이 작품은 NIH 보조금 R01 CA107469, R01 CA125577 및 CG KLEER, 미시간의 암 센터 지원 대학에 U01CA154224에 의해 지원되었다.

1. 재료의 준비 및 문화 미디어 <ol><li> 4 ° CO / N.에 (GFR) 리겔 감소 해동 성장 인자 </li><li> 37 ° C.에 필요한 세포주에 대한 완벽한 미디어를 따뜻하게 MCF10A-ATCC는 미디어를 지정; HME-햄 F-12 배지는 5 % 소 태아 혈청, 1 ㎍ / ㎖의 하이드로 코르티손, 5 ㎍ / ㎖의 인슐린, 10 ng의 / ㎖의 표피 성장 인자, 및 100 NG / ㎖ 콜레라 독소로 보충; 5 % FBS, 2 ㎍ / ㎖의 하이드로 코티손, 5 ㎍ / ml의 인슐린 보충 SUM149 햄의 F-12 미디어; 및 MDA-MB-231-10% FBS-DMEM </li><li> 얼음에 8 잘 챔버 슬라이드를 Precool. </li><li> 조직 문화 후드 및 용품을 준비합니다. </li></ol> 8 잘 회의소 슬라이드 2. 3 차원 문화 <ol><li> 코트 각 GFR 마트 리젤의 40 μL와 8 아니라 슬라이드의 잘. 슬라이드의 중앙에 리겔을 추가 한 다음 P200 피펫 팁을 사용하여 확산. 거품을 피하고으로 이어질 수있는 overspreading, 가능한 한 균일 확산을 시도메 니스 커스 (meniscus)를 형성. </li><li> 5 % CO 2에서 37 ° C에서 슬라이드를 품어. 리겔이 응고하는 동안, 세포를 Trypsinize 수집하고 4 분 동안 조직 문화 원심 분리기 150 XG에 스핀. </li><li> 세포를 계산하고 각각의 세포주의 완전한 미디어에 12,500 세포 / ml로 희석. 2 %에 GFR 마트 리겔을 추가하고 리겔 프리 코트 챔버 슬라이드의 각 웰에 400 μl를 추가합니다. </li><li> CO 2 배양기에서 슬라이드를 품어. 십오일 때까지 매 4 일째 신선한 전체 미디어 변경을 제공합니다. </li><li> GFR 마트 리겔에 세포 성장 동안 억제제의 연구는 3 일마다 억제제 보충 된 신선한 미디어 변화이어서 도금시 완전한 미디어 소분자 억제제를 추가 들어 : 약리학 억제제로 처리. </li><li> 정제 된 단백질과 치료 : <ol><li> 셀 플레이트 다음은 2.1-2.3 단계를 반복합니다. 문화가 혈청 starvati 다음 4 일 동안 성장 할 수 있도록 허용16 시간 동안에. </li><li> 5 일에, FBS는 혈청에 굶주린 세포에 용지를 보충 0.1 %에서 정제 된 단백질의 적절한 농도로 세포를 처리합니다. 이일 후 정제 된 단백질과 신선한 미디어 변화를 준다. </li><li> 10 일째에 완전한 HME 매체와 에어컨 미디어를 교체합니다. 문화가 다른 5 일 동안 성장 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 리겔에 성장 선포 구조의 면역 형광 염색 : <ol><li> 2 % 파라 포름 알데히드, 0.5 % 트리톤 X-100 및 1X PBS, pH 7.4의 100 mM의 글리신을 준비합니다. 0.1 % 소 혈청 알부민, 0.2 % 트리톤 X-100, 0.05 % 트윈 -20을 함유하는 1X PBS로 구성 면역 버퍼 (버퍼 IF)를 준비한다. </li><li> 주의 깊게 에어컨 미디어를 대기음하는 P200 피펫 팁을 사용합니다. </li><li> 20 분 동안 실온 (RT)에서 2 % 갓 준비 파라 포름 알데히드로 선포 구조를 수정. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 0.5 % 트리톤 X-100 세포를 투과 </li><li> 문화를 씻으의 세 100 mM의 글리신, 각각의 세척을위한 10 ~ 15 분 타임스. