이 프로젝트는 보조금 1R03M​​H08127-01와 NIH에서 Q. 리튬에 7R03MH08127-02에서 지원하고, UAB에서 의학 교실에서 충격의 펀드 Q. 리 하였다. Molette 기금 오번 대학에서 지원을 받고있다. 우리는 또한 작업 과정에서 양 Pulin 최 씨 블라디미르 Musiienko의 기술 조교 감사합니다.

1. 셀, 바이러스 및 항 바이러스 화합물 <ol><li> BSR 세포, 5 % 소 태아 혈청 (FCS)를 포함하는 아기 햄스터 신장의 파생 둘 베코의 변형 이글 배지 (BHK) 세포를 10 일 (DMEM)을 유지, 100U/ml 페니실린 및 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신. </li><li> 세 가지 분석을 위해, 1 % FCS, 100U/ml 페니실린 및 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신과 DMEM에 플레이트 세포, 5는 이전 최적화로. 이 매체는 세 가지 분석을위한 분석 매체로 언급된다. </li><li> 5 % CO 2와 80~95%의 습도, 37 ° C에서 인큐베이터에있는 모든 세포를 품어. </li><li> 패 정화 이전에 8 바와 같이 유형 10 BTV (BTV-10)를 전파. 지정된 각 분석에 대한 분석 매체에 BTV-10을 희석. </li><li> 10 mM의 농도에서 주식을 형성하기 위해 DMSO의 모든 테스트 화합물을 용해. -20 ° C에서 주식을 저장 </li><li> 를 지정 대한 분석 배지를 사용하여 원하는 농도로 화합물을 희석D의 분석 2. </li></ol> 2. CTG 키트를 사용하여 CPE 기반 분석 <ol><li> MicroFlo 선택 분배기를 통해, 384 - 웰 마이크로 플레이트 (16 × 24에 의한 형식 검정)에 종자 BSR 세포. 파종 밀도 확실히 5000 세포 /이며, 시딩 양은 항 바이러스 효과 분석 20 μL이다. </li><li> 세포가 완전히 판에 부착 얻을 때까지 2 ~ 3 시간 동안 세포를 품어. </li><li> 물론 각각 10 μM의 최종 농도와 항 바이러스 화합물을 추가합니다. 완전히 섞는다. </li><li> 원하는 역가에 BTV를 희석하고 각 웰에 표시 MOI와 5 μL의 BTV를 추가합니다. 컨트롤에 대해 잘 분석 매체의 5 μl를 추가합니다. 5 % CO 2와 80~95%의 습도, 37 ° C에서 72 시간 동안 감염된 세포를 품어. </li><li> 72 HPI, 해동하고 사용하기 전에 실온까지 CTG 버퍼 및 동결 건조 CTG 기판을 평형으로. 회에 따른 동결 건조 된 효소 / 기질 및 완충액 시약을 혼합하여 균질 CTG 시약 용액 재구성전자 제조업체의 지침. </li><li> 15 분 동안 실온으로 분석 플레이트를 평형화. </li><li> 디스펜서 각 웰에 CTG 시약의 동일한 볼륨 (25 μL)를 추가합니다. 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안 배양 한 후, 0.1 초 적분 시간에 따라 멀티 모드 리더를 사용하여, 발광 신호를 측정한다. </li></ol> 3. 용량 - 반응 분석 <ol><li> 각각 / 잘 항 바이러스 효과 분석 20 μL 및 세포 독성 분석 25 μL의 시드 볼륨 5000 세포의 파종 밀도 디스펜서를 통해, (16 × 24에 의한 형식 검정), 384 - 웰 마이크로 플레이트에 씨 BSR 세포 . </li><li> 5 % CO 2 세포까지 80~95%의 습도, 37 ° C에서 2 ~ 3 시간 동안 세포를 품어 잘 플레이트에 부착된다. </li><li> 표 1에 나타낸 바와 같이, (96 - 웰 플레이트에 상당) 각 화합물에 대한 384 - 웰 플레이트의 분기 영역에 공정 분석. 각 농도 8 개의 반복 실험을 할당하나의 분석에서. 단지 화합물없이 바이러스를 첨가함으로써 네거티브 대조군으로서 화합물과 바이러스를 추가하지 않고, 양성 대조군으로서 첫번째 열 및 마지막 열 (12 회)를 할당. </li><li> 분석 매체에 50 μm의 화합물을 희석하고 20 μL / 잘 항 바이러스 효능 분석을위한에서 2 번째 열을 추가 할 수 있습니다. 25 μM의 농도로 8 채널 반자동 피펫을 사용하여 화합물을 다섯 번 섞는다. </li><li> 8 채널 반자동 피펫을 사용하여, 12.5 μM의 농도를 형성하기 위해 잘 섞어, 다음 열 (3 차)에 2 차 열에서 20 ㎕의 혼합물을 전송합니다. 