VECT - HORUS에 대한 금융 지원은 드퐁 고유 Interministériel (FUI / MEDUL 프로젝트)하고 VECT - HORUS과 직원은 국립 드 라 공들인 (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, ADHOC 및 PREVENTAD 공동 프로젝트)에서 UMR7259 실험실에서 인정 . UMR7259 연구소는 CNRS에서와 엑스 - 마르세유 대학이 재정 지원을 인정합니다.

쥐 성상 1. 생산 각 준비는 섹스 중 하나의 10 신생아의 Wistar 쥐를 사용하십시오. <ol><li> 가위로 머리를 절단하고 층류 후드에서 건조 페트리 접시에 즉시 전송하여 쥐를 희생. 소뇌없이 두개골에서 뇌를 제거하고 차가운 해부 버퍼를 포함하는 페트리 접시에 즉시 전송 : HBSS 1 % 소 혈청 알부민 (독소 BSA의 낮은 수준), 100 ㎍ / ㎖의 페니실린 100 단위 / ml의 스트렙토 마이신과 보충. </li><li> 2 대뇌 반구를 분리하고 얼음에 해부 버퍼 깨끗한 세균 배양 용 접시에 그들을 전송, 절반의 머리를 잘라. 시신경을 잘라 실체 현미경을 이용하여 수막을 제거합니다. </li><li> 차가운 해부 버퍼 50 ㎖에 광범위하게 대뇌 피질의 조각을 씻으십시오. </li><li> 15 ML 팔콘 튜브에 3 뇌에서 대뇌 피질의 조각을 넣고 피펫 팅에 의해 쿠데타 아래 해리EDTA 5 분 0.02 %를 37 ° C에서 - 르 0.05 % 트립신 6 ㎖에 파란색 팁이 장착 된 10 ㎖ 일회용 피펫 회 </li><li> 24 10 % FBS와 보충 DMEM의 ML 다음과 같은 항생제, 페니실린 100 단위 / ml의 스트렙토 마이신 100 ㎍ / ㎖, 아교 세포 미디어 (GCM)라는 이름의 미디어, RT에서 5 분 300 XG에 원심 분리기를 추가합니다. FBS의 배치는 성상 세포 cutures의 성장과 생존을위한 선택과 검증되었다. </li><li> 75cm 2 T-플라스크 (T75)에 10 ㎖의 GCM 플레이트에서 해리 세포를 포함하는 펠렛을 Resuspend. 세포의 파편과 DNA를 제거하려면 다음 하루 매체를 변경합니다. 일주일에 두 번 배양액을 교체합니다. </li><li> 확산 후 1 주일 후, 부드럽게 GCM에서 37 ° C에서 24 시간 동안 60 rpm에서 진탕와 glial 세포를 흔들. T75는 37 ° C 습한 분위기에서 5 % CO 95분의 2 % 년 공기 인큐베이터에 배치 할 수없는 경우, 5 mM의 HEPES와 미디어를 보충합니다. R로 두 번 세포를 씻으십시오비 점착성 미세 아교 세포를 emove. </li><li> 3 주 파종 후, 칼슘, 마그네슘하지 않고 DPBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 따뜻한 트립신 0.05 %-EDTA 0.02 %의 3 mL를 넣고 37 ° C에서 배양 및 세포 층 (일반적으로 5 분) 분산 될 때까지 기다립니다. , GCM 10 ㎖를 추가하여 트립신의 활동을 억제 8 분 120 XG에 15 ML 팔콘 튜브와 원심 분리기에 세포 현탁액을 전송합니다. </li><li> 90 % FBS의 성상 세포 펠렛을 재현 탁 - 10 % DMSO, 액체 질소 (2 × 10 6 cryovial 당 세포) 및 저장 cryovials로 전송할 수 있습니다. </li></ol> 쥐 뇌 미세 혈관의 2. 격리 우리의 실험 절차는 마르세유의 의료 학부의 윤리위원회의 승인을 국가와 유럽 규정 (EU 지침 번호 6백9분의 86)을 준수합니다. 모든 노력이 동물의 고통을 최소화하고 사용 된 동물의 수를 줄이기 위해 만들어졌다. <ol><li> 각 준비를위한 하나의 experimente에 대한R, 3 오주 이전의 Wistar 쥐를 사용합니다. </li><li> 첫 번째 주 월요일, 모두 무균 배양 물에 1 ㎍ / cm 2 (T75 당 10 ㎖)에, 콜라겐 유형 IV 및 피브로넥틴으로 코팅하여 2 T75 플라스크를 준비합니다. 미세 혈관 파종 할 때까지 37 ° C에 부착 할 수 있습니다. </li><li> 첫 번째 주 수요일 아침, 졸음을 유발하는 CO 2의 증가 흐름에 따라 쥐를 안락사, 자세와 호흡 중단의 손실은 다음 자궁 경부 전위 하였다. 70 % 에탄올로 스프레이 헤드. 가위로 머리를 잘라 층류 후드에서 건조 페트리 접시에 그들을 전송합니다. </li><li> 얼음에 냉각 차가운 해부 버퍼로 가득 페트리 접시에 그들을 전송 한 후, 소뇌 및 시신경없이 두개골에서 뇌를 제거 (HBSS는 1 % BSA, 페니실린 100 단위 / ml의 스트렙토 마이신 100 ㎍ / ㎖로 보충) . </li><li> 용에서 2 대뇌 반구와 별도의 중뇌를 분리하는 반 머리를 잘라ebrain. 해부 버퍼 얼음에 깨끗한 페트리 접시에 forebrains을 전송합니다. </li><li> 주의 깊게 N ° 5 곡선 집게와 실체 현미경 forebrains에서 수막을 제거하는 차가운 해부 버퍼를 새로운 배양 접시에서 반구의 정도 소요. 그런 다음, 수초의 이불을 제거하고 껍질의 쉘을 얻을 수있는 뇌의 내부를 청소합니다. 이 단계는 조직의 보존 및 세포 생존을위한 2 개 이상의 시간이 걸릴 수 없습니다. </li><li> 다른 간극의 2 방앗 공이 각각 10 상하 스트로크, 20 μm의 다음 71 μm의에 의해 균질 다운스 7 ㎖의 차가운 해부 버퍼 6 ㎖에 3 두뇌의 피질을 떼어 놓다. </li><li> RT에서 5 분 1,000 XG에 50 ML 팔콘 튜브와 원심 분리기 1 ㎖에 1 피질의 등가를 얻기 위해 서스펜션을 나눈다. 