The work was funded by the Fund for Medical Research and Education, Wayne State University, Detroit, MI.

1. 세포 배양 <ol><li> 시드 3 × 75 센티미터 플라스크에서 완전 배양 배지 (10)의 10 mL의 5 HUVEC 세포. </li><li> 70~80%의 합류로 CO 2 5 %에서 37 ° C에서 세포를 품어. </li></ol> 2. 세관 형성의 분석 <ol><li> 4 ° C에서 얼음에 하룻밤 성장 인자 감소 (GFR) 세포 외 매트릭스 또는 정상 세포 외 기질 중 하나를 해동. 주 : &quot;세포 외 기질 &#39;간결성을 위해 이하, GFR 정상 세포 외 기질 모두를 참조하는 데 사용된다. 이를 제조하는 방법은 동일하다. </li><li> 얼음에 96 웰 배양 플레이트를 유지하고 잘 사전 냉각 팁을 사용하여 당 차게 세포 외 기질의 50 μl를 추가합니다. 만 정상 세포 외 기질을 포함하는 5 우물 세중를 준비합니다. 만 GFR 세포 외 기질을 포함하는 5 우물의 또 다른 세중를 준비합니다. </li><li> 30 분 동안 37 ° C에서 96 웰 플레이트를 인큐베이션. </li><li> HUVEC를 씻어한 번 인산 완충 칼슘, 마그네슘 (PBS)없이 솔루션 및 1 ml의 0.05 % 트립신 EDTA를 추가합니다. 대부분의 세포가 반올림 때까지 세포 분마다 확인, 1-5 분 동안 37 ° C에서 접시를 품어. 한 번 플라스크를 눌러 셀을 제거. <ol><li> 5 ㎖를 기본 배지 담기 % 소 태아 혈청 (FBS)과 (아무것도하지 않고 즉, 내피 세포 성장 배지 (예 : 첨가제)를 첨가). 피펫으로 플라스크에서 세포를 수집하고 15 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. 5 분 200 XG에서 세포를 원심 분리기 및 상층 액을 버린다. </li><li> 2 ml의 기초 배지로 재 정지 혈구를 이용하여 세포 수를 계산하고, 2-3 × 105 세포 / ml의 세포 농도를 조절한다. </li></ol></li><li> 기저 매체에 CXCR2 억제제 SB225002 다음의 10 배 농도의 100 μl를 준비 : 11 μM, 5.6 μM, 1.1 μM, 0.56 μM 0 μM (제어). </li><li> 각 5 MICR에 HUVEC 정지 300 μl를 피펫ocentrifuge 튜브. 억제제 농도의 33 μl를 추가 (11 μM, 5.6 μM, 1.1 μM, 0.56 μM 0 μM) 하나의 튜브에 HUVECs를, 그리고 소용돌이를 포함하는 각. </li><li> 피펫 외 매트릭스의 각각의 웰에 세포 현탁액 (1.5 × 104 세포)를 각각 50 μL. 세중 각 서스펜션 플레이트, 37 ° C, 5 % CO 2에서 4-16 시간 동안 배양한다. </li><li> 4-16 시간 후, 잘 거꾸로 현미경 카메라 (11) (원래 배율 × 100)를 사용하여 당 형성된 튜브 (4) 사진을 찍을. </li></ol> 3. 세관 혼란의 분석 <ol><li> 튜브 형성 분석은 (2.3-2.1 단계)와 동일한 사양에 따라 세포 외 기질과 접시를 준비합니다. </li><li> 단계에 설명 된대로 2.4 관 형성 분석법 및 분취 2.4.2 세포 외 기질을 포함하는 96 웰 플레이트에 웰 당 50 μL로 HUVEC 현탁액을 준비한다. 참고 : 충분한 웰의 플레이트그 O를 약물 치료 당 3 우물이있다. </li><li> 37 ℃에서 4 시간 동안 세포 외 기질에 세포 성장, 5 % CO 2. 약물 치료의 시작 전에 이미지를 가져 가라. </li><li> 관 형성 어 세이의 단계 2.5에 기재된 바와 같이 CXCR2 억제제 SB225002의 2 배 농도를 준비하고 된 HUVEC를 함유하는 96 웰 플레이트의 웰 당 각 농도의 50 μL를 추가한다. 