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 기본 블록 호출하면 버퍼의 10 % 염소 혈청과 세포를 차단합니다. </li><li> 20 ㎍ / ㎖의 염소 항 마우스 F (AB &#39;) 30 분 기본 블록 버퍼에있는 조각과 문화를 품다. 이 단계는 매트 리겔에서 면역 마우스 IgG의 종을 차단하는 것이 중요하다. </li><li> 두 번째 차단 솔루션 1 차 항체와 부화 4 ° C에서 (기본 블록 20 ㎍ / ㎖의 염소 항 마우스 F (ab &#39;) 2 단편) O / N </li><li> 15 분 부드러운 요동과 각 IF 버퍼로 3 회 씻는다. </li><li> 45 분 IF 버퍼에 형광 복합 이차 항체와 부화. </li><li> 10 분 동안 세척 배 부드러운 요동과 IF 버퍼 각. </li><li> 핵을 시각화하기 위해 DAPI를 포함하는 안티 - 페이드 시약과 슬라이드를 장착합니다. </li><li> 슬라이드는 실온에서 O / N을 건조하도록 허용합니다. </li><li> 이미지 수집 : 식민지 마일의 공 촛점 이미지 획득리겔의 상단에 성장 세포의 dsection. 자세한 내용은 Z의 적층하여 포상 구조의 전체 길이에 걸쳐 광 부분의 시리즈를 얻기. </li></ol></li></ol> 3. 면역 블롯 2 잘 회의소 슬라이드에서 3 차원 문화 <ol><li> 얼음이 잘 챔버 슬라이드를 Precool. 단계에 따라 2.1-2.4 리겔의 160 μL와 2 - 잘 챔버 슬라이드, 예를 들면 코트 시약을 확장 셀 / 리겔의 1.6 ml의 2 - 웰 슬라이드의 각 웰에 혼합을 추가합니다. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 상업적으로 이용 가능한 3D 배양 세포 수확 키트를 사용하여 리겔에서 선포 구조를 수확. </li><li> 배에서 4 ° C.에 precool하는 세포 세척 및 세포 수확 버퍼를 희석 리겔의 세척 및 쫓아 내기 얼음에 수행되어야한다. </li><li> 셀 세척 버퍼를 사용하여 3 배 선포 구조를 씻으십시오. </li><li> 세포 수확 BU를​​ 사용하여 15 ㎖의 원심 분리기 튜브로 선포 세포를 수집ffer 4 ℃에서 로커에 30 분 인큐베이션 1 ㎖ 피펫 잘 현탁액을 섞는다. 이 작은 조각의 리겔을 중단하고 세포 수확 버퍼에있는 세포의 대부분을 해제합니다. </li><li> 문화 원심 분리기 200 XG에서 세포 펠렛. P200 피펫 팁과 펠렛 세포에서 하이드로 겔의 떠있는 레이어를 제거합니다. </li><li> 키트 구비 SDS 샘플 버퍼 용 해물을 재현 탁. RIPA 용해 완충액을 사용할 수도있다. </li></ol> 악성 대 양성 유방 표현형의 4. 정량 <ol><li> 단계 2.1-2.4 다음 각 처리 세트에 대한 삼중의 세포를 성장. </li><li> 5X 또는 슬라이드 시프터 및 컴퓨터에 연결된 위상차 현미경을 이용하여 10 배의 해상도를 각 웰로부터 포상 구조의 위상차 이미지를 가라. 한 프레임에서 다른 프레임으로 슬라이드를 이동하고, 따라서 챔버 슬라이드의 전체를 잘 커버하여 이미지를 가져 가라. </li><li> 포상 구조의 전체 개수를 세어한 라운드 플랫 선포 세포와 multiacinar 구조 나 조직을 부족 우연히 성장 구조의 수와 그것에서 나오는 분기 프로세스와 수. </li><li> 한 라운드 플랫 선포 구조에 대 악성 구조의 비율 및 열 그래프로 플롯을 계산합니다. 학생의 T-테스트에서 중요성을 계산합니다. </li></ol>