상층 액을 버린다. </li><li> 콜라게나 제 / 디스 파제의 혼합 (60 ㎍ / ㎖의 정보 R을 포함하는 효소 용액 1 ㎖로 한 외피로부터 현탁액 다이제스트11; 0.3 U / ㎖), DNA 분해 효소 타입 I (35 ㎍ / ㎖의 - 20 K 단위 / ㎖) 및 37 ℃에서 30 분 동안 진탕에서 겐타 마이신 (50 ㎍ / ㎖) </li><li> 1 ㎖의 10 25 % BSA / HBSS 1X ㎖의 실온에서 15 분 동안 3,600 XG에 따라 밀도 원심 분리하여 별도의와 1 피질에서 소화 섞는다. 조심스럽게 깨끗한 50 ML 팔콘 튜브에 위 디스크 (myelin의 뇌 실질 조직)과 뜨는을 전송하고 원심 분리를 반복합니다. 4 ℃에서 뇌 미세 혈관을 포함하는 결과 펠렛을 유지 </li><li> 조심스럽게 상단 디스크와 상층 액을 버린다. 차가운 HBSS 1X 1 ㎖와 뇌의 미세 혈관을 포함하는 두 결과 펠렛을 재현 탁하고 깨끗한 50 ML 팔콘 튜브에 전송할 수 있습니다. </li><li> 5 분 1,000 XG에 20 차가운 HBSS 1X ㎖의 원심 분리기를 첨가하여 미세 혈관을 씻으십시오. 상층 액을 버린다. </li><li> 또한 쉬에서 37 ° C에서 1 시간 동안 단계 2.9과 동일한 효소 용액 1 ㎖를 1 피질에서 미세 혈관을 소화AKER. </li><li> 그런 다음, 하나의 튜브에 3 피질의 각에서 소화 미세 혈관을 혼합하고 추가 튜브 당 1과 2 분의 1 (1.5) 피질의 동등한에서 추출 된 미세 혈관을 얻기 위해 두 개의 50 ㎖ 팔콘 튜브로 구분합니다. RT에서 5 분 1,000 XG에서 차가운 해부 버퍼와 원심 분리기 30 ML을 추가합니다. </li><li> 20 % 소 혈소판별로 혈장 유래 혈청, 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF,이 NG / ㎖), 헤파린 (100 ㎍ / ㎖), 겐타 마이신 (50 ㎍ / ml)로 보충 된 DMEM/F12 10ml에 미세 혈관 펠렛을 재현 탁 와 HEPES 내피 세포 미디어 (ECM)라는 이름의 (2.5 mM)을, 4 ㎍ / ml로 마이신과 보충. </li><li> , 인큐베이터에서 2 코팅 T75 플라스크을 코팅의 과잉을 대기음 한 T75 플라스크 (T75 플라스크 1.5 피질에서 추출 된 미세 혈관)의 각 관에서 미​​세 혈관을 접시. </li></ol> RBEC Primocultures 3. 정제 및 대량 살상 무기 확산 <ol><li> 정화 : 수요일, 금요일에, purom 추가ycin 배양 배지 4 ㎍ / ml로. 목요일에 매체를 변경합니다. 금요일에, 월요일까지 2 ㎍ / ml로 세포를 씻어 퓨로 마이신을 추가합니다. </li><li> 대량 살상 무기 확산 : 두 번째 주 월요일에, 세포를 세척하고 문화가 두 번째 주 수요일에 90 %의 합류에 도달 할 때까지 배양 배지에 인슐린, 트랜스페린과 셀렌 산 나트륨 보충을 추가합니다. </li></ol> . 4 차별화 : 체외 BBB 모델 설정 <ol><li> 두 번째 주 월요일 (상단 구획 믹스 500 μL 모두 무균 배양 물에 0.5μg/cm 2에서 콜라겐 유형 IV 및 피브로넥틴의 혼합 코팅 필터 (폴리에틸렌, 12 우물, 기공 크기 1.0 μm의) 준비 하부 격실에있는 무균 배양 물 1.5 ㎖). RBEC 파종 할 때까지 37 ° C에 부착 할 수 있습니다. </li><li> 두 번째 주 월요일 5 일 공동 문화의 설립 전에, 37 ° C와 전송에 cryovials의 성상 세포를 해동10 ㎖의 GCM과 15 ML 팔콘. 실온에서 13 분 동안 120 XG에서 현탁액을 원심 분리기. </li><li> 12 - 웰 플레이트에 cm 2 당 30 × 10 3 세포의 밀도로 GCM과 판의 성상 세포 펠렛을 Resuspend. </li><li> 두 번째 주 수요일, 단지 트립신 RBEC의 분리하기 전에, DMEM/F12 배지로 두 번 사전 코팅 필터를 세척한다. 아래 칸에 1.5 ㎖의 상부 구획에 0.5 ㎖ : ECM과 챔버를 미리 입력합니다. </li><li> 두 번째 주 수요일, 칼슘과 마그네슘하지 않고 DPBS로 두 번 RBEC 씻는다. 정확히 30 초 동안 T75 플라스크 당 37 ° C에서 EDTA 0.02 % 용액 - 따뜻한 트립신의 4 ml의 0.05 %를 추가합니다. 이어서 트립신 용액 3.5 ㎖를 제거하고 현미경으로 관찰한다. 세포층은 매트릭스에서 분리 모든 셀이 플로팅 될 때까지 온화 T75 플라스크의 가장자리를 눌러이를 돕기 시작하면. </li><li> T75 플라스크 당 ECM의 10 ML을 추가하고 15 ML 팔콘 튜브에 전송할 수 있습니다. 아주 부드럽게 세포를 해리노란색 팁 탑재 10 ㎖ 피펫으로 다운 4 회 피펫 팅에 의해 현탁 (용액 중의 기포의 생성을 방지). 현탁액에있는 세포 (약 3 × 10 6 cells/T75)를 즉각 세고 높은 밀도 (160 × 10 3 셀 / 필터, 따라서 약 18 filters/T75) (그림 8에 미리 코팅 및 프리 필드 필터에 접시 ). 다음 날 (목요일), 세포 파편을 제거하기 위해 상부 구획의 두 배 매체를 변경합니다. </li><li> 두 번째 주 목요일, 공동 문화의 설립 전날, 기초 구획에서 1 / 3 에어컨 매체로 보충 할 수있는 차별화 매체의 1.5 ML (500 nm에서 하이드로 코르티손과 ECM)에 의해 성상 세포 배양 배지를 교체 (내피 세포와 성상 세포 사이의 접촉의 3 일) 공동 문화 이전의. </li><li> 두 번째 주 금요일은 차별화의 날 0으로 정의된다; 필터 콘타에서 배양 배지를 교체차별화 미디어 RBEC ining. 성상 세포를 포함하는 우물에 RBEC 필터를 전송합니다. 이러한 조건에서, 체외 모델은 차별화하고 3 일 이내에 접합 관련 단백질을 표현한다. </li><li> 모델은 세 번째 주 월요일과 수요일 사이에 3 일 이상 동안 자신의 최적의 분화를 유지합니다. </li></ol>

