mm CaCl 2 솔루션 (50 mL)을 준비 하 고 포함 된 500 µ L CaCl 2 aliquots를 준비. Aliquots-20에서 동결 ° c.</li>
	</ol></li> <li>문화 매체의 준비 <ol><li>준비 3 셀 문화 매체: 매체, 도금 매체, 및 세척 매체 중 도금. CCT 매체를 사용 하 여 모든 3 개의 매체 (표 1)에 대 한 기준으로. CCT 매체 문화 접시 당 1 mL로 계산 합니다. 따라서, 20 문화 요리 20 mL CCT 매체를 준비 (내부 직경: 35mm).</li>
		<li>셀 문화 접시: 각 셀 문화 플레이트 코트 (내부 직경: 35mm) 사전 도금 매체 1 mL와 함께. 사용 하기 전에 적어도 2 시간 또는 하룻밤 37 ° C에서 코팅된 판 저장.</li>
	</ol></li></ol> 2. 성인 Cardiomyocytes의 절연 <ol><li>Langendorff 준비 관류 시스템 <ol><li>열 도금 매체 및 세척 매체 37 ° C. Defreeze 500 µ L CaCl 2의 튜브와 콜라의 25 mg에 무게.</li>
		<li>플러시 Langendorff 관류 시스템과 아쿠아 살 균, 이후에 파월 중간 5 분에 대 한 시스템을 순환 하 게</li>
		<li>Langendorff 관류 시스템을 80 mL 파월 매체 채울 없이 어떤 공기 거품 및 가스 95% 산소 매체.</li>
		<li>40 mL 파월 매체와 튜브 (50 mL)를 준비 하 고, 37 ° C에가 열 하 고 95% 산소 가스.</li>
		<li>길이 약 25 ㎝의 스레드는 정 맥을 제거 마음을 연결에 대 한 준비.</li>
		<li>Degrease 면도날 알코올 (볼륨 70%) 하 고 헬기에 그것을 건다. 헬기에 플라스틱 디스크 클램프.</li>
	</ol></li> <li>심장의 추출 <ol><li>4% ~ 5 %isoflurane 남성 wistar 쥐를 Anesthetize 하 고 자 궁 경부 전위와 희생. 늑 골 아치 뒤에 복 부는 복 부 전단으로 열고, 흉 강 여 다이어 프 램을 통해 잘라가 위의 동일한 쌍.</li>
		<li>흉 강에 매우 두개골 thymus 위에서 절단 하 여 폐와 흉 선, 심 혼을 제거합니다. 얼음 처럼 차가운 소금물에 자료를 즉시 전송.</li>
		<li>해 시저 (대형)와 심장에서 폐와 흉 선 제거 및 캡슐 집게와 자료를 편집증으로 전송 후자 새로운 염.</li>
	</ol></li> <li>격리 <ol><li>캡슐 집게 해 시저 (크거나 작은)을 사용 하 여 심장에서 thymus, 기관, 지방, 결합 조직의 잔류물 처럼 과잉 조직을 제거. 대동맥을 폭로 하 고 첫 번째 및 두 번째 아가미 arch. 사이 해 시저 (크거나 작은)와 그것을 끊다</li>
		<li>는 Langendorff 관류 시스템의 떨어지는 시작. Langendorff 관류 시스템의 정에 마음을 놓고 먼저 준비 스레드 나중 악어 클램프와 그것을 흥분 시키는. 그것은 혈액의 무료 때까지 마음을 린스.</li>
		<li>25mg 콜라 5-6 mL 따뜻한 파월 매체에 녹이 고 12.5 µ L CaCl 2 (30 µ M).</li>
		<li>는 떨어지는 마음 위에 Langendorff 관류 시스템과 연결 되어 유리 깔때기를 이동 하 여 순환 닫고 관류 시스템 해결된 콜라를 추가 합니다. 초당 1 방울의 드롭 속도 25 분 동안 관류 시작. 
		참고: 관류, 하는 동안 심장 팽창 되며 밀랍 모양의 얻을.</li>
		<li>25 분 후 관류를 중지 하 고 마음 Langendorff 관류 시스템에서 제거. 심장에서 대동맥, 심 방, 및 결합 조직 제거 하 고 오른쪽과 왼쪽 심 열.</li>
		<li>잘라 두 번 90 °의 각도에서 심장 (절단 폭: 0.7 m m, 속도: 0.15 cm/s). 10 두 scalpels와 수동으로이 과정을 반복 s 각 면.</li>
		<li>새 튜브 (50 mL)에 관류 매체의 12 mL를 전송합니다. 37 또 다른 5 분 동안이 매체 및 다이제스트 셀에 셀 슬러리를 붓고 ° C. 믹스 솔루션 매분마다.</li>