<ol>
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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphologies+of+breast+cancer+cell+lines+in+three-dimensional+assays+correlate+with+their+profiles+of+gene+expression.">The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression.</a> Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).</li><li>Pal, A., Huang, W., Li, X., Toy, K. A., Nikolovska-Coleska, Z., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCN6+modulates+BMP+signaling+via+the+Smad-independent+TAK1/p38+pathway,+acting+to+suppress+metastasis+of+breast+cancer.">CCN6 modulates BMP signaling via the Smad-independent TAK1/p38 pathway, acting to suppress metastasis of breast cancer.</a> Cancer Res. 15, 4818-4828 (2012).</li><li>Pal, A., Huang, W., Toy, K. A., Kleer, C. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies.">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+co-culture+models+to+study+prostate+cancer+growth,+progression,+and+metastasis+to+bone.">Three-dimensional co-culture models to study prostate cancer growth, progression, and metastasis to bone.</a> Semin. Cancer Biol. 15, 353-364 (2005).</li><li>Vaughan, M. B., Ramirez, R. D., Wright, W. E., Minna, J. D., Shay, J. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+3D+microenvironment+on+phenotype,+gene+expression,+and+EGFR+inhibition+of+colorectal+cancer+cell+lines.">Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines.</a> PLoS One. 8, 1-11 (2013).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

우리는 여기에서 재구성 기저막에 유방 상피 세포의 세 가지 차원의 문화와 악성 대 양성 유방 표현형을 구별하는이 시스템의 유용성을 설명했다. 이 시스템은 또한 다른 선의 조직 배양에서 다른 세포 유형에 이용 될 수 있고, 성공적으로 12-14 몇 가지 이름을 배양 전립선 상피 기관지 상피 및 갑상선 상피 세포에 사용 된 것으로보고되었다. 3D 배양의 중요성은 생리 학적으로 관?...