Michel Khrestchatisky is director of the UMR7259 laboratory, co-founder and scientific counsel of VECT-HORUS biotechnology company.

우리는 RBEC의 정화와 문화를 다음과 추가 특성 BBB 특성을 가진 생체 BBB 모델을 생성하는 기본 쥐의 성상 세포와 공동 배양의 설정, 뇌의 미세 혈관의 분리 및 도금 주간 재현 프로토콜의 구현을 설명합니다. 성공적으로 체외 BBB 문화에서 표준화 수립하는 프로세스의 여러 순차적 단계에서 최적의 조건을 필요로한다. 모델은 (a) 시험 관내 BBB 모델 &quot;성배&quot;남아 있고, (b) 및 유출 RMT 메커니즘에 대한 유효성 세포층 낮은 투과성을 얻을 수 있도록 최적화되었다. 생산, 정제 및 RBEC의 대량 살상 무기 확산 RBEC 재배의 가장 큰 문제는 서로 다른 문화 간의 재현성을 달성하는 것입니다. 프로토콜의 표준화가 표시 높은 품질 도구가 필요합니다섹션 고품질 시약 및 시약 만료일 대하여. 실험은 피질 표면에서 수막 및 대형 선박의 신속한 제거를 위해 입체 현미경 미세 해부에 숙련 될 필요가있다. 뇌가 절연 및 기계적 해리되면, 주요 과제 중 하나는 갓 격리 뇌 미세 혈관의 최적 소화 효소이다. 사용되는 효소의 종류와 품질이 중요하다. 일괄 처리 사이의 낮은 변동성과 높은 농도의 콜라게나 제 I 형 및 II와 디스 파제의 혼합 사용 하였다. 또 다른 중요한 효소 소화 기간과 소화 효소의 농도 / 티슈 중량 / 부피 사이의 비율이다. 뇌 미세 혈관 생산 최고의 수율은 30 분 ~ 1 시간에 각각 두 digestions 동안 60 ㎍ / ml로 혼합 디스 파제 / 콜라게나 제 1 ㎖에 1부터 뇌 피질의 등가 얻었다. 또 다른 중요한 세포 오염의 제거이다S (성상 세포, 주로 혈관 주위 세포). 이들 세포는 내피 세포보다 더 높은 속도로 증식 및 양호한 세포층 제한성으로 균질 세포 단층의 설립을 방지 후자 타이트 접속점을 설정하지 않는다. 비 - 내피 세포가 제거되는 동안 뇌 내피 세포는 미세 혈관에있는 다른 세포 유형에 비해 유출 펌프의 훨씬 높은 수준, 특히 P-GP를 표현하는 것을 고려하여, 그들은 더 P-GP 리간드 약물 달리 독성 농도를 용인. 처음 두 일 4 ㎍ / ml로 마이신 치료가 좋은 내피 세포의 순도를 얻기 위해 2 ㎍ / ㎖의 두 일 이상으로 이어졌습니다. 이 선택은 또한 세정맥, 전 모세관 동맥 이상 미세 혈관에서 그 대 모세 혈관 내피 세포를 선호하고, 엄격한 단일 층으로 이어질 수 있습니다. 또, 불량 혈장 유래 혈청의 사용은 내피 세포 47,48의 순수 배양을 얻는 것이 필수적이다. 플라즈마 데르ived 혈청 평활근 세포에 대해, 따라서 혈관 주위 세포를 들어, 섬유 아세포를위한 분열 촉진 혈소판 - 유래 성장 인자 (PDGF)를, 결여된다. 우리는 쥐의 꼬리에서 전통적으로 권장 콜라겐 I 형에 비해 확산 수익률의 2 배 증가, 생쥐와 인간 피브로넥틴은 상당한 이점을 얻을 수에서 콜라겐 유형 IV의 혼합 플라스틱 및 필터의 치료를 관찰했다. 세포 증식에 중요한 단서가 같은 인테그린 및 성장 인자 (bFGF를) 활성화 49과 세포 외 기질 (extracellular matrix)에 의해 제공된다. 버퍼 농도와 배양액의 pH는 세포층의 견고 (50)에 긍정적 인 영향을 설명하고 우리는 5 ㎜로 HEPES 버퍼의 추가와 문화 사이의 더 나은 재현성을 관찰했다. 삽입 필터에 공동 문화 구축 : RBEC의 분화 뇌 혈관 내피 세포는 ㄴ하면EEN은 정제 6 일 동안 증식 한, 그들은 필터에 도금 될 수있다. 고밀도 셀 도금은 완벽한 단일 층을 얻을하는 것이 중요합니다. 12 웰 플레이트 필터 당 160x10 3 세포의 파종 밀도는 파종 후 합류 단층 24 시간을 얻기 위해 필요 충분했다. 그러나, 자신의 환경으로부터 기본 뇌 모세 혈관 내피 세포의 분리는이 일차 전지 및 특히 뇌 모세 혈관 내피 세포를 강하게 그들의 환경 규제와 유도 요소에 의해 생성되는 것으로 알려진 바와 BBB 시험 관내 모델을 건설 역설 다른 주변 세포 유형. 뇌 모세 혈관 내피 세포는 단독으로 신속하게 해제 차별화를 배양하고 일부 특정 뇌의 혈관 내피 세포 마커를 풀어. 따라서, 기본 내피 세포는 낮은 통로 (P1)에서 사용되어야하고 다시 연결, 적어도 부분적으로, 성상 세포 47,51에 의해 조절 성상 세포 또는 매체와 공동 배양하여 자신의 환경. 이 보유뇌 혈관 내피 세포와 성상 세포와 같은 성상 세포의 분화에 대한 사실은 양방향 유도에 참여하고 있습니다. 성상 세포와 RBEC을 배양하는 것은 interendothelial TJ 52,23 강한 유도되었다. 다시 유도의 분자 메커니즘은 크게 알려지지 않은 남아 있고, 연구는 최적의 내피 세포 분화 (53, 54)을 촉진 할 수 성상 세포에 의해 분비되는 특정 변조 요소를 식별하는 여러 실험실에서 진행되고있다. 백혈병 억제 인자 (LIF) 등의 뇌 혈관 내피 세포에 의해 분비 요인 성상 세포의 분화 (55, 56)을 유도하는 것으로 나타났다. 공동 문화 구축하기 전에, 성상 세포는 글루코 코르티코이드 수용체 작용제 하이드로 코티손을 포함하는 차별화 매체에 노출 및 공동 문화 매체를 가동했다. 하이드로 코티손은 뇌 내피 세포의 기밀성을 향상시키기 위해 공지되어 있고, 특히 57 래트 및 마우스 58,59 내피 세포로부터 BBB 모델에서 사용된다. 에어컨 메디음은 3 일 후 내피 세포 / 성상 세포 공동 배양 시스템의 하부 구획에서 수집하고 나중에 사용하기 위해 냉동. 공동 문화 에어컨 매체의 사용은 2 일 이상 최적의 세포층의 투과성과 문화 사이도 향상 재현성 3 일 내피 세포 분화의 시간을 감소시켰다. 전반적으로, 우리가 설명하는 프로토콜은 0.26 ± 0.11 × 10 -3 cm 가장 기본 셀 기반 BBB 모델 22과 유사 / 분, 300 옴을 통해 재현 봉사자 · cm 2, 평균 세포층의 투과성 계수 PE (LY)를 산출 12. 우리는 미세 혈관 효소 소화의 제안 변조하여 본 논문에서 설명하는 프로토콜은 쥐의 척수 (60)와 쥐의 뇌에서 내피 세포 확장 할 수 있습니다. 분자 및 기능적 특성 게다가TJ 유도로, 성상 세포는 뇌의 내피 세포 (61) P-GP로 유출 트랜스 포터의 발현에 기여한다. 우리는 실제로 BBB 모델의 유출 운송업자 P-GP의 발현을 표시하고 우리는 생화학 적 방법을 사용하여 P-GP 유출 펌프 국산화의 극성을 설명하고, P-GP 활동의 기능 분석을 사용하여. GLT-1의 발현은 미세 혈관의 기저 막 분획에서 검출 되었으나 배양 RBEC 검출되지 않았다. 우리는 GLT-1 아래에있는 생체 조건과 웨스턴 블롯 분석에 의한 결과 불검출에 비해 우리의 RBEC 문화에 규정 된 가설. 과도한 글루타메이트는 신경 독성과 생체 내에서, GLT-1은 혀끝의 구획 (혈액 순환)에 기초 함 (실질)에서 글루타메이트 유출에 대한 책임이 있습니다. 성상 세포 배양에서는 GLT-1의 발현은 매우 낮게 유지되고 매체 62, 63에 글루타메이트를 첨가함으로써 유도된다. 우리는 또한 믿어IRM 같은 LRP1, LDLR 및 TFR로 정점 막에 유입 운송업자의 표현. TFR과 LDLR의 기능은 이전에 체외 BBB 모델 64 소와 같이 단일 층의 abluminal 측에 내강에서 TF-를 Cy3와 DiLDL의 실험을 바인딩 및 전송 시연했다. 흥미롭게는 성상 세포에서 그 지질 요구 (65, 66)는 상기 체외 포함한 교세포와 뇌 내피 세포 간의 생리적 누화를 확인한 뇌 모세 혈관 내피 세포에 LDLR의 발현을 증가 보여왔다. 우리는 형광 염료로 전송을 예시하기로 선택한 예 를 Cy3와 DII는 spectrofluorimetric 분석은 대부분의 실험실에서 사용할 수 있으며, 시험 관내 BBB 모델에서 유효성을 검사하는 데 유용 할 수 있다는 생각으로. 