세중의 각 농도 플레이트. </li><li> 37 ° C에서 또 다른 2-12 시간 동안 접시를 품어, 5 % CO 2. 웰 (11) (100 × 원래 배율) 거꾸로 현미경 카메라를 사용하여 각각에 형성된 튜브 (4) 이미지를 가져 가라. </li></ol> 4. 정량 데이터 <ol><li> 현미경 카메라 소프트웨어를 사용하여 네 개의 랜덤 현미경 분야에서 튜브의 전체 길이의 튜브를 측정함으로써, 이미지 캡처 관 형성을 평가한다. </li><li> 현미경 카메라 소프트웨어에서 이미지를 열고 &#39;주석 및 측정을 클릭합니다9 ;. &#39;길이&#39;섹션 아래에있는 &#39;간단한 라인&#39;도구를 선택합니다. 다음 마우스 오른쪽 단추로 클릭 튜브의 길이를 따라 선을 그립니다, 이미지를 클릭. 주 : 소프트웨어가 자동 픽셀 라인의 길이를 계산하고, 파일에 데이터를 입력한다. </li><li> &#39;간단한 라인&#39;도구를 선택하여 이미지의 모든 튜브 라인에 대해이 절차를 반복합니다. 다음 마우스 오른쪽 단추로 클릭 튜브의 길이를 따라 선을 그립니다, 이미지를 클릭. 주 : 소프트웨어가 각 라인의 길이를 기록하고, 화면의 데이터를 표시한다. </li><li> 사진에있는 모든 튜브를 측정 한 후, 다음, &#39;내보내기&#39;를 클릭 &#39;스프레드 시트 길이&#39;를 선택했다. 참고 : 길이 데이터를 스프레드 시트로 내보낼 수 있습니다. </li><li> 전체 길이의 튜브를 얻을 수있는 스프레드 시트 튜브 길이를 모두 추가합니다. 계산 및 튜브의 평균 길이를 기록합니다. 참고 : 네 복제는 평균과 측정 표준 편차를 권장합니다. </li></ol> 세포 외 기질 문화 5. 복구 세포 <ol><li> 문화 및 관 형성 어 세이를 수행하기에 충분한 세포 수를 산출하지 96 웰 플레이트로 큰 규모 (섹션 2 참조). 12 웰 플레이트를 들면, 세포 외 기질의 500 μL 및 HUVEC 세포 현탁액 500 μL (1.5 × 105 세포)를 사용한다. </li><li> 튜브를 형성하기 위해, 4-16 시간 동안 세포를 인큐베이션. 그 후, 세포 배양 배지를 흡인. 칼슘 및 마그네슘이없는 냉간 1X PBS 1 ㎖로 세포를 씻어. </li><li> 문화에 얼음 차가운 PBS-2.5 mM의 EDTA 버퍼의 1 ML을 추가하고 10 분 동안 얼음에 보관하십시오. </li><li> 세척 팁을 절단하여 1000 μL 피펫 팁을 사용하여 접시로부터 세포 외 기질 액을 제거하고 차가운 15 ㎖의 튜브에 전송 웰 4 얼음 ㎖의 차가운 PBS-2.5 mM의 EDTA 튜브에 넣고 . </li><li> 1-4 시간 동안 얼음에 튜브를 넣고 세포 외 모든 때까지 튜브를 몇 번 반전매트릭스를 용해시킨다. </li><li> 0 ° C에서 1,620 XG에 10 분 동안 원심 분리기 </li><li> 얼음에 1.ml 튜브에 1 ㎖의 차가운 PBS로 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다. </li><li> 다시 0 ° C에서 3,000 XG에 5 분 후, 상층 액을 처분 원심 분리기. </li><li> -80 ° C에서 세포를 저장합니다. </li></ol>

<ol>
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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+endothelial+cells+for+derived+from+umbililcal+veins.+Identification+by+morphologic+and+immunologic+criteria.">Culture of human endothelial cells for derived from umbililcal veins. Identification by morphologic and immunologic criteria.</a> J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