재구성 기저막에 유방 상피 세포의 3 차원 배양 (3D)는 복잡한 표현형 정상 유방과 유방암 2,3의 관련 신호를 연구하는 중요한 모델 시스템입니다. 유방의 기능 단위는 꽈리에있는 나뭇 가지의 작은 관으로 구성 터미널 덕트 소엽 단위 (TDLU)입니다. 선포 세포는 기저막 (5)에 의해 둘러싸여있다 두 세포층, 상피 및 근 상피 세포로 구성된 매우 조직 구조이다. 일반 선포 세포의 가장 두드러진 특징은 휴대 편광, 기본 기저막에 부착 전문 세포 - 세포 연락처입니다. 이 복잡​​한 조직은 침략 암에 중단됩니다. 세포는 단층으로 재배되는 널리 사용되는 2 차원의 문화, 선포 세포의 형성을 허용하지 않습니다. 따라서, 단층 배양 상피 세포 간의 복잡한 관계를 캡처하는 시스템을 제공 부족정상 유방과 유방암에서의 규제 완화. 유방 세포의 기능 monotypic 상피 문화는 여러 실험실 2,3에서 개발되었다. 3D 배양 Engelbreth-홀름 - 스웜 마우스 육종 세포 유래 가용화 엑기스이며 시판되고 리겔에 유방암 세포의 성장을 포함한다. 콜라겐 같은 다른 3D 하층은 I도 사용된다. 유방 세포는 세포가 매트 리겔이에 매립 배양 3D 임베디드 분석법에 의해 3 차원으로 배양 할 수있다. 또한, 세포는 또한 리겔의 적은 양을 필요로하고, 위상 콘트라스트 이미지에 의해 콜로니 형성의 시간 경과 감시를 용이하게하고 현장 영상 2에 이상적입니다로 비용 효과적인 3D 오버레이 분석,라고, 최고 분석에 3D로 배양 될 수있다 -3. 베스트 분석에 3D는 선포 표현형 및 유전자 발현 프로파일 (7) 사이의 상호 관계를 정의하는 데 사용되었다. 3D 문화 effectiv 할 수 있습니다엘리 침윤 암에서 정상과 양성 세포를 구별하는 데 사용됩니다. 정상 및 양성 유방 세포가 침윤 암 세포가 루멘없이 청소와 다산과 우연히 성장하는 반면 성장이 리겔의 중심에있는 잘 정의 된 루멘 편파 구조를 체포 형성한다. E6/E7은 인간의 유방 상피 세포와 섬유 낭종 성 변화와 36 세 환자에서 분리 된 자발적 불후의 세포주가 성공적으로 3D 3.8에 양성 유방 표현형을 탈환하는 데 사용되었습니다 및 지낸입니다 MCF10A 세포주를, 불후의 여러 분자 8,9의 종양 및 종양 억제 기능을 연구하기위한 모델 시스템. 이러한 양성 세포는 렌티 바이러스 / 레트로 바이러스의 도입으로 그 유전자 (들)을 조작 할 수 있도록 설계 할 수있다. 관심의 유전자 (들)은 종양 억제 경우 그 유전자가 양성 세포의 발암 유전자 과발현 경우, shRNA를 매개 최저는 반면 악성 변화로 이어질 것악성 표현형을 표시해야합니다. 두 경우 모두 3D로 형성된 선포 구조는 악성 변화를 캡처 할 수 있습니다. 3D로 도금 양성 단일 세포는 구형 구조를 증식 원형 형성하기 시작합니다. 일 5-8 셀이 구형 집합체 마트 리겔과 접촉하는 세포의 주변 편광 층 및 마트 리겔과 접촉이없는 적은 편광 세포의 내측 질량으로 분화한다. 다음 10-15 일에서 내부 세포 사멸이 명확한 루멘을 형성하여 죽기 시작합니다. 악성 세포는 우연히 자신의 극성을 잃고 성장할 것입니다. 고도의 악성 세포는 일반적으로 구조를 분기 형성한다. 표현형의 이러한 차이는 시간 경과 위상 콘트라스트 이미지에 의해 현장에서 관련 분자 마커로 면역 염색에 의해 캡처 할 수 있습니다. 가장 일반적으로 사용되는 마커는 증식 마커 포스 포 히스톤 3 apoptot와 ​​조합하여, 알파 -6 - 인테그린, 기저 극성 마커 아르IC 마커는 카스파 제 3을 절단. 후자 꽈리의 중심 정상적인 양성 유방 세포의 기능에 루멘을 형성가 있는지를 결정하는 것이 중요하다. 다른 극성과 세포 - 세포 접촉 마커 GM130, 라미닌, ERM, E-cadherin의 (가) 있습니다. 교대 유방암 세포주 관심 유전자를 조작하기 위하여 설계 될 수있다. 체포 더 성장이 경우 복귀 양성 표현형으로 사용할 수 암 표현형을 구별 할 독출. 3D 문화는 신중 악성 변형 10-11에 관련된 신호 전달 경로를 묘사하는 데 사용할 수 있습니다. 사용하여 위의 읽기 아웃, 약물 억제제, 차단 항체 나 재조합 단백질을 언급하는 것은 악성 변화를 선도하는 분자 신호에 정확하게 할 수 있습니다. 여러 실험실에서 지속적인 노력으로는 RNA를 분리하고 또한 면역 블롯 및 면역에 해물을 준비하는 차원에서 세포를 추출 할 수noprecipitation. 이러한 전략은 프로토콜 단계적 상세한 방법에 설명되어 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="585">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Growth Factor Reduced matrigel</td>
			<td style="width:83px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:119px;">354230</td>
			<td style="width:167px;">Avoid repeat freeze thaw&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Lab-Tek glass hamber slides 8-well</td>
			<td style="width:83px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">177402</td>
			<td>Precool on ice&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Lab-Tek glass chamber slides 2- well&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">177380</td>
			<td>Precool on ice&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">goat anti mouse F(ab&#180;)2 fragment</td>
			<td style="width:83px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:119px;">115-006-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Normal goat serum</td>
			<td style="width:83px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:119px;">005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Fluorescent conjugated Alexa antibodies</td>
			<td style="width:83px;">Molecular probes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Please look at molecular probes website</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Prolong gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:83px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">3D Culture Cell Harvesting kit</td>
			<td style="width:83px;">Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">3448-020-k</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-Apha-6-integrin</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientifics&#160;</td>
			<td style="width:119px;">MAB1378</td>
			<td>1:00 dilution for IF</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-GM130</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">610822</td>
			<td>1:00 dilution for IF</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientifics&#160;</td>
			<td style="width:119px;">16-222</td>
			<td>1:100 dilution for IF</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175)</td>
			<td style="width:83px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">9661s</td>
			<td>1:50 dilution for IF</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-E-cadherin</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">610181</td>
			<td>1:200 dilution for IF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three dimensional cultures: a tool to study normal acinar architecture vs. malignant transformation of breast cells