그러나, 형광의 정량화는 방사능보다 훨씬 덜 민감하고 중요한 데이터를 얻는 실험을 수의 증가를 요구한다.이상적은 Tf 및 LDL은 바인딩 / 흡수 및 전송 실험에 보통 (요오드 125) 방사성 동위 원소이다. 우리는 또한 제안 된 프로토콜을 얻은 차별화 된 내피 세포의 단층이 CCL2 해제하고 BBB 개방에 의해 밝혀로, TNF-α에 의해 유도 된 염증 반응을 보여준다. CCL2는 (MCP-1)와 그 수용체 CCR2는 다중 경화증, 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE) 67, CNS 외상 (68)와 신경 염증성 조건 69, 70에서 CNS에 백혈구 이동의 매개체로 알려져 있습니다와 같은 중추 신경계 병변에 참여하고 있습니다. BBB 개방은 CCL2 농도가 위 (꼭대기)와 하부 (기초) 구획 둘 사이의 평형을 할 수 있기 때문에 테스트 프로토콜로, 우리는 CCL2의 편광 분비에 결론을 내릴 수 없습니다. 결과적으로, 우리는 분명히 24 시간 (그림 5A)의 정점 구획에 RBEC에 의해 생성 CCL2의 양을 과소 평가하는 경향이있다. 일반 개요 및 체외 모델에서 BBB의 제한 : 나는 N 생체 대 생체 외 및 설치류 인간의 비교 대 체외에서 BBB 통로에 효과가 입증 많은 유망 CNS 약물은 종종 인간 이외의 종에서 분리 된 세포를 기반으로 생체 BBB 모델에 의한 예측의 부족으로 임상 시험에 실패했습니다. 이 단백질 네트워크, 신호 전달, 수송 및 수용체의 기계적인 측면을 공부에 관해서는 우리가 아는 한, 체외 BBB 모델은 아마 예측이다. 체외에서 공부하는 모든 장치, 경로 또는 대상은 같은 동물의 종으로 보완 환경 단서 (다른 세포 유형, 화학 물질, 단백질)에 의해 조절에 대한 특징과 현장 연구에 결합 할 수있다및 제한 사항 및주의, 인간으로부터 격리 미세 혈관 내피 세포, 가능한 아래 유발합니다. 체외에서 BBB 모델은 몸의 규제에서 분리 된 자동 시스템으로 볼 수있다,하지만 여전히 중요한 생체 내 특성과 환경 단서에 의해 규제 가능성을 부여. 내피 세포 단일 층은 신경 교세포 혈관 장치 (NGVU)의 중요한 구성 성분의 수 부족과 혈액 및 신체 조절 분리되어 있기 때문에 더는 &quot;이상적인&quot;체외 BBB 모델은 아직 71,72,73를 제안하지 않았습니다. 혈관 주위 세포 74,16 또는 17,18 뉴런 또는 플라스틱 코팅 또는 내피하여 가장 일반적이고 &quot;쉬운 제&quot;체외 BBB 모델에서 세포 성장을 위해 사용 배지 및 혈청 사용 외 기질의 서로 다른 성분의 부족 성상 세포로 분화 된 세포가 단백질 발현을 조절 제가있다n은 생체 내 상황 75과 비교. 이러한 모델은 생체 내에서 표시 많은 수송을 표현하지만, 모든 수 있습니다. 일부의 경우, 전송 매개 변수는 제 고립 미세 혈관 (생체 내 상황에 가장 가까운)에서 검증 한 후, 세포 배양 시스템 76,61 공부. 분자 생물학 연구를 허용 한 같은 종에서 고립 된 미세 혈관과 낮은 통로 내피 세포 배양에있는 유전자와 단백질 발현의 특성, 그리고 다른 종 사이에, 가장 자주 설치류 (쥐 및 쥐)로 또는에서 소와 돼지의 작은 동물에서 인간 77,78,75,15 비교. 생체 내 및 생체 외 뇌 미세 혈관 내피 세포 사이의 Transcriptomic 비교 차별적 표현과 자주 크게 체외에서 하향 조절 된 다수의 유전자 사본을 보여 주었다. 이러한 TFR 및 홍보 등의 유입 수송을 인코딩 성적 증명서소포 인신 매매에 연루 oteins는 주로 세포 내 이입과 기공을 갖는 전송의 일반적인 감소를 제안하고, 배양 된 뇌 혈관 내피 세포에서 하향 조절된다. 순도 (퓨로 마이신 처리) 및 하이드로 치료의 관점에서 문화의 조작보다 &quot;생체와 같은&quot;유전자 발현 프로파일 (77)을 복원하는 데 도움이 될 수 있습니다. Transcriptomic 연구는 또한. 인간의 내피 세포와 성상 세포의 공동 문화를 포함하는 체외 BBB 모델 (15)를 설명 하였다 또한 체외 BBB 모델 75 설치류를 기반으로 인간의 약물 흡수에 대한 예측을 복잡 종 사이의 중요한 차이점을 공개했다. 관련 비록 그들이 사후 인간 조직에 규제 액세스를 필요로하고 이질성은 연령, 질병, 그리고 아마도 의료에 따라 인간의 뇌 내피 세포의 품질 / 속성있어, 이러한 모델은 정기적으로 구현하기가 더 어렵다 treatmen기증자의 t. 노력은 더 생리 해부학 및 생체 BBB의 기능적 특성을 재현 신규 체외 모델을 개발하기 위해 만들 수있다. 세 종류의 세포를 포함하는 공동의 문화는 매우 제한하고 정기적으로 구현하기 어려운 나타납니다. 현재까지 가장 복잡한 체외 BBB 모델은 성상 세포와 혈관과 같은 조직을 포함하고 혈액의 흐름 75,79,80,81,82을 모방 매체의 흐름을 포함하는 동적 체외 모델 (DIV-BBB)입니다 83,84,85. 대뇌 내피 세포가 흐름에 노출되는 경우, 생성 된 전단 응력은 세포 분열, 분화, 이동 및 아폽토시스 80 내피 세포 생리학에 관련된 다른 유전자의 발현을 조절하는 세포 표면에서 mechanotransducers를 활성화한다. 생체, 전단 응력 혈류에서 생성의 확립을 허용 세포 접촉에 유사 분열 정지를 책임진다혈관 (80)의 내피 세포 단일 층. 정상적인 인간 뇌 미세 혈관 내피 세포의 게놈 및 단백질 체학 분석 BBB 내피 생리학 (84)에서 전단 응력의 ​​영향을 보여 주었다. 전단 응력은 CYP450에 의해 매개 75,86, 산화 75 효소 및 세포의 생존, 내피 세포 접착의 높은 수준, 유출 펌프 유도 및 운송 75, 포도당 대사의 조절을 더 잘 편광에 대한 책임의 표현을 증가시켜 세포층의 투과성을 조절 occludin과 ZO-1 87,75,80 결과적으로 높은 티이 같은 세포 간 접합부 요소에 대한 코딩 유전자의 1,500 - 2,000 옴 · cm 2, 생체 내에서 알려진 가장 가까운는 79,80 매개 변수 생명 공학 및 제약 산업에서 약물 또는 높은 처리량 검사 (HTS) 및 동물 실험을 줄이기위한 노력의 일상적인 검사가 주도셋업 일상적 어려워 남아 대뇌 내피 세포의 일차 배양 보충에 사용되는 상이한 세포주의 개발. 대부분의 경우에, 대뇌 내피 세포의 일차 배양은 레트로 바이러스 벡터를 사용 88,89,75 플라스미드 DNA의 형질 감염 또는 감염에 의해 하나, 불멸화 유전자 (SV40 나 폴리오 마 바이러스 큰 T 항원 또는 아데노 바이러스 E1A)로 형질 도입 하였다. 뇌 유래의 여러 내피 세포 라인은 RBE4, GP8/3.9, GPNT, RBEC1, TR-BBBS 또는 rBCEC4 쥐 세포주 88,75, b.End3 마우스 세포주 90,75, PBMEC/C1에게로 개발되고있다 - 2 돼지 세포주 87,75 및 hCMEC/D3 인간 세포주 89,75. 다른 모델은 같은 Madin-다비 개 신장 (MDCK) 또는 Caco2 세포주 12,75 같은 비 대뇌 유래의 세포를 기반으로합니다. 다른 인간 대뇌 내피 세포주 중에서도 hCMEC/D3 널리 인용되었다D 2005 년 91, 92 년에 설립 된 이후 BBB의 모델로 개선되었다. 차 문화, 세포주 선물 한 장점과 단점이있다. 그들은 차 문화를보다 쉽게​​ 처리 할 수​​ 있습니다 확장 된 수명을 가지고, 잘 특징 및 대규모 실험 사이의 재현성을 할 수 있습니다. 그러나, 세포주, 조직 고유의 기능을 잃게 환경 규제를 잃고 생체 75, 89에있는 세포와는 다른 분자 표현형을 획득 할 수있다. 특히, 세포주 현재 감소 압박감, 낮은 봉사자 및 쇼 수송 프로파일 변화 75,89에서 생성 된 단일 층. 따라서 일차 전지에있는 동물 실험이나 연구는 종종 자신의 복잡성에도 불구하고 바람직하다.