6.25 μM의 농도가 다른 두 가지의 희석을 형성하는 다음 칼럼 (4 일)에 3 번째 열에서 20 ㎕의 혼합물을 전송하여이 과정을 반복합니다. 11 번째 열까지이 두 가지 직렬 희석을 반복합니다. 기음과 샘플을 추가하고 혼합 한 후 11 일 열에서 혼합물의 20 μl를 폐기ound. </li><li> 5 μL / 웰의 볼륨 열 (11)에 2 열에서 각 웰, BTV-10, 0.01의 MOI에 근거를 추가합니다. 바이러스를 추가 한 후, 각 항목의 최종 화합물의 농도가 있어야한다 : 2 열 20 μM, 3 열의 10 μM, 0.04 μM의 최종 농도와 열 (11) 아래로 두 배 희석을 계속. </li><li> 1 열 중간의 5 μl를 추가 셀 만 (양) 제어 및 BTV 감염으로 열 12 BTV의 5 μL / 잘 만 제어 (마이너스)로. </li><li> 세포 독성 분석 200 μM의 초기 농도의 화합물을 희석. 마찬가지로, 100 μM의 농도로 8 채널 반자동 피펫으로 2 열 및 혼합 배에 25 μL / 잘 화합물을 추가합니다. BTV를 추가하지 마십시오. </li><li> 이웃 열 3 열 2에서 25 μl를 흡입하여 두 가지 시리즈의 희석을 수행하고, 마지막 열 (12 일)까지 계속했다. 열 (12)에서, 혼합 후, 대기음 및 m의 25 μl를 폐기ixture. 2 열에서 최종 농도는 100 μM해야하며 12 번째 열은 0.2 μM에 있어야합니다. 1 열은 셀에만 컨트롤입니다. </li><li> 모두 항 바이러스 효능과 독성 시험 법의 경우, 5 % CO 2와 72 시간의 후 처리에 대한 80-95%의 습도, 37 ° C에서 접시를 품어. (프로토콜 2.5-2.7 단계) 상술 한 바와 같이 CTG 키트를 사용하여 세포 생존율을 측정한다. </li></ol> 4. 시간의 - 추가 TOA () 분석 <ol><li> 5000 세포 / 웰의 디스펜서 및 시드 볼륨을 통해 15 μL / 잘, 384 - 웰 마이크로 플레이트에 열 1-24 (X 24 (16)에 의해 형식 검정)에서 종자 BSR 세포. </li><li> 각 화합물의 경우, 384 - 웰 플레이트 (표 2)의 절반마다 포인트 8 개의 복제본을 모두 스물 네 열을 사용합니다. 10 μL / 잘 분석 매체를 추가하여 세포만을 제어와 같은 열 1을 할당합니다. 마크 열 (24) 5 μL / 잘 분석 매체를 추가하여 BTV 감염 만 제어 (대조군)으로25 μL / 웰의 최종 부피 0.01 MOI에서 D 5 μL / 잘 바이러스. </li><li> 열 2-22 다른 시간 후 감염 (HPI)에서와 같은 항 바이러스 효능 평가 열에서 짝수 열을 선택합니다. 이 컬럼에서, 0.01의 MOI에 5 μL / 잘 BTV와 세포를 감염. 다른 HPI에서, 또한 잘 25 μL /의 최종 볼륨을 형성하는 각 웰에 5 μL / 잘 희석 된 화합물을 추가합니다. 에 대한 표시 -2와 -1 HPI 전에 BTV 감염 BSR 세포에 화합물을 추가합니다. 0 HPI를 들어, 동시에 문화 화합물 및 BTV를 추가합니다. </li><li> 화합물은 대조군으로 병렬, (-2, -1, 0, 1, 2, 4, 8, 16으로 지정되는 화합물은 상이한 시간 지점에서 첨가하고, 컬럼 3-23에서 홀수 열을 지정 24, 48 HPI). 이 컬럼에서, 5 μL / 잘 분석 매체를 추가하고 5 μL / 잘 잘 25 μL /의 최종 볼륨을 형성하는 화합물을 희석. </li><li> 치료 후, 37 ° C에서 5 % CO 2와 80 ~ 95 %의 습도보기에서 세포를 배양. </li><li> 이전에 (프로토콜 2.5-2.7 단계) 한 바와 같이 CellTiter 저런 형광 키트를 사용하여 72 HPI에서 세포 생존 능력을 결정합니다. </li></ol> 5. 데이터 분석 <ol><li> 멀티 모드 리더를 통해 얻어진 발광 신호에 기초하여 적절한 내부 소프트웨어를 사용하여 제 모든 데이터를 처리한다. 10 %보다 더 큰 값을 필요로하는 평균 값 (평균), 각 치료에 대한 표준 편차 (STDEV)뿐만 아니라 계수의 변화 (CV)를 결정합니다. </li><li> biostatic 및 그래픽 소프트웨어 도구에 위의 소프트웨어에서 처리 된 데이터를 전송합니다. EC (50) 및 CC (50)의 값을 결정하기 위해 비선형 회귀 분석을 수행. </li></ol>