침윤성 암은 전이에 인접 조직과 성향의 침입을 특징으로 악성 상피 종양의 그룹입니다. 암세포 및 그들의 미시 사이에서 신호의 상호 작용은 유방암의 성장 및 생물학적 행동 하나에 강력한 영향을 미친다. 그러나, 세포 외 기질 (extracellular matrix)에서이 신호의 대부분은 손실되거나 세포가 단층으로 두 가지 차원의 문화 (2D)에서 재배 할 때의 관련성은 understudied 아르됩니다. 최근, 재구성 기저막의 입체 (3D) 문화는 양성 및 악성 유방 세포의 조직 구조를 다시 요약 선택의 방법으로 떠오르고있다. 3D에서 자란 세포는 세포 외 기질에서 중요한 단서를 유지하고 생리학 관련 생체 시스템 2,3을 제공합니다. 참고로, 제 4에 비해 3D로 성장하면 세포가 다르게 행동 것을 제안 성장하는 증거가있다. 3D 문화효과적으로 3 개인 양성 유방 표현형에서 악성 표현형을 구별하는 수단으로하고 세포 및 분자 시그널링을 뒷받침 위해 사용될 수있다. 양성 상피 세포의 구별되는 특징 중 하나는 꼭대기 세포질은 루멘으로하고 기초 세포질이 기저막에 달려있다 그래서 그들은 편광되는 것입니다. 이 apico - 기초 극성은 세포의 해체와 우연히 주변의 기질에 침투 세관을 anastomosing 및 분기의 형성을 특징으로 침윤성 암에 손실됩니다. 양성 선 및 침윤 암 사이의 이러한 조직 병리학 적 차이는 3D 6,7에서 재현 할 수 있습니다. 다른 분자 및 세포 생물학 기술, 3 차원의 cultur와 함께 세포 증식, 극성 및 세포 사멸에 대한 검증 분자 마커의 발현을 차등 한 라운드 선포 구조의 정량과 같은 적절한 읽기 아웃을하거나 사용전자 나은 악성 변환시와 책임 신호를 서술의 세포 변화를 이해하는 중요한 도구를 제공 할 수 있습니다.

3D 배양 효과적으로 양성 유방에서 인간 유방 상피 세포의 악성 표현형을 구별 할 수있다. 리겔에 도금 단일 양성 세포는 쉽게 위상 콘트라스트 이미지를 사용하여 하나의 평면에 하나의 둥근 플랫 선포 세포로 이미지화 할 수있는 조직 구형 구조로 성장한다. 마트 리겔에 도금 한 악성 세포가 우연히 성장 매우 높은 굴절률을 표시 한 평면에서 이미지 어렵다. 도 1에 도시 된 바와 같?...

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Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

재구성 기저막에 유방 상피 세포의 3 차원 배양 양성 유방의 생체 구조를 요점을 되풀이하고, 양성 유방 표현형에서 악성 표현형을 구별 할 수있는 유용한 방법입니다. 중요한 것은,이 시스템은 다른 조직에서 침습성 암 연구에 적용 할 수있다.

세 가지 차원 문화 : 유방 세포의 악성 변형 대 일반 선포 건축을 연구하는 도구

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

19.8K 조회수.  University of Michigan Comprehensive Cancer Center.  재구성 기저막에 유방 상피 세포의 3 차원 배양 양성 유방의 생체 구조를 요점을 되풀이하고, 양성 유방 표현형에서 악성 표현형을 구별 할 수있는 유용한 방법입니다. 중요한 것은,이 시스템은 다른 조직에서 침습성 암 연구에 적용 할 수있다. 

