외부 자극에 대한 세포 반응은 주어진 순간에 세포 표면에 발현되는 단백질 세트에 크게 의존합니다. 따라서, 이들 단백질의 수, 서브세포 국소화 및 서브유닛 조성물은 동적으로 조절된다. 여기서, 우리는 내재화 및 재활용이 재개되는 한, 세포 배양에서 표면 발현 수용체의 수준을 정량화하기 위해 항체 공급 접근법을 사용할 것입니다.
이것은 표면 표현 단백질의 규칙의 기계론적인 정보를 제공하는 매우 다재다능한 프로토콜입니다. 우리의 예에서, 우리는 1 차적인 해마 뉴런에 있는 글루타민 수용체를 공부할 것입니다. 이 프로토콜은 항문 외 세포 외 에피토프를 소유하는 모든 단백질에 적응할 수 있고, 항체를 사용할 수 없는 경우에, 태그된 구조물의 transvection는 특정 돌연변이를 표지하고 공부하는 둘 다유용할 수 있습니다.
우리의 예에서, 우리는 내인성 GluA1에 대하여 항체를 사용하고, 이 절차를 시작하기 B.To glu12를 태그하고, 커버 전표 세포 측을 파라핀 필름 커버 트레이로 옮기고, 시약을 저장하고, 조작을 용이하게 합니다. 인큐베이션 및 세척 단계를 위해 조건부 미디어를 섭씨 37도에서 저장하고 유지관리합니다. 조건부 매체, 실온에서 15분 동안 희석된 1차 항체로 세포를 배양한다.
그 후, 진공 파이펫을 사용하여 미디어를 포함하는 항체를 조심스럽게 흡인시키고, 조건부 된 매체로 세포를 세 번 세척한다. 세포내 수용체 발현과 세포 내 수용체 발현을 연구하는 경우 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 이 단계 후 paraformaldehyde로 세포를 수정합니다. 항체 없이 조절된 매체에서 세포를 유지하고, 내산화를 허용하기 위해 섭씨 37도에서 인큐베이터로 돌려보라고 한다.
내재화 프로세스를 공부하는 경우 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 이 단계 후 paraformaldehyde로 세포를 수정합니다. 내산화되지 않은 표면 발현 수용체에 부착된 1차 항체상의 에피토프를 차단하기 위해, 조건부 에서 희석된 Fab 안티-IgG 항체 단편을 사용하여 세포를 인큐베이션하여 실온에서 20분 동안 한다. 그 후, 조절된 매체로 세포를 세 번 씻는다.
세척된 우물을 80마이크로몰러 Dynasore가 포함된 조건부 매체로 배양하여 섭씨 37도에 내부화된 수용체의 재활용을 허용합니다. 라이브 셀에 대한 수정을 완료 한 후 PBS 플러스로 한 번 세포를 씻으시다. 세포에 PBS에 4%의 파라포름알데히드와 4%의 자당의 용액을 추가하고, 세포를 고치기 위해 실온에서 연기 후드에 인큐베이션을 7~8분 간 배양한다.
그런 다음 일반 PBS로 셀을 세 번 씻으시면 됩니다. PBS에 10%의 일반 염소 세럼의 용액을 세포에 추가하고 실온에서 30분 동안 배양하여 비특이적 결합 부위를 차단합니다. 다음으로, 1시간 동안 실온에서 PBS에서 3%NGS로 희석된 형광 태그이차항체를 사용하여 세포를 배양하여 1차 항체 라벨 수용체에 라벨을 부착한다.
그 후 PBS로 셀을 세 번 씻으시면 됩니다. 세포내 수용체에 라벨을 붙이려면 PBS에서 0.25%의 TritonX용액을 추가하고 실온에서 5~10분 동안 배양하여 세포를 침투합니다. 그런 다음 실온에서 10%NGS로 30분 동안 차단합니다.
표면대 총체를 연구하는 경우 이전에 사용한 동일한 1차 항체로 세포를 배양하고, PBS에서 3%NGS로 희석하여 1시간 동안 실온에서 세포내 수용체에 라벨을 부착합니다. 다음으로, PBS로 세포를 세 번 씻는다. 두 번째 형광 태그 이차 항체를 가진 라벨, PBS에서 3%NGS에 희석, 1 시간 동안 실온에서.
이 후에 는 PBS로 세포를 세 번 씻는다. 먼저 커버 슬립, 셀 사이드를 12~15마이크로리터에 배치하여 셀을 장착합니다. 그런 다음 적절한 공초점 현미경으로 세포를 이미지화하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포를 분석합니다.
글루타민산 수용체 인신 매매를 연구하는 이 프로토콜은 수용체의 차동 라벨링에 기초하여, 세포 표면에 표현되고, 내부 막에서 발현된 것. 공초점 심상을 습득한 후, 형광 신호는 화학 LTP에 따라 세포내 집단에 비해 표면 발현의 증가를 쉽게 정량화할 수 있다. PSD-95에 대한 신호는 비과성 세포에서 얻어질 수 없으며, 플라즈마 멤브레인의 무결성을 입증할 수 있다.
이는 표면 GluA1에 대해 얻은 신호가 실제로 표면 발현 수용체에 해당한다는 것을 나타낸다. 중요한 것은, 내재화된 GluA1에 대한 최소한의 신호는 비과구화 조건하에서 관찰될 수 있으며, 이는 모든 표면 에피토프가 항체 라벨링의 초기 라운드에 의해 점유되고 있음을 보여준다. 내면화 된 수용체는 다음 식별됩니다.
이 예는 S1480에서 GluN2B 인산화가 수용체 내산화를 촉진한다는 것을 강조합니다. 인산 돌연변이 S1480E는 야생형 수용체에 비해 내화비가 훨씬 더 높은 것으로 나타났다. 예상대로, 대조군 내산화 수용체에 대한 신호는 얻어지지 않습니다.
다음으로, 재활용 수용체와 내부 수용체가 확인됩니다. 생성된 재활용 비율은 GluN2B S1480E가 NMDAR 재활용에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여줍니다. 컨트롤에서, 팹 차단이 없는 경우, 표면 발현 GluN2B에 대해 강한 신호를 관찰할 수 있다.
이러한 신호는 Fab 처리 배양에서 사라지며, 차단 프로토콜이 표면 발현 에피토프를 완전히 차단하기에 충분하며, 재활용 후 관찰된 표면 신호가 실제로 혈장 막에 다시 인신매매된 수용체에 해당한다는 것을 입증한다. 현재 프로토콜은 표면 발현 단백질의 조절을 연구하는 데 사용할 수있는 방법 중 하나일 뿐입니다. 다른 방법은 여기에서 얻은 데이터를 확장하거나 확인하기 위해 취할 수 있습니다.
그(것)들은 생화확적인 방법, biotinylation로, 생활 화상 진찰 기술, 또는 전기 생리학 또는 칼슘 화상 진찰 같이 기능적인 접근으로 포함합니다. 우리는 PFA를 사용하여 수용체의 국소화를 동결, 그러나 PFA는 알려진 발암 물질, 그래서 연기 후드에서 PFA를 사용하여 단계를 수행하는 것이 중요합니다, 적절한 PPE를 착용하면서.