중추 신경계 (CNS)을 치료하기 위해 개발 된 대부분의 약물은 질환 치료 관련 농도에서 뇌 실질에 도달 할 수 없습니다. BBB는 병원체로부터 혈장 조성물의 변동으로부터 뇌 신경 조직을 보호하고, 뇌 (1) 내로 및 밖으로 이온, 펩티드, 단백질 및 심지어 세포의 비특이적 자속을 제한함으로써 뇌 실질 조직의 항상성을 유지한다. BBB의 특성 등의 신경과 전문 클래스 뇌 미세 혈관 내피 세포와 신경 교세포 혈관 장치의 주변 요소 (NGVU) 사이의 친밀한 근접하고 크로스 토크 (cross-talk)에 의해 유도 및 유지, glial 세포 (정확하게 성상 세포 최종 피트), 및 혈관 주위 세포는 콜라겐 유형 IV, 피브로넥틴, 라미닌 및 프로테오글리칸 2,3의 주로 구성되어 기저막에 ensheathed. 모세관 수준에서 내피 세포의 32 %와 중요한 재생 - 혈관 주위 세포는 약 22를 커버내피 세포의 증식, 혈관 신생과 염증 과정의 조절에서 역할. 내피 세포는 모세 혈관의 내면을 덮는 연속 시트를 형성한다. 이들은 꼭대기 영역에 띠 형상 구조를 형성하고 그 편광 셀에 올릴 TJS 의해 상호 접속된다. 성상 세포는 BBB 속성을 조절하고 TGF-β, GDNF, bFGF에와 IL-6와 같은 중요한 규제 요소의 소스입니다. 불완전한 기능을 GFAP 결핍 성상 세포는 BBB 속성 4를 조절 할 수 없습니다. 뉴런은 직접 BBB의 형성에 구조적으로 참여뿐만 아니라, 단백질 발현 및 BBB 기능 5의 중요한 측면을 조절하지 않습니다. 상기 BBB의 구조, 생리 및 병리를 연구하기 위해, BBB의 시험 관내 모델 연구 도구로 개발되었다. 뇌 혈관 내피 세포 기반 체외 BBB 모델에서 구현하는 다양한 종에서 추출 된소 6,7에서 낮은 통로 차 문화, 돼지 8, 9, 10,11,12 쥐, 마우스 (13) 또한 인간의 14, 15에. 이 모델은 생체 BBB를 모방하는 것으로 알려져있다 특히 쥐 또는 쥐 및 / 또는 혈관 주위 세포 16,12에서 glial 세포 및 / 또는 신경 전구 세포 유래 성상 세포 (17) 및 / 또는 신경 (18)와 공동 배양 하였다. 그들은 시험관 / 생체 실험과 비교 및 / 또는 유전자 변형 모델을 19 일부터 생산 뇌 혈관 내피 세포의 연구에 수 있기 때문에 &quot;의 실험실&quot;모델은 주로 설치류에서 생산됩니다. 새로 체외 BBB 모델 개발도 전에 생체 내 시험 15,20,21,3,6,22,11,23 잠재적 CNS 약물 후보의 뇌 흡수를 예측할 수 있도록 설계되었습니다. 체외 BBB 모델은 일반적으로 비교하는 데 사용됩니다 CNS에 내가) 알려진 침투 또는 L과 :와 약물의 수송BBB없이 중앙 효과 걸쳐 오우 투과성, 및 ⅱ) 동일한 종의 동물 모델에서 측정 된 동일 약품의 겉보기 PE. 쉽게 BBB를 전달하는 약물은 대부분 친 유성이며, 지질 매개 자유 확산 (카페인, 카르 바 마제 핀 등)에 의해 뇌의 혈관 내피 세포의 세포막을 교차. 이러한 디곡신, 베라파밀 또는 사이클로스포린과 같은 부정적인 수송 약물은 적극적으로 P-GP와 같은 뇌 내피 유출 컨베이어에 의해 압출된다. 그러나 새로 개발 된 치료 분자의 대부분은 이러한 재조합 단백질, siRNA를 또는 단일 클론 항체 등 바이오 의약품이다. 특정 운송의 I)의 부재, 그리고 세포층의 통로를 겪고에서 고 분자량의 분자를 방지 내피 세포의 II) 단단히 포장 층 : 그들 대부분은 인해 BBB를 통과하지 않습니다. 이러한 제한으로, &quot;트로이 목마&quot;전략은 내가, BBB 알려진 수용체에 대해 벡터 (항체, 펩티드) 참여를 사용하여 구현 된N 수용체 등 트랜스페린 (TF) 수용체 (TFR), 인슐린 수용체 (IR), 또는 LDL 수용체 (LDLR) 관련 수용체 가족 (LDLR, LRP1을)의 구성원으로 전송 또는 transcytosis (RMT)를, 중재. 이러한 수용체는 생체 (24, 25)에 고립 된 뇌 모세 혈관에와 BBB에서 발견되었다. 이러한 수용체 전사 프로필, 특히 LDLR 가족의 사람들은, 분석 및 공동 배양 직접 뇌 (26)로부터 자신의 추출 후 성상 세포 또는 뇌의 모세 혈관에서 뇌 혈관 내피 세포와 뇌 혈관 내피 세포를 비교 하였다. 파트 리지 (24)는 인슐린 수용체와 인슐린 성장 인자 수용체에 대한 항체 27,28이어서, 트랜스페린 수용체 (TFR)에 대하여 OX-26 항체 필드를 열었다. 이러한 항체 기반의 벡터로, ArmaGen 기술은 BBB (29)를 통해, 단백질을 포함, 약물을 전달하기 위해 BBB 분자 트로이 목마 플랫폼 기술을 개발했다.문학은 LRP1 뇌 혈관 내피 세포에서 발현과 강력한 세포 내 이입 / 스 캐빈 저 수용체의 역할을 보여주는 데이터 풍부하다. 웨스턴 블롯 분석 LRP1가 뇌의 모세 혈관이 풍부한 분수와 쥐의 뇌 모세 혈관 내피 세포 (30)로 표현하는 것이 좋습니다. 같은 BBB (31)에 걸쳐 효율적인 마약 유입을 촉진 아프로 티닌에서 파생 된 펩타이드 벡터를 Angiochem 대상 LRP1 같은 회사. 그러나, LRP1은 활성 Aβ의 수송 및 뇌 실질 조직에서 혈액 32의 유출 / 통관에 참여하고있다. 이러한 데이터는 리간드에 따라 BBB에서 양방향 전송에 LRP1을 포함한다. biOasis는 VECT - HORUS가 LDLR (34)를 대상으로 펩타이드 벡터를 개발하는 동안 같은 BBB 33에서 리소좀 효소와 항체 등 바이오 의약품의 수송을위한 단백질 melanotransferrin를 사용하여 초월 기술을 개발하고 있습니다. 데이터는 LRP 및 LDLR는 비교를 전송하는데 사용될 수 있음이 시사된다같은 BBB 37에서 리소좀 효소 (35, 36) 또는 나노 입자 복합체로 erent 분자. 우리의 관심 분야는 벡터 분자와 중추 신경계 질환의 치료를위한 벡터화 된 약물 후보를 사용하여 CNS에 약물 전달합니다. 특히, BBB에 걸쳐 약물 전달은 신경 염증, 그 정도가 다를 수 있습니다 프로세스의 맥락에서 고려되어야하지만, 그 뇌염, 다발성 경화증, 알츠하이머 병 등의 신경 염증을 포함, 아마 CNS 병변 및 질환에 공통적 인 세포층 및 세포 횡단 수송이 병적 인 상태 38,39,40,41,42,43에서 증폭 할 수 있음을 고려 BBB 생리학과 투자율의 변화와 BBB의 염증과 잠재적으로 관련이있다. 예를 들어, TNF-α, 비틀기, 기타 사이토 카인은 염증을 조절하고, 체외 BBB 모델과 실험들은 일의 세포층의 속성을 변경할 수있는 것으로 나타났습니다전자 내피 세포 단일 층 38,39,40하고 TNF-α는 또한 LDL (41)의 세포 횡단 수송의 증가로 연결, 42, 락토페린 43 holotransferrin. 우리의 목표는 개발의 특성을했다 최적화 및 높은 재현성 쥐 동계 BBB 모델은 기본 뇌 혈관 내피 세포와 성상 세포의 공동 문화를 사용하여. 우리는 각각 뇌 혈관 내피 세포의 생산 및 성상 세포 제조를위한 5 주 된 신생아의 Wistar 쥐를 사용했다. 하나의 도전은 &quot;주간 재현성&quot;BBB 모델의 생산을 허용하는 프로토콜을 확립했다. 이 목적을 달성하기 위해 생산 프로토콜의 모든 단계는 첫 번째 주 수요일에 뇌의 미세 혈관의 생산에서 시작, 일주일의 고정 일에 실시 하였다. 해부는 지난 3 년 동안 거의 매주 실시 하였다. 또한 문화의 재현성을 향상시키기 위해 품질 보증 시스템이 설치되었다. 모든 reagenTS와 화학 물질 데이터베이스 (항목의 날짜, 주식, 유효 기간 등)에서 참조 하였다. 이 모델은 내피 세포의 조직과 순도 같은 기준의 숫자, 다음과 같은 특징으로하고, 봉사자, LY 침투성, 염증성 요원, TJ 단백질의 정성 및 정량 식, 같은 P-GP로 유출 수송의 기능 및 수용체에 대한 응답 이러한 TFR 또는 LDLR과 내피 세포 단일 층에 걸쳐 transcytosis에 참여.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="666">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:189px;">Product</td>
			<td style="width:149px;">Company</td>
			<td style="width:153px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments / expiration term</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:189px;">BSA fraction V low endotoxin</td>
			<td style="width:149px;">PAA</td>
			<td style="width:153px;">K45-011-500g</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15140-122</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:189px;">0,05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">25300-054</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">DMEM High Glucose</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">61965-026</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:189px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">10270-098</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">T75 flasks</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson Falcon</td>
			<td style="width:153px;">353135</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:189px;">HEPES buffer (1 M)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15630-056</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Collagene type IV mouse (10 x 1 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:153px;">356233</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Fibronectin humain plasma (5 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:153px;">356008</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Vannas Spring Scissors, straight (9 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">91500-09</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Scissors, straight (9 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">14568-09</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Forceps Dumont #5/45 (11 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11251-35</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Graefe Forceps, tip width 0,8 mm</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11050-10</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Graefe Forceps, curve tip width 0,8 mm</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11051-10</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Collagenases / Dispase mix (2 x 5 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:153px;">05 401 054 001</td>
			<td style="width:175px;">- 20 &#176;C / 3 months</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">DNase I (100 mg / 569 KU / mg)</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">DN25-100 mg</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Gentamicin (10 mg/mL)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15710-049</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">31331-028</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Bovine serum from platelet poor plasma (500 mL)</td>
			<td style="width:149px;">Clinisciences</td>
			<td style="width:153px;">BT-214-100</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:189px;">bFGF (10 &#181;g)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">13256-029</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H3149-100KU</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Puromycin</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">P8833-10 mg</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">ITSX</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">51500-056</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates</td>
			<td style="width:149px;">Millipore</td>
			<td style="width:153px;">PIRP15R48</td>
			<td style="width:175px;">Porosity: 1 &#181;m 
			Surface: 1,1 cm2</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H0888-1 g</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Mouse anti-CD31 / PECAM&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:189px;">Rabbit anti-Von Willebrand</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">AB7356</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Desmine</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">MAB3430</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Vimentine</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">08-0052 clone V9, (58 &#181;g/mL)&#160;</td>
			<td style="width:175px;">1/50 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Claudin-5</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">35-2500, (500 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Rabbit anti-ZO-1</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">61-7300 (250 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:189px;">Rabbit anti-Occludine&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">71-1500 (250 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:189px;">Alexa fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:175px;">1/800</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Lucifer yellow CH, dilithium salt</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">L0259</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">TNF-a Human</td>
			<td style="width:149px;">PeproTech</td>
			<td style="width:153px;">300-01A</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Rat MCP-1 ELISA Kit</td>
			<td style="width:149px;">PeproTech</td>
			<td style="width:153px;">900-K59</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Mouse anti-P-glycoprotein</td>
			<td style="width:149px;">Covance, Eurogentec</td>
			<td style="width:153px;">SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/400 - fixation PFA 4% 
			1/200 (western blot)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Rabbit anti-GLT-1</td>
			<td style="width:149px;">Abcam</td>
			<td style="width:153px;">ab41621</td>
			<td style="width:175px;">1/1000 (western blot)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Rhodamine 123</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">83702</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Verapamil hydrochloride</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">V4629</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Cyclosporine A</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">30024</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="122">
			<td height="122" style="height:123px;width:189px;">Monoclonal anti a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat</td>
			<td style="width:149px;">American Diagnostica</td>
			<td style="width:153px;">3501 (100 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/5 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Mouse anti-LDLR</td>
			<td style="width:149px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:153px;">AF2255 (200 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/50 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">Rat transferrin-Cy3</td>
			<td style="width:149px;">Gentaur</td>
			<td style="width:153px;">JOR160050</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">DiILDL</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">L-3482</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (bbb): a focus on bbb impermeability and receptor-mediated transport