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Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

인간 Neuroendocrine 종양 치료의 연구를위한 3 차원 모델로 인간 Neuroendocrine 종양 세포 라인

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

연구

의학

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods rely on the ability of cells either to attach to a solid substratum of a tissue culture dish or to grow in suspension in liquid medium. Multiple immortal cell lines have been created and grown using such approaches, however, these methods frequently fail when primary cells need to be grown ex vivo. Such failure has been attributed to the absence of the appropriate extracellular matrix components of the tissue microenvironment from the standard systems where tissue culture plastic is used as a surface for cell growth. Extracellular matrix is an integral component of the tissue microenvironment and its presence is crucial for the maintenance of physiological functions such as cell polarization, survival, and proliferation. Here we present a 3-dimensional tissue culture method where primary bone marrow cells are grown in extracellular matrix formulated to recapitulate the microenvironment of the human bone (rBM system). Embedded in the extracellular matrix, cells are supplied with nutrients through the medium supplemented with human plasma, thus providing a comprehensive system where cell survival and proliferation can be sustained for up to 30 days while maintaining the cellular composition of the primary tissue. Using the rBM system we have successfully grown primary bone marrow cells from normal donors and patients with amyloidosis, and various hematological malignancies. The rBM system allows for direct, in-matrix real time visualization of the cell behavior and evaluation of preclinical efficacy of novel therapeutics. Moreover, cells can be isolated from the rBM and subsequently used for in vivo transplantation, cell sorting, flow cytometry, and nucleic acid and protein analysis. Taken together, the rBM method provides a reliable system for the growth of primary bone marrow cells under physiological conditions.

In standard culture methods cells are taken out of their physiological environment and grown on the plastic surface of a dish. To study the behavior of primary human bone marrow cells we created a 3-D culture system where cells are grown under conditions recapitulating the native microenvironment of the tissue.

차 사람 골수 및 악성 종양을 연구하는 세 가지 차원 조직 배양 모델

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

3 차원 (3D) 모델을 사용하여 유방암 세포 침윤의 정량화

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

마우스의 유방 지방 패드에 유방암 세포의 소성 주입은 종양의 성장을 연구한다.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes (ILM), and in conjunction with astrocytes, pericytes and endothelial cells they establish the blood-retinal barrier (BRB). BRB limits material transport between the bloodstream and the retina while the ILM acts as a basement membrane that defines histologically the border between the retina and the vitreous cavity. Labeling M&#252;ller cells is particularly relevant to study the physical state of the retinal barriers, as these cells are an integral part of the BRB and ILM. Both BRB and ILM are frequently altered in retinal disease and are responsible for disease symptoms.
There are several well-established methods to study the integrity of the BRB, such as the Evans blue assay or fluorescein angiography. However these methods do not provide information on the extent of BRB permeability to larger molecules, in nanometer range. Furthermore, they do not provide information on the state of other retinal barriers such as the ILM. To study BRB permeability alongside retinal ILM, we used an AAV based method that provides information on permeability of BRB to larger molecules while indicating the state of the ILM and extracellular matrix proteins in disease states. Two AAV variants are useful for such study: AAV5 and ShH10. AAV5&#160;has a natural tropism for photoreceptors but it cannot get across to the outer retina when administered into the vitreous when the ILM is intact (i.e., in wild-type retinas). ShH10 has a strong tropism towards glial cells and will selectively label M&#252;ller glia in both healthy and diseased retinas. ShH10 provides more efficient gene delivery in retinas where ILM is compromised. These viral tools coupled with immunohistochemistry and blood-DNA analysis shed light onto the state of retinal barriers in disease.