<ol>
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Methods. 179, 396-401 (2012).</li><li>Kampmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+screening+of+small+molecule+libraries+using+the+dengue+virus+envelope+E+protein+has+identified+compounds+with+antiviral+activity+against+multiple+flaviviruses.">In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses.</a> Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).</li><li>Kirchmair, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+anti-viral+agents+using+molecular+modeling+and+virtual+screening+techniques.">Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques.</a> Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

바이러스 히트 초기 식별, 항 바이러스 약물 발견과 개발을위한 중요한 단계 중 하나는, 정량 가능한 마커를 선택하는 간단한 프로토콜을 개발, 충분한 신호와 10 % 미만의 CV를 획득 포함하는 견고한 분석법을 개발하는 것이다. 대부분의 생화학 적 또는 세포 - 기반 화면 인해 선별 과정에서 필요한 재현성 및 스크리닝하는 분자의 잠재적으로 많은 수의 가장 강력한, 간단하고 저렴한 분석, 기초 화...

BTV는 속 Orbivirus, 가족 Reoviridae에 프로토 타입 이중 가닥 RNA 바이러스이다. BTV는 세계 1,2 30억달러 / 년 손실, 양, 염소, 소와 다른 가축 등 국내 가축의 가장 중요한 질병 중 하나입니다. 이국적인 BTV의 혈청 형에 나열된 중요한 동물 병원체는 &quot;USDA 높은 위험성 평가 가축 병원체.&quot; 최근 다시 부상 BTV의 북부 유럽 3,4에 걸쳐 여러 국가의 주요 가축 질병의 발생과 양을 발생했습니다. 경제적으로 중요한 결과 및 모델 시스템으로서, BTV는 유용한, 분자 유전 학적 및 구조적 연구의 대상이되어 왔으며, 몇몇 백신이 개발되었다. 그러나, 항 바이러스 약물 발견을위한 적합한 분석법의 부족 때문에, BTV 대에는 항 바이러스제는 없다. 모델 시스템으로 BTV를 사용하여 최근의 높은 처리량 검사 (HTS) 캠페인, 우리는 거라고, eveloped 최적화 아르보 바이러스 5에 대한 잠재적 인 광범위한 스펙트럼 항 바이러스를 식별 할 수있는 CPE 기반의 분석을 확인. CPE 기반의 분석은 신속하고 관찰 할 수있는 CPE / 세포 사멸 5-7을 유발 바이러스의 숫자에 대한 항 바이러스 약물 발견에 사용 된 잘 인식 분석이다. 우리의 시스템에서, 포스트 BTV 감염, CPE는 헬라, BSR 및 HEK 293T 8을 포함한 척추 동물의 세포에 분명하다. BTV 유도 CPE는 CellTiter 글로 세포 생존 시약 키트 (CTG 키트) 9를 포함한 다양한 세포 생존 검출 방법을 사용하여 모니터링하고 정량화 할 수있다. 이 키트는 대사 적으로 활성 살아있는 세포의 존재를 신호 셀룰러 ATP의 정량에 기초 문화 가능한 세포의 개수 표시를 결정한다. 최적의 조건에서, 여기에 제시된 CPE 기반의 분석은 &quot;혼합 및 측정&quot;한 단계 프로토콜 및 안정 발광 신호와 유연성의 가능성을 보여 주었다. 한편, 독성 화합물의 redu세포 생존 능력을의 cing은이 CPE 기반 분석에서 제외됩니다. CPE 기반의 분석은 그 견고성과 BTV에 대한 항 바이러스 약물 발견을위한 신뢰성을 보여 잠재적 인 항 바이러스 리드 화합물 (들 여섯 새로운 클러스터의 식별에지도하는 NIH 분자 도서관 작은 분자 저장소 (MLSMR)를 화면에 사용 된 ) 5. 잠재적 인 항 바이러스 화합물을 CPE 기반 분석을 사용하여 확인 된 경우는 항 바이러스 효능 및 독성 2의 범위를 결정하기 위하여 열 - 농도 용량 - 반응 분석을 실시 할 필요가있을 것이다. 항 바이러스 효능은 50 % 억제 농도 (IC 50) 또는 50 % 유효 농도 (EC 50)로 표현,베이스 라인과 최대 사이에 바이러스에 의한 CPE 반 억제하는 약물의 농도이다. 항 바이러스제의 세포 독성은, 50 %의 세포 독성 농도 (CC 50) 즉, 농도는기준선과 최대 사이의 50 % 세포 독성을 유발하는 약물. 50 % SI (SI 50)로 표시 선택적 지수 (SI)는 바이러스에 의한 CPE에 대한 항 바이러스의 특이성을 결정 CC 50 / IC (50)로부터 계산된다. IC 50 (또는 EC 50), CC (50)와 SI (50) 값은 항 바이러스 화합물은 강력하고 더 약물 개발을위한 선택 여부를 확인하는 중요한 조치이다. 