혈액 뇌 장벽 (BBB)​​은 특히 혈액 및 신경 조직 사이의 분자 및 세포 광속을 조절한다. 우리의 목표는 내피 세포 단일 층에 걸쳐 transcytosis에 관련된 수용체를 연구하는 기본 쥐의 뇌 혈관 내피 세포 (RBEC)의 공동 문화와 성상 세포를 사용하여 BBB의 체외 모델의 높은 재현성 쥐 동계을 개발하고 특성화하는 것이 었습니다. 성상 세포는 트립신 소화 다음과 같은 기계적 박리에 의해 분리 된 이후 공동 문화 동결했다. RBEC 5 주 된 쥐의 피질에서 분리되었다. 두뇌는 수막과 흰색 물질의 청소, 기계적 소화 효소 다음 해리했다. 그 후, 조직 파쇄 액은 신경 조직에서 혈관 단편을 분리하기 위해 혈청 알부민에서 원심 분리 하였다. 용기의 조각은 세포 외 기질 (extracellular matrix)에서 무료로 내피 세포에 두 번째 효소 소화를 시행 하였다. 이러한 혈관 주위 세포로 남아있는 오염 세포는 f를했다urther 퓨로 마이신 - 함유 배지에서 미세 혈관 단편을 도금함으로써 제거. 그들은 그 우물의 바닥에 성장 성상 세포와 공동 배양 필터에 계대 배양 하였다. RBEC 꽉 접합 높은 수준의 표현 등 occludin 등 (TJ) 단백질, 셀 테두리의 일반적인 현지화와 claudin-5와 ZO-1. TJS의 압박감을 나타내는 뇌의 혈관 내피 세포 단층의 내피 전기 저항 (봉사자)는 300 옴 · 평균 cm 2에 도달했습니다. (LY) 노란색 루시퍼의 내피 세포의 투과성 계수 (PE)은 / 분 0.26 ± 0.11 × 10 -3 cm의 평균 고도의 재현했다. 단일 층으로 구성 뇌 혈관 내피 세포는 유출 수송의 P-당 단백질 (P-GP)를 표현 로다 민 123, P-GP에 대한 리간드의 편광 전송을 보였으며, 내피 세포 단일 층에 걸쳐 트랜스페린 -를 Cy3와 DiILDL의 특정 전송을 보여 주었다. 결론적으로, 우리는 시험관을 설정하기위한 프로토콜을 제공한다때문에 품질 보증 방법에 높은 재현성, 그리고 그 BBB 컨베이어 및 수용체에 대한 연구에 적합 BBB 모델.