		<li>새 튜브 (50 mL)에 나일론 메쉬 (200 µ m)를 통해 소화 마음으로 솔루션 필터.</li>
		<li>원심 29 x g 3 분 삭제에 필터링된 솔루션은 상쾌한 고 12.5 µ L CaCl 2 (250 µ M) 셀 펠 릿을 포함 하 여 6 mL 따뜻한 파월 매체를 추가 합니다. 부드러운 진동 운동을 통해 펠 릿 resuspend 다시 2 분 삭제는 상쾌한 29 x g에서 원심을 6 mL 따뜻한 파월 매체 대체 25 µ L CaCl 2 (500 µ M)를 추가 합니다. 부드러운 진동 운동을 통해 셀 펠 릿을 녹이 고 12 mL 따뜻한 파월 중간 포함 120 µ L CaCl 2 (1 mM) 추가. 1 분 16 x g에서 3 시간 동안 원심 분리기. 다시는 상쾌한 제거.</li>
		<li>미리 따뜻하게 도금 매체와 셀 펠 릿 혼합.</li>
		<li>배양 배지에서 사전 도금 매체를 제거합니다. 전송 매체, 절연된 cardiomyocytes 각 문화 접시를 포함 하 여 도금 1 mL. 1 헤 37 ° C에서 신선한 절연된 cardiomyocytes 품 어</li>
		<li>배양 배지에서 도금 매체를 제거합니다. 각 문화 접시를 세척 1 mL를 추가 하 고 매체를 변경 하지 않고 6 일 37 ° C에서 접시를 저장.</li>
		<li>다른 화학 물질과 ARVC에 치료의 영향 조사, 먼저 매체를 세척 하 고 그 후 다른 화학 물질을 추가 하 여 도금 매체를 새로. 
		참고: 가벼운 현미경 검사 법 평가: 각 셀 준비, 150 ~ 300 cardiomyocytes 모니터링 해야 하루 가벼운 현미경 검사 법에 의해. 모든 계산된 cardiomyocytes 그들의 모양에 따라 그룹으로 세분화 (예를 들어, &#34; 막대 모양 &#34;, &#34; 다운 라운드 &#34;, &#34; 확산 &#34;, 및 &#34; 특이 한 모양을 &#34;). 카테고리 &#34; 확산 &#34; pseudopodia와 같은 구조를 가진 모든 cardiomyocytes 포함. &#34; 특별 한 모양을 &#34;는 불규칙 한 표면 가진 모든 ARVC 및 없음 감지 그대로 세포 막.</li>
	</ol></li></ol> 3. 예를 들어 실험 <ol><li><ol><li>분석 형태학 및 구조 변환 ARVC의 공초점 레이저 현미경 검사 법에 의해 재배 중 형광/면역 형광 성인 cardiomyocytes의 얼룩. Phalloidin-TRITC를 사용 하 여 F-말라 구조 조사 &#34; 막대 모양 &#34;, &#34; 다운 라운드 &#34;, 및 &#34; 확산 &#34; ARVC. 제조 업체에 따라 얼룩 수행 &#39; s 프로토콜. Phalloidin-TRITC 얼룩에 대 한 예로 참조 Nippert 외에 주어진 11. 면역 형광 형광/얼룩과 차이에 드-하 고 다시-differentiation 재배 성인 cardiomyocytes 실험적 치료 (예를 들어,와 사이에서 수축 성 기구의 Swiprosin-1, ionomycin) 조사 수.</li>
	</ol></li> <li>실시간 양적 RT-PCR (qRT-PCR) <ol><li>다른 유전자의 mRNA 표현에서 변화를 조사 하기 위해 qRT-PCR을 수행 (예를 들어, OSM, Swiprosin-1, β-MHC) ARVC의 재배 중. 충분 한 샘플 크기에 대 한 더 큰 문화 요리 사용 (내부 직경: 60 m m) 2 mL 볼륨. 5 문화 요리 ARVC 한 샘플을 생성합니다. MRNA의 절연 및 변환 제조 업체에 따르면 cDNA의 수행 &#39; s 프로토콜.</li>
	</ol></li> <li>Immunoblot 기법 <ol><li>수행 서 몰아내고 단백질 식 (예를 들어, Swiprosin-1) ARVC의 경작 동안에 변화를 조사. 샘플 당 하나의 문화 접시 (1 mL)을 사용 하 여.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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표시 된 결과 프란체스카 Nippert의 박사 논문의 일부입니다.