항 바이러스가 시험 관내에서 어떠한 명백한 독성을 나타내지 않았다 아직 방지 바이러스 CPE 및 생산성 바이러스 라이프 사이클을 유도 할 때, 그 2 대학교 미술관을 특성화하는 것이 중요하다. 우리는 바이러스에 의해 영향 바이러스 라이프 사이클의 수 단계 (들)를 결정하기 위하여 토아 분석을 수행하여 그러한 특성을 개시. 일반적으로, 항 바이러스 화합물을 상이한 시간 전 또는 후 바이러스 감염시 세포에 첨가 하였다. 항 바이러스가 감염된 세포에 추가 된 경우 그 대상들에 게시이전 단계에 첨가 한 비교하여 TEP 감염 과정 동안, 그것은 낮은 활성을 초래할 것이다. 따라서, 토아 연구는 하나의 바이러스 라이프 사이클 또는 바이러스 성 수명주기에 관여 호스트 기계에, 화합물의 항 바이러스 효능, 그것의 잠재적 인 대상을 결정하는 것이 중요합니다. 세 가지 분석법을 위해, 세포 생존율은 제조업체의 지시에 5 다음 CTG 키트를 사용하여 측정 하였다. 이 검출 시스템은 다양한 내부 소프트웨어를 사용하여 분석 할 수있는 적절한 발광 신호를 출력한다. 각각의 분석은 적어도 8 개의 복제본이 중으로 확인 및 수행 하였다. 모든 콘텐츠 데이터의 경우, 평균값 (AVE), 표준 편차 (STDEV) 및 공동 효율적인 변동 (CV) 등 세 가지 파라미터는, 분석의 견고성을 결정하기 위해 분석 하였다. 분석의 견고성이 결정되면, 데이터가 더 분석하고 다양한 biostatics 및 graphi를 이용하여 나타내 어질 것이다C 공구 2.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1134218</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1000185</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gbico</td>
			<td>1049769</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo (CTG) kit</td>
			<td>Promega</td>
			<td>TB288</td>
			<td>For cell viability measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S25309B</td>
			<td>Diluted from 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antiviral huashilcompounds</td>
			<td>NIH MLSMR and de novo synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTV-10</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>VR-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSR cell</td>
			<td>Developed in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy-II multi-mode microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>For luminescent signal reading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroFlo select dispenser</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Adding cells, virus, and reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well flat-bottom microplate</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>28908031</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen. 5 software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 5</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Version 5</td>
			<td>For biostatic analysis and plot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assays for the identification of novel antivirals against bluetongue virus