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Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

본 연구의 목적은 쥐의 동계 내피 세포와 성상 세포의 공동 문화를 포함하는 생체 BBB 모델의 재현성을 확인하는 것이 었습니다. 내피 세포 단일 층은 높은 봉사자 낮은 LY 투과성을 발표했다. 특정 TJ 단백질의 발현은 염증과 운송 및 수용체의 기능에 기능적인 응답은 평가했다.

설정 - 업<em&gt; 체외</em쥐 뇌 혈관 벽의&gt; 모델 (BBB)​​ : BBB 불 침투성 및 수용체 매개 운송에 초점

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

setting-up-an-vitro-model-rat-blood-brain-barrier-bbb-focus-on-bbb

Research

JoVE Journal

Medicine

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

42.2K 조회수.  VECT-HORUS SAS.  본 연구의 목적은 쥐의 동계 내피 세포와 성상 세포의 공동 문화를 포함하는 생체 BBB 모델의 재현성을 확인하는 것이 었습니다. 내피 세포 단일 층은 높은 봉사자 낮은 LY 투과성을 발표했다. 특정 TJ 단백질의 발현은 염증과 운송 및 수용체의 기능에 기능적인 응답은 평가했다. 

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MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a significant obstacle to pharmaceutical treatments of brain disorders as it limits the passage of molecules from the vasculature into the brain tissue to molecules less than approximately 500 Da in size6. FUS induced BBB disruption (BBBD) is temporary and reversible4 and has an advantage over chemical means of inducing BBBD by being highly localized. FUS induced BBBD provides a means for investigating the effects of a wide range of therapeutic agents on the brain, which would not otherwise be deliverable to the tissue in sufficient concentration. While a wide range of ultrasound parameters have proven successful at disrupting the BBB2,5,7, there are several critical steps in the experimental procedure to ensure successful disruption with accurate targeting. This protocol outlines how to achieve MRI-guided FUS induced BBBD in a rat model, with a focus on the critical animal preparation and microbubble handling steps of the experiment.

