이 방법은 HIV 분야에서 가장 영향을 받는 기관 중 2개 내에서 바이러스 전달 및 병인의 결정요인 식별과 같은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있다. 사실, 주요 고급 운전 질병 진행은 조직에서 일어난다. 감염의 특징 그리고 복잡성은 순환에 있는 세포에 의해 제대로 반영되거나 격리되고 시험관에서 감염됩니다.
HIV 병인을 연구하는 전 생체 조직 배양의 주요 장점은 2 ~ 3 주 동안 세포 사이의 원래 의 간격 및 기능적 관계를 유지한다는 것입니다. 우선, CMT의 20~30밀리리터로 100밀리미터 페트리 접시를 채우고, 젤라틴 스폰지를 멸균 포셉을 사용하여 페트리 접시에 옮긴다.
양쪽에 스폰지를 적시고 스폰지가 1 분 동안 매체를 흡수 할 수 있습니다. 멸균 주걱을 사용하여 약 2 분 동안 페트리 접시의 바닥에 스폰지를 누릅니다. 멸균 가위를 사용하여 수화 된 젤라틴 스폰지를 약 1 평방 센티미터의 동일한 크기로 자른다.
그런 다음 집게를 사용하여 하나의 스폰지 조각을 배양 판의 각 우물에 옮겨 넣습니다. 편도선에 대한 6 웰 플레이트의 각 웰에 CMT의 3 ~ 4 밀리리터를 추가하고 자궁 경부를위한 12 웰 접시에 잘 당 1 밀리리터를 추가합니다. 플레이트를 인큐베이터에 놓고, 37°C, 5%CO2로 설정되며, 조직 이축이 스폰지에 적재될 때까지 습도가 90%보다 크거나 같습니다.
수송 용기에서 편도선을 멸균 포셉을 사용하여 CMT 10~20밀리리터를 함유한 100mm 페트리 접시로 옮킨다. 페트리 접시의 뚜껑을 절단 표면으로 사용하여 조직을 해부합니다. 집게로 조직을 부드럽게 잡고, 멸균 메스와 블레이드를 사용하여 각 편도선을 다른 큰 조각으로 자릅니다.
집게와 메스를 사용하여 소작, 피 묻은 및 자궁 근종 조직뿐만 아니라 편도선 또는 녹색 갈색 을 포함하는 부품을 제거하십시오. 각 티슈 조각을 두께가 약 2밀리미터 의 조각으로 자른다. 이전 단계에서와 같이 원치 않는 부품을 제거합니다.
그런 다음 티슈 슬라이스를 2mm 두께의 스트립으로 자른다. 마지막으로, 2 밀리미터 두께의 블록으로 조직 스트립을 잘라. 해부를 진행하는 동안 조직 건조를 피하기 위해 CMT의 10 ~ 20 밀리리터를 포함하는 새로운 100 밀리미터 페트리 접시로 이양을 옮김.
해부의 끝에서, 박을 배스하여 배분 분포를 임의로 한다. 집게를 사용하여 6웰 플레이트에 각 젤라틴 스폰지 위에 9개의 티슈 를 놓고 그 사이의 공간을 허용합니다. 플레이트를 인큐베이터에 반환합니다.
일반적으로, 박은 하룻밤 배양된다. HIV접종은 다음날 수행됩니다. 이것은 배양에서 세균 또는 곰팡이 오염이 개발되지 않도록하기 위한 것입니다.
또한 세포는 해부 직후 조직 이출을 회귀하는 경향이 있습니다. 파이펫으로 6웰 플레이트에 배지를 흡인하고 소독제 용액이 있는 용기에 버려십시오. 접시를 기울이고 젤라틴 스폰지를 웰의 상부에 부드럽게 밀어 매체가 바닥에 모일 수 있도록 합니다.
매체를 흡인하고 폐기합니다. 그런 다음 각 웰에 CMT의 3 ~4 밀리리터를 추가합니다. 이제 37섭씨에서 수조에서 HIV-1 바이러스 제제를 해동하십시오.
젤라틴 스폰지에 9 개의 각 의 상단에 바이러스 접종을 피펫. 접시를 인큐베이터에 반환합니다. 페트리 접시의 뚜껑을 절단 표면으로 사용하여 조직을 해부합니다.
집게로 조직을 부드럽게 잡고, 자궁 근막의 점막 및/또는 자궁 근막및 자궁 내막과 메스와 칼날로 자궁 근막및 자궁내막을 분리하여 점막의 스트립을 얻습니다. 점막을 2mm 너비의 스트립으로 자른다. 제거 하 고 가능한 한 많은 submucosa를 폐기, 조직의 단지 2 밀리 미터 두께층을 떠나.
그런 다음 스트립을 2밀리미터 두께의 블록으로 자른다. 조직을 100mm 페트리 접시에 담기하여 CMT의 10~20밀리리터를 함유하여 해부를 진행하는 동안 조직 건조를 피합니다. 해부의 끝에서, 박을 배스하여 배분 분포를 임의로 한다.
멸균 집게로, 멸균 1.5 밀리리터 원추형 튜브로 이불을 옮기. 파이펫을 사용하여 튜브의 모든 매체를 제거합니다. 최적의 결과를 위해, 자궁 경부의 자궁 경부의 내병은 수술 후 가능한 한 빨리 처리되고 감염되어야 합니다, 이상적으로 수술의 날.