BTV에 대한 잠재적 인 항 바이러스제를 확인하기 위해, 우리는 개발, 최적화 및 여기에 제시된 세 가지 분석을 확인했다. CPE 기반의 분석은 화합물은 항 바이러스 효능을 보여 큰 화합물 라이브러리를 화면으로 사용되었는지 여부를 평가하기 위해 개발 된 최초의 분석이었다. 한편, 항 바이러스의 세포 독성은 CPE 기반 분석을 사용하여 평가 될 수있다. 용량 - 반응 분석을 선택된 바이러스에 대한 효능의 범위를 결정하기 위해 디자인 된, 50 % 억제 농도 (IC 50)이나 유효 농도 (EC 50)뿐만 아니라 세포 독성의 범위 (CC 50) 즉. 토아 분석은 BTV 바이러스 라이프 사이클 또는 호스트 세포 기계에 대한 가능한 영향 동안 새로운 항 바이러스제의 기본 메커니즘을 결정하는 최초의 대학교 미술관의 연구에 사용 하였다. 이러한 분석은 세포 배양 시스템의 항 바이러스 효능을 평가하는데 매우 중요합니다, 우리의 최근의 연구지도를 위해 사용되어왔다BTV에 대한 새로운 항 바이러스제의 숫자의 식별을 보내고.

1. 화합물의 항 바이러스 효능 세포 기반 분석 CPE는, 개발 및 최적화 이전 2,5 바와 같이 BTV 대해 신규 바이러스제를 식별하는 발광 기반 CTG 키트를 사용하여 시험 관내에서 입증되었다. 열 - 투여 량 반응 분석은 살아있는 세포 5,11 제시 세포 ATP의 정량에 기초 문화 대사 생존 세포의 수를 측정함으로써 확인 된 리드 화합물의 항 바이러스 효능 및 독성을 ?...

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Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

세포 변성 효과 (CPE) 기반의 분석, 용량 - 반응 분석 및 시간 - 중 - 추가 TOA () 분석 등의 세 가지 분석은 물론, 개발, 최적화, 검증 및 Bluetongue 바이러스에 대한 새로운 항 바이러스제 (BTV)를 식별하기 위해 사용 된 새로 확인 된 항 바이러스제에 사용할 수있는 기계 장치의 액션 (대학교 미술관)을 결정하기로.

Bluetongue 바이러스에 대한 항 바이러스제 소설의 식별에 대한 분석

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

assays-for-identification-novel-antivirals-against-bluetongue

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.9K 조회수.  University of Alabama at Birmingham.  세포 변성 효과 (CPE) 기반의 분석, 용량 - 반응 분석 및 시간 - 중 - 추가 TOA () 분석 등의 세 가지 분석은 물론, 개발, 최적화, 검증 및 Bluetongue 바이러스에 대한 새로운 항 바이러스제 (BTV)를 식별하기 위해 사용 된 새로 확인 된 항 바이러스제에 사용할 수있는 기계 장치의 액션 (대학교 미술관)을 결정하기로. 

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Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