Microbubble-mediated focused ultrasound disruption of the blood-brain barrier (BBB) is a promising technique for non-invasive targeted drug delivery in the brain1-3. This protocol outlines the experimental procedure for MRI-guided transcranial BBB disruption in a rat model.

쥐 모델에서 Transcranial 집중 초음파를 사용하여 혈액 - 뇌 장벽의 MRI를 유도 장애

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

연구

의학

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

혈액 - 뇌 장벽 장애의 쥐 모델 Neurovascular 치료학 타겟이 분명한 허용하려면

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying mechanisms involved in it are useful for treatment. There are both in vivo and in vitro methods available for this purpose. In vivo models can mimic actual head injury as it occurs during TBI. However, in vivo techniques may not be exploited for studies at the cell physiology level. Hence, in vitro methods are more advantageous for this purpose since they provide easier access to the cells and the extracellular environment for manipulation.
Our protocol presents an in vitro model of TBI using stretch injury in brain microvascular endothelial cells. It utilizes pressure applied to the cells cultured in flexible-bottomed wells. The pressure applied may easily be controlled and can produce injury that ranges from low to severe. The murine brain microvascular endothelial cells (cEND) generated in our laboratory is a well-suited model for the blood brain barrier (BBB) thus providing an advantage to other systems that employ a similar technique. In addition, due to the simplicity of the method, experimental set-ups are easily duplicated. Thus, this model can be used in studying the cellular and molecular mechanisms involved in TBI at the BBB.

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

In vitro traumatic brain injury models are being developed to reproduce in vivo brain deformation. Stretch-induced injury has been employed for astrocytes, neurons, glial cells, aortic, and brain endothelial cells. However, our system uses a blood brain barrier (BBB) model that possesses properties constituting a legitimate model of the BBB to establish an in vitro&#160;TBI model.

로 뇌 미세 혈관 내피 세포 (CEnd를)에 기지개<em&gt; 체외</em혈액 뇌 장벽의&gt; 외상성 뇌 손상 모델

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

같은 뇌 Microslices의 흥분 독성 자극<em&gt; 체외</em&gt; 스트로크의 모델

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

같은 산소 포도당 박탈과 재산 소화<em&gt; 체외</em&gt; 허혈 - 재관류 손상 모델 공부 뇌 혈관 장벽 부전

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

A Rat Carotid Balloon Injury Model to Test Anti-vascular Remodeling Therapeutics

The rat carotid balloon injury is a well-established surgical model that has been used to study arterial remodeling and vascular cell proliferation. It is also a valuable model system to test, and to evaluate therapeutics and drugs that negate maladaptive remodeling in the vessel. The injury, or barotrauma, in the vessel lumen caused by an inflated balloon via an inserted catheter induces subsequent neointimal growth, often leading to hyperplasia or thickening of the vessel wall that narrows, or obstructs the lumen. The method described here is sufficiently sensitive, and the results can be obtained in relatively short time (2 weeks after the surgery). The efficacy of the drug or therapeutic against the induced-remodeling can be evaluated either by the post-mortem pathological and histomorphological analysis, or by ultrasound sonography in live animals. In addition, this model system has also been used to determine the therapeutic window or the time course of the administered drug. These studies can leadto the development of a better administrative strategy and a better therapeutic outcome. The procedure described here provides a tool for translational studies that bring drug and therapeutic candidates from bench research to clinical applications.

The rat carotid balloon injury model described below allows researchers to evaluate drugs or therapeutics that negate injury-induced arterial hyperplasia. Detailed pre-surgical preparation, surgical procedure, and post-surgical cares of the animal are described.

생쥐 경동맥 풍선 손상 모델은 반대로 혈관 리모델링의 치료를 테스트하는

The rat carotid balloon injury is a well-established surgical model that has been used to study arterial remodeling and vascular cell proliferation. It is ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the brain for visual perception. Damage to RGCs and their axons leads to vision loss and/or blindness. Although the specific cause of glaucoma is unknown, the primary risk factor for the disease is an elevated intraocular pressure. Glaucoma-inducing procedures in animal models are a valuable tool to researchers studying the mechanism of RGC death. Such information can lead to the development of effective neuroprotective treatments that could aid in the prevention of vision loss. The protocol in this paper describes a method of inducing glaucoma - like conditions in an in vivo rat model where 50 &#181;l of 2 M hypertonic saline is injected into the episcleral venous plexus. Blanching of the vessels indicates successful injection. This procedure causes loss of RGCs to simulate glaucoma. One month following injection, animals are sacrificed and eyes are removed. Next, the cornea, lens, and vitreous are removed to make an eyecup. The retina is then peeled from the back of the eye and pinned onto sylgard dishes using cactus needles. At this point, neurons in the retina can be stained for analysis. Results from this lab show that approximately 25% of RGCs are lost within one month of the procedure when compared to internal controls. This procedure allows for quantitative analysis of retinal ganglion cell death in an in vivo rat glaucoma model.

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

녹내장 유도 절차<em&gt; 생체</em&gt; 쥐 모델 및 전체 마운트 망막 준비

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

혈액 뇌 장벽 메쉬와 유사한 혈관 형성 및 분열을 평가하기위한 In vitro 시험 법

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

생체 외에서 혈액-뇌 장벽 돼지 뇌 내 피 세포를 기반으로 하는 모델의 설립에 대 한 방법 개선

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and subsequent vision loss. The inner blood-retinal barrier (iBRB) is mainly composed of retinal vascular endothelium with low permeability under physiological conditions. This feature of low permeability is tightly regulated and maintained by low rates of paracellular transport between adjacent retinal microvascular endothelial cells, as well as transcellular transport (transcytosis) through them. The assessment of retinal transcellular barrier permeability may provide fundamental insights into iBRB integrity in health and disease. In this study, we describe an endothelial cell (EC) transcytosis assay, as an in vitro model for evaluating iBRB permeability, using human retinal microvascular endothelial cells (HRMECs). This assay assesses the ability of HRMECs to transport transferrin and horseradish peroxidase (HRP) in receptor- and caveolae-mediated transcellular transport processes, respectively. Fully confluent HRMECs cultured on porous membrane were incubated with fluorescent-tagged transferrin (clathrin-dependent transcytosis) or HRP (caveolae-mediated transcytosis) to measure the levels of transferrin or HRP transferred to the bottom chamber, indicative of transcytosis levels across the EC monolayer. Wnt signaling, a known pathway regulating iBRB, was modulated to demonstrate the caveolae-mediated HRP-based transcytosis assay method. The EC transcytosis assay described here may provide a useful tool for investigating the molecular regulators of EC permeability and iBRB integrity in vascular pathologies and for screening drug delivery systems.

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

This protocol illustrates an in vitro endothelial cell transcytosis assay as a model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability by measuring the ability of human retinal microvascular endothelial cells to transport horseradish peroxidase across cells in caveolae-mediated transcellular transport processes.

내피 세포 트랜스사이토시스 분석법(Endothelial Cell Transcytosis assay)은 내부 혈액-망막 장벽 투과성을 평가하기 위한 시험관 내 모델로서 분석합니다.

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...