성인 cardiomyocytes에 vivo에서 의 행동은 다른 셀 (예:신경 세포, 내 피 세포, 섬유 아 세포, 염증 세포)와 그들이 형성 하는 전기 syncytium 많은 상호 작용에 의해 영향을1. 따라서, 성인 cardiomyocytes의 스트레스 적응을 독점적으로 공부 해야 분리와 ARVC의 재배 합니다. 분리 하 고 ARVC를 재배의 주요 효과: 1) 기질과 셀 연락처;에서 그들을 분리 2) 수축 자극;에서 그들을 분리 3...

Vivo에서 성인 cardiomyocytes는 전기 syncytium myocytes 사이 셀 연락처를 기반으로 작동 합니다. 또한, 그들은 심장 섬유 아 세포, 내 피 세포, 신경 세포, 염증 세포1같은 인접 한 세포에 의해 영향을 받습니다. 초기 단계를 선도 하 고 심장 마비, 분리와 성인 심 실 쥐의 심장 비 대, 동안 본 부하 조건 변경 cardiomyocytes의 능력을 그들의 세포내 조직 적응을 공부 하기 위하여 cardiomyocytes (ARVC)는 필요한2,,34. 역사적으로, cardiomyocytes가 했다 미 발달 병아리 마음5,6에서 격리 된 처음. 몇 년 후, 말기 차별화 cardiomyocytes의 첫 번째 절연 칼슘 고갈7을 사용 하 여 설명 했다. 그러나, 이러한 성인 cardiomyocytes 칼슘 허용 되었고 따라서 하지 사용 될 수 있는 기능 분석 실험. 마지막으로, 1976 년에 새로운 프로토콜 활성화 파월과 트위스트 생리 조건8에서 성인 심 실 cardiomyocytes 조사. 첫 번째 단계로 서, 그들은 낮은 칼슘 농도 및 생리 적인 농도 단계적 절차에서 그 후 증가 칼슘 성인 cardiomyocytes 고립. 오늘, 분리와 성인 cardiomyocytes의 재배에 대 한 대부분의 프로토콜이 칼슘 프로토콜을 사용 하 고 조밀한 셀 연락처1의 효소 소화에 콜라를 사용 합니다.
성공적인 재배 송아지 태아 혈 청 (FCS) 또는 oncostatin M (OSM)가 필요 합니다. ARVC 수행는 데-그리고 다시-differentiation sarcomere 해체와 개혁9,10,,1112를 포함 하 여 광범위 한 구조 변경 합니다. Β-myosin 무거운 체인 (β-MHC) 처럼 태아 형 유전자의 재 식이이 과정 동반 비, 및 pseudopodia 같은 구조, 퍼지는4,11, 이라고의 형성에서 알려진 13. swiprosin-1 (EFHD2), 새로 확인된 된 단백질 재배 ARVC11의 재 분화는 주요 역할을 수행 하는 또한. 그 결과, ARVC 문화에 광범위 하 게, 다형성 셀 문화2,4,14에서 2 ~ 3 주 후 저절로 수축을 표시 하는 변환.
최근의 발견을 심장 다시 de differentiation 모방 문화 조건 하에서 발생 하는 대로 본 기능 vivo에서 심장 개장10,15동안 밝혀졌다. 개장 하는 심장 심장 질환16동안 핵심 과정 이다. 심장 질환은 여전히 산업화 사회에서 죽음의 주요 원인, 성인 cardiomyocytes의 생물학의 더 나은 이해 중요 하다 (누가, 2015). 절연 및 ARVC의 새로운 전략 및 심장 질환의 치료에 대 한 의약품 개발을 도울 수 있다. 이 원고와 분리와 ARVC의 재배에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 또한,이 방법의 몇 가지 중요 한 부분 토론 섹션에서 강조 표시 됩니다.