사용하여 전통과 소설 오버레이 시스템 : 플라크 분석 실험을 통해 바이러스 농도 결정

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

연구

면역학 및 감염병학

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

초기 바이러스 성 항목 식별을위한 분석 실험 및 항 바이러스 화합물의 평가

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

정성 및 정량 검출을위한 시험 법 및 단백질 항생제 특성

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

유전자 또는 약물 치료에 사용하기 위해 HIV-1 생산을 표적 RNA를의 효능 및 독성 평가

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst leukocytes and in their non-activated state are constitutively committed to apoptosis. When recruited to inflammatory sites to resolve inflammation, they produce an array of cytotoxic molecules with potent antimicrobial killing. Yet, when these powerful cytotoxic molecules are released in an uncontrolled manner they can damage surrounding tissues. In recent years however, neutrophil versatility is increasingly evidenced, by demonstrating plasticity and immunoregulatory functions. We have recently identified a new neutrophil-derived subpopulation, which develops spontaneously in standard culture conditions without the addition of cytokines/growth factors such as granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF)/interleukin (IL)-4. Their phagocytic abilities of neutrophil remnants largely contribute to increase their size immensely; therefore they were termed giant phagocytes (G&#981;). Unlike neutrophils, G&#981; are long lived in culture. They express the cluster of differentiation (CD) neutrophil markers CD66b/CD63/CD15/CD11b/myeloperoxidase (MPO)/neutrophil elastase (NE), and are devoid of the monocytic lineage markers CD14/CD16/CD163 and the dendritic CD1c/CD141 markers. They also take-up latex and zymosan, and respond by oxidative burst to stimulation with opsonized-zymosan and PMA. G&#981; also express the scavenger receptors CD68/CD36, and unlike neutrophils, internalize oxidized-low density lipoprotein (oxLDL). Moreover, unlike fresh neutrophils, or cultured monocytes, they respond to oxLDL uptake by increased reactive oxygen species (ROS) production. Additionally, these phagocytes contain microtubule-associated protein-1 light chain 3B (LC3B) coated vacuoles, indicating the activation of autophagy. Using specific inhibitors it is evident that both phagocytosis and autophagy are prerequisites for their development and likely NADPH oxidase dependent ROS. We describe here a method for the preparation of this new subpopulation of long-lived, neutrophil-derived phagocytic cells in culture, their identification and their currently known characteristics. This protocol is essential for obtaining and characterizing G&#981; in order to further investigate their significance and functions.

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

We describe here a method for obtaining and identifying a newly characterized subpopulation of neutrophil-derived giant phagocytes. These cells develop in culture from fresh human blood neutrophils, and are characterized by phagocytosis, autophagy, immensely large size, and extended lifespan. This method is essential to further investigate this unique neutrophil-derived subpopulation.

인간 호중구 유래 거 식세포의 소설 모집단의 개발 및 식별<em&gt; 체외</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

형광 기반의 뉴 라미니다 아제 억제 분석은 항 바이러스제의 뉴 라미니다 아제 억제제 클래스에 인플루엔자 바이러스의 감수성을 평가하기 위해

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

심사 분석 실험 소설 내 피 레 귤 레이 터 염증 반응에 관여 하

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

전체 혈액 샘플에서 바이러스의 검출, 안전, 신속 하 고 간단한 수동 침대 핵 산 추출

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

코딩 및 비 코딩 RNA 클래스의 식별 표시 돼지에서 전 혈

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular mechanisms underlying the production of the vast repertoire of antibodies by the acquired immune systems, it has not yet been possible to arrive at a global view of a complete antibody repertoire. In particular, B cell repertoires have been regarded as a black box because of their astronomical number of antibody clones. However, next-generation sequencing technologies are enabling breakthroughs to increase our understanding of the B cell repertoire. In this report, we describe a simple and efficient method to visualize and analyze whole individual mouse and human antibody repertoires. From the immune organs, representatively from spleen in mice and peripheral blood mononuclear cells in humans, total RNA was prepared, reverse transcribed, and amplified using the 5&#39;-RACE method. Using a universal forward primer and antisense primers for the antibody class-specific constant domains, antibody mRNAs were uniformly amplified in proportions reflecting their frequencies in the antibody populations. The amplicons were sequenced by next-generation sequencing (NGS), yielding more than 105 antibody sequences per immunological sample. We describe the protocols for antibody sequence analyses including V(D)J-gene-segment annotation, a bird&#39;s-eye view of the antibody repertoire, and our computational methods.

Here, we describe protocols for the analysis and visualization of the structure and constitution of whole antibody repertoires. This involves the acquisition of vast sequences of antibody RNA using next-generation sequencing.

마우스와 차세대 시퀀싱에 의해 인간의 항 체 레파토리의 식별

The immense adaptability of antigen recognition by antibodies is the basis of the acquired immune system. Despite our understanding of the molecular ...