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

도구로 아데노 관련 바이러스를 사용하여 질병 망막 장벽을 연구하는

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation assay (hereafter called soft agar assay), which measures the ability of cells to proliferate in semi-solid matrices, remain a hallmark of cancer research. A key advantage of this technique over conventional 2D monolayer or 3D spheroid cell culture assays is the close mimicry of the 3D cellular environment to that seen in vivo. Importantly, the soft agar assay also provides an ideal tool to rigorously test the effects of novel compounds or treatment conditions on cell proliferation and migration. Additionally, this assay enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations. We recently identified peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. Here we highlight the utility of the soft agar assay for preclinical anti-cancer studies by testing the effects of the PADI inhibitor, BB-Cl-amidine (BB-CLA), on the tumorigenicity of human ductal carcinoma in situ (MCF10DCIS) cells.

Here, we document the use of the soft agar colony formation assay to test the effects of a peptidylarginine deiminase (PADI) enzyme inhibitor, BB-Cl-amidine, on breast cancer tumorigenicity in vitro.

소프트 한천 콜로니 형성 분석의 활용은 유방암 세포에서 종양 유발의 억제를 확인하는

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

인간의 뇌하수체 선종 세포의 3 차원 알긴산 비드 문화

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including Parkinson's and Huntington's can disrupt it. People with Parkinson's disease, for example, tend to have increased saccadic latencies. Consequently, the quantitative measurement of saccadic eye movements has received considerable attention as a potential biomarker for neurodegenerative conditions. A lot more can be learned about the brain in both health and disease by observing what happens to eye movements when the function of specific brain areas is perturbed. Deep brain stimulation is a surgical intervention used for the management of a range of neurological conditions including Parkinson's disease, in which stimulating electrodes are placed in specific brain areas including several sites in the basal ganglia. Eye movement measurements can then be made with the stimulator systems both off and on and the results compared. With suitable experimental design, this approach can be used to study the pathophysiology of the disease being treated, the mechanism by which DBS exerts it beneficial effects, and even aspects of normal neurophysiology.

This paper describes the use of quantitative measurement of eye movements in conjunction with stimulation of focal areas of the deep brain in order to study physiology, pathophysiology, and the mechanisms of deep brain stimulation.

깊은 뇌 자극과 Saccadometry를 사용하여 정상 및 병적 뇌 기능을 연구하는

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...

A Clinical Trial Assessing the Safety, Efficacy, and Delivery of Olive-Oil-Based Three-Chamber Bags for Parenteral Nutrition

Limited evidence exists to precisely estimate efficacy and safety differences between parenteral nutrition (PN) prepared using olive-oil-based three-chamber bags (3CBs) and soybean-oil-based compounded bags (CoBs) in hospitalized adult patients. We designed a multicenter, randomized, prospective, open-label, noninferiority protocol to compare the efficacy, safety, and distribution of olive-oil-based 3CBs and soybean-oil-based CoB formulations in adult Chinese patients requiring PN during surgical intervention. Subjects were randomized to receive either one of the study treatments using an interactive voice or web-based recognition system in accordance with the randomization code. Randomization was further stratified based on the study site and surgical category. Both treatment groups received similar amounts of calories and protein. In addition, the two study treatments contained a similar composition of the amino-acid component. The only difference between the two PN formulations was the lipid constitution. The duration of administration of study treatments was a minimum of 5 days up to a maximum of 14 days after the surgical procedure. The primary efficacy endpoint was serum prealbumin levels on day 5 of the study. Noninferiority was proved if the anti-log of the lower bound of the 95% confidence interval (CI) of the treatment difference was at least 0.80. Other efficacy measures included treatment preparation time; duration to achieve tolerability of oral nutrition; associated infectious complications; length of hospitalization; and laboratory assessment of markers of nutrition, inflammation, metabolism, and oxidative stress. A total of 458 patients were enrolled in the study. The results showed that olive-oil-based 3CBs were non-inferior to soybean-based CoBs, besides being well tolerated. The infection rate was found to be significantly lower in the olive-oil-based 3CB group. Thus, this study may be used as a reference for future research on lipid emulsion and 3CBs.

Here, we present a protocol for a study comparing the efficacy, safety, and delivery of olive-oil-based 3CB and soybean-oil-based CoB formulations in adults requiring parenteral nutrition. The results revealed that olive-oil-based 3CBs is non-inferior and well tolerated compared to soybean formulations.