<table><tbody><tr><td>Langendorff perfusion system</td><td>inhouse construction</td><td></td><td>double-walled with a water&lt;br/&gt; based heating system</td></tr><tr><td>Tissue chopper Mc Ilwain</td><td>Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aortic Cannula, OD 1,8 mm</td><td>inhouse construction</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Abdominal shears</td><td>Aeskulap</td><td>BC772R</td><td></td></tr><tr><td>Capsule forceps</td><td>Eickemeyer</td><td>171307</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissor large</td><td>Aeskulap</td><td>BC562R</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissor small</td><td>Aeskulap</td><td>BC163R</td><td></td></tr><tr><td>Mash with Polyamid</td><td>Neolab</td><td>4-1413</td><td>mash size 200 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>plastic disc</td><td>Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Typ II</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and cultivation of adult rat cardiomyocytes

그대로 마음에 인접 한 셀 성인 cardiomyocytes 영향. 격리의 방법 및 성인 cardiomyocytes의 경작, 및 특정 환경에서 이러한 셀의 동작의 정확한 조사 가능 하다. 이 원고는 성공적인 격리와 성인 쥐 심 실 cardiomyocytes (ARVC)의 재배에 대 한 프로토콜을 제공합니다.
쥐 자 궁 경부 전위 깊은 마 취에 의해 희생 이다. 그런 다음 심장 추출 되 고 대동맥 적용 되지 않습니다. 그 후, 관류 칼슘 소모와 콜라 치료 Langendorff 관류 시스템에서 수행 됩니다. 나중에, 심 실 조직 되 면 다진, 다시 유통, 필터링, 생리 적인 칼슘 농도 도달할 때까지 점진적 추가 CaCl2 3 원심 분리 단계 뒤. ARVC 셀 문화 요리에 도금 된다. 세포 배양 후, ARVC 수 재배 최대 6 일 동안 혈 청에 포함 된 문화 매체를 변경 하지 않고. ARVC의 격리 칼슘 민감한 과정 이다입니다. 세포내 칼슘 농도 있는 작은 변화 일으킬 품질 및 고립 된 세포의 생존 능력에 있는 감소.
갓 절연 ARVC 막대 모양입니다. 재배의 첫 번째 일 이내 그들은 손실 막대 모양의 형태와 양식 pseudopodia 같은 구조 (확산). 이 형태 형성 동안 ARVC는 처음 이어서 걸 스트레스 섬유와 드 노 보 sarcomerogenesis 통해 개혁 그들의 수축 성 요소 저하. 재배의 1 주일 후 대부분 ARVC 명확 하 게 감지 크로스 줄무늬와 광범위 한 모습을 보여줍니다. 이 과정은 ionomycin와 치료 약하게 확산으로 세포내 칼슘 농도에 민감 하다. 이 과정을의 드-하 고 다시-differentiation 키 표식은 β myosin 무 겁 사슬 (β-MHC), oncostatin M (OSM), 및 swiprosin-1 (EFHD2) 있습니다. 최근 연구는 심장 개장 동안 기능 본 vivo에서 모방 심장 다시 de differentiation 발생 문화 조건 하에서 제안 했다. 따라서, 절연 및 ARVC의 재배 cardiomyocytes의 생물학 이해에 중요 한 역할을 재생 합니다.

문화에서 성인 cardiomyocytes: 그림 1 마지막 세척 후 갓 절연된 성인 cardiomyocytes 2 h에 대 한 개요를 보여 줍니다. 모든 cardiomyocytes의 약 75%는 막대 모양의 형태를 했다. 나머지 25%는 둥근 형태와 전혀 감지 그대로 세포 막 (그림 1) 특이 한 모습을 보여주었다. 최대 재배 (6 일)의 끝에 pseudopodia 같은 구조 없이 둥근 형태에 ...

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Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

여기, 우리는 분리와 성인 쥐 심 실 cardiomyocytes (ARVC)의 재배에 대 한 프로토콜을 제시. 단기 및 장기 재배에 대 한 고립 된 ARVC는 사용할 수 있습니다. 분리와 ARVC의 재배는 심장 질환에 대 한 새로운 치료 regimens 개발에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다.

절연 및 성인 쥐 Cardiomyocytes의 재배

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

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Medicine

15.5K 조회수.  Justus Liebig University Giessen. 여기, 우리는 분리와 성인 쥐 심 실 cardiomyocytes (ARVC)의 재배에 대 한 프로토콜을 제시. 단기 및 장기 재배에 대 한 고립 된 ARVC는 사용할 수 있습니다. 분리와 ARVC의 재배는 심장 질환에 대 한 새로운 치료 regimens 개발에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다.