또는, 조직은 하룻밤 사이에 CMT에 침수저장되고 해부 직후에 감염될 수 있다. 섭씨 37도에서 수조에서 HIV-1 준비를 해동하십시오. 일단 해동되면, 이물질을 포함하는 관으로 바이러스를 전송합니다.
튜브를 열셰이커로 옮기고 300rpm에서 흔들리는 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 30~60분마다 튜브를 몇 번 부드럽게 반전시다. 한편, 멸균 인산염 완충식식염의 우물 당 3 ~ 4 밀리리터와 6 웰 플레이트를 채웁니다.
HIV-1을 사용한 배양의 끝에서 파이펫을 사용하여 소독제 용액이 있는 용기에 각기를 포함하는 튜브의 모든 바이러스 준비를 폐기합니다. 그런 다음 집게와 파이펫을 사용하여 PBS를 포함하는 6웰 플레이트로 이물질을 옮기습니다. 실온에서 1분 동안 PBS에서 휴식을 취하도록 허용한 후 PBS를 2~3회 위아래로 부드럽게 배관하여 씻어냅니다.
그런 다음 파이펫을 사용하여 소독제 용액을 사용하여 PBS를 용기에 버리십시오. 각 웰에 새로운 PBS의 3 ~4 밀리리터를 추가합니다. 총 세개의 세차재에 대해 두 번 더 반복합니다.
조직 탈수를 피하기 위해 스폰지에 각기를 전송하기 직전에 PBS를 폐기하십시오. 이제 집게를 사용하여 각 젤라틴 스폰지 위에 5~8개의 각기를 12웰 플레이트로 옮겨 넣습니다. 접시를 인큐베이터에 반환합니다.
파이펫으로 배양 배지 샘플을 수집하고, 영하 80도에서 보관할 수 있도록 멸균 1.5 또는 2 밀리리터 나사 캡 튜브로 전송합니다. 멸균 집게로 조직을 수확하고, 멸균 1.5 또는 2 밀리리터 나사 캡 튜브로 이불을 전달합니다. 실험에서 요구하는 대로 조직 샘플을 처리하거나 저장합니다.
파이펫으로 잔류 배양 배지를 잘 흡입하고 소독용 용기에 버려십시오. 접시를 기울이고 젤라틴 스폰지를 웰의 상부에 부드럽게 밀어 매체가 바닥에 모일 수 있도록 한 다음 흡인하고 버릴 수 있습니다. 이제 각 우물에 3~4밀리리터의 배양 배지를 추가합니다.
멸균 집게를 사용하여, 인큐베이터에 접시를 반환하기 전에 젤라틴 스폰지에 매체로 떨어졌다 모든 조직 이출을 반환합니다. 문화의 끝에서, 유해 생물학적 처리에 대한 연구소의 규정과 특정 위험 평가에 따라 apposite 용기에 모든 생물학적 폐기물을 폐기하십시오. 기증자 간 가변성은 동일한 바이러스 접종에 감염된 3개의 다른 기증자로부터 자궁 경부 조직을 위해 입증된 바와 같이 조직 박멸 배양 상류제에서 HIV 코어 단백질 p24 개그의 농도에 의해 측정된 HIV-1 복제에 영향을 미칠 수 있다.
첫 번째 기증자의 경우, HIV-1 BaL에만 감염된 축종의 배양 배지에서 p24 개그를 축적하는 것은 제품 감염을 명확하게 나타낸다. HIV 복제를 완전히 무효화하는 항레트로바이러스 약물 3TC는 부정적인 대조군으로 사용되었습니다. 3TC 처리된 이종의 배양 배지에서 측정된 p24 개그의 양은 배양 중에 조직 이월에 의해 특별히 흡수되고 방출되는 바이러스 접종의 일부를 나타낸다.
두 번째 기증자로부터 의 조직 에서 이식에서, HIV-1 창자 감염은 시간이 지남에 따라 p24 개그의 농도에 꾸준한 감소귀착, 감염의 중단을 나타내는 또는 p24 개그 정량화에 의해 검출 할 수 없습니다. 이것은 유사한 HIV 복제 역학을 보여주는 3TC 처리한 통제 각질에 의해 확인됩니다. 조직의 감염은 세 번째 기증자에서 이식 바이러스의 작은 금액을 산출.
이 경우, 3TC 치료를 음의 대조군으로 포함하면 드 노보 바이러스 생산에 감염의 존재를 확인할 필요가 있다. 이 절차에 따라, 유동 세포측정또는 면역스테인링과 같은 분석 방법은 관심 있는 세포 집단의 표현형, 비율 또는 조직 위치에 대한 질문에 답하기 위해 다른 시점에서 수행될 수 있다. 실험을 설계할 때, 기증자 간 가변성이 선택한 실험 적 판독에 미치는 영향을 추정하는 것이 중요합니다.
기증자 간 가변성은 엄격한 임상 및 실험 적 포함 및 배제 기준을 설정하여 부분적으로 제어 될 수 있습니다. Ex vivo 인간 조직 배양은 백신 바이러스 또는 헤르페스 바이러스와 같은 HIV 이외의 미생물의 발병을 연구하는 데 사용될 수 있다. 그(것)들은 또한 항균 독성 및 윤리 연구 결과를 위한 전임상 플랫폼으로 이용되었습니다.
건강한 개인조차도 모든 인간 표본이 전염성 요원을 수용 할 수 있다는 점에 유의하십시오. 귀하와 동료의 안전을 보장하기 위해 인간 조직을 처리하기 위해 적절한 교육, 교육 및 보호가 필요합니다.