비디오: Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for &#945;-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.

The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.

분리 및 신생아 쥐 심근 세포의 냉동 보존

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is ...

연구

발생학

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

성인 쥐 심장 Myocytes의 차 문화

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

생물학

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

공촛점 이미징에 대한 분리 및 성인 심장 Myocytes의 유전자 조작

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

분리 및 문화 신생아 마우스 심근

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

절연, 문화, 그리고 성인 마우스 된 심근의 기능적 특성

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of metabolic syndrome (MetS)-related heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF). The prevalence of MetS-related HFpEF is rising, and atrial cardiomyopathies associated with atrial remodeling and atrial fibrillation are clinically highly relevant as atrial remodeling is an independent predictor of mortality. Studies with isolated single-cell cardiomyocytes are frequently used to corroborate and complement in vivo findings. Circulatory vessel rarefication and interstitial tissue fibrosis pose a potentially limiting factor for the successful single-cell isolation of ACMs from animal models of this disease.
We have addressed this issue by employing a device capable of manually regulating the intraluminal pressure of cardiac cavities during the isolation procedure, substantially increasing the yield of morphologically and functionally intact ACMs. The acquired cells can be used in a variety of different experiments, such as cell culture and functional Calcium imaging (i.e., excitation-contraction-coupling).
We provide the researcher with a step-by-step protocol, a list of optimized solutions, thorough instructions to prepare the necessary equipment, and a comprehensive troubleshooting guide. While the initial implementation of the procedure might be rather difficult, a successful adaptation will allow the reader to perform state-of-the-art ACM isolations in a rat model of MetS-related HFpEF for a broad spectrum of experiments.

Here, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes from a rat model of metabolic syndrome-related heart failure with preserved ejection fraction. A manual regulation of intraluminal pressure of cardiac cavities is implemented to yield functionally intact myocytes suitable for excitation-contraction-coupling studies.

심 방 Cardiomyocytes 보존된 방출 분수와 함께 대사 증후군 관련 심장 마비의 쥐 모델에서의 격리

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of ...

의학

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

분리 및 문화 성인 마우스 세포 신호 전달 용의 Cardiomyocytes과의<em&gt; 시험관</em&gt; 심장 비대

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

격리, 문화 및 성인 마우스 심근 세포의 형질 도입

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and molecular functional experiments (e.g., contraction, electrophysiology, calcium cycling, etc.) on cardiomyocytes are the gold standard for establishing mechanism(s) of disease. The mouse is the species of choice for functional experiments and the described technique is specifically for the isolation of mouse cardiomyocytes. Previous methods requiring a Langendorff apparatus require high levels of training and precision for aortic cannulation, often resulting in ischemia. The field is shifting toward Langendorff-free isolation methods that are simple, are reproducible, and yield viable myocytes for physiological data acquisition and culture. These methods greatly diminish ischemia time compared to aortic cannulation and result in reliably obtained cardiomyocytes. Our adaptation to the Langendorff-free method includes an initial perfusion with ice-cold clearing solution, use of a stabilizing platform that ensures a steady needle during perfusion, and additional digestion steps to ensure reliably obtained cardiomyocytes for use in functional measurements and culture. This method is simple and quick to perform and requires little technical skill.

The gold standard in cardiology for cellular and molecular functional experiments are cardiomyocytes. This article describes adaptations to the non-Langendorff technique to isolate mouse cardiomyocytes.

마우스 심근 세포를 일관되게 분리하는 간단하고 효과적인 방법

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular mechanisms of cardiovascular disease progression such as cardiac hypertrophy, fibrosis, and atherosclerosis. Although several attempts with variable success have been made to develop immortalized cell lines from the cardiovascular system to understand these cellular mechanisms, primary cells offer a more natural and close to in vivo environment for such studies. Therefore, different laboratories working on a particular cell type have developed protocols to isolate individual types of rat cardiac cells of interest. A protocol that allows the isolation of more than one cell type, however, is missing. Here an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation and enables their use for cellular analyses. This permits the most efficient use of available resources, which may save time and reduce research costs.

Several protocols have been developed and described for the isolation of different cardiac cell types from a rat heart. Here, an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation, reducing the experimental costs.

성인 쥐 심장에서 고품질 Cardiomyocytes, 내피 세포 및 섬유 아세포의 동시 격리

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...