이 분석을 수행 할 때, 달리 명시되지 않는 한 항상 얼음 상 또는 4 ℃에서 세포 외 기질을 유지하는 것이 필수적이다. 세포 외 기질을 4 ° C 이상으로 가온하는 경우는 중합되고, 상기 분석은 파괴 될 것이다. 그것은 접촉하는 것을 확인하는 것이 중요하다 (예를 들면, 피펫 팁, 플레이트) 세포 외 기질과 미리 냉각 전술 한 이유입니다. 각 웰에 파종 세포 수는 중요하다 너무 적은 세포의 대조군 샘플에서 예상되는 웹주지 너무 많은 세포 대 세포 클러스터 또는 단일 층을 형성하는 것이며, 상기 분석은 유효하지 않을 것이다. 이 분석의 성공에 또 다른 중요한 요인이 된 HUVEC 세포의 통로 번호이다. 통로의 수는 항상 그렇지 않으면 강력한 관 형성이 발생하지 않을 수 10 이하이어야한다. 또한, 하나는 사용되는 세포 배양 배지가 만료되지 않았는지 확인한다, 또는 세포 생존 수 없습니다. Alternatively, 하나 매체와 그 구성 요소와 나누어지는 유효 기간 후의 일정 기간 동안 유지하기 위해 -20 ℃에서 저장할 수있다. 물론, 유효 기한 전에 매체를 사용하는 것이 여전히 바람직 모든 절차와 마찬가지로, 내피 세포의 관 형성 어 세이를 수행하는 몇 가지 단점이있다. 하나의 주요 문제는 내피 세포와지지 매트릭스의 종류가 있기 때문에, 분석의 결과는 셀 매트릭스 타입 사용에 따라 크게 달라질 수 있다는 것이다. 사용 된 내피 세포 (HUVECs를, HAECs 또는 HMVECs)는 그들이 불멸화 세포에 비해 변동성을 얻을 가지고 비용이 많이 드는, 일차 전지이다. 기본 셀은 사용 제한 통로를 가지고, 따라서 장기 실험 혈관 (14)에 적합하지 않다. 신뢰성있는 데이터의 경우, 하나는 항상 상기 분석에 대해 동일한 유형을 사용한다. 시험 관내 분석에서 서로 같이, 관 형성 어 세이의 결과들은 콘되어야이차원 조직 배양의 제어 및 합성 조건의 결과는 항상 생체의 복잡한 바이오 시스템에 반영되지 않을 수 있기 때문에, 생체 내에서 강세. 또한, 튜브 형성 세포 분석법이 유형 단지 내피 세포의 관 형성을 입증하는 데 사용될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하고, 다른 비 - 내피 세포를 검사하는 데 사용되어서는 안된다. 이 분석은 화합물의 혈관 가능성을 정량화 할 수있는 비교적 간단하고 빠른 방법입니다. 또한, 단독으로,이 화합물은 실제 혈관 형성 공정에 영향을하는 특정 메커니즘에 관한 정보를 생성하지 못하고, 추가 실험을위한 플랫폼을 형성한다. 그러나, 다양한 세포 외 매트릭스의 사용이 더 일반적으로 사용되지 않는 연구 질문을위한 프레임 워크를 만드는 방법의 예입니다. 구성 요소를 대상으로 특정 억제제를 포함하는 화합물의 특정 생화학 적 메커니즘을 연구하는 방법이있다혈관 신생 경로. 또 다른 방법은 내피 세포로부터 RNA를 추출하고 분석에서 관찰 된 성장 거동을 일으킬 수의 유전자 발현 변화를 분석하기 위해 RT-PCR (실시간 PCR) (12)를 사용할 수있다. 이 방법의 미래 응용 프로그램은 혈관 신생 경로의 특정 단계에 대한 노크 다운 분석을 생성 된 HUVEC를 형질 전환 등이 있습니다. 림프관 경로를 연구하기 위해이 방법을 적용 할 가능성이있다. 세포 외 기질 성분을 변경하여, 행렬 암에서 혈관 신생을지지 세포 과정의 상호 작용이 더 설명 될 수있다. 이러한 특정 조건하에 내피 세포로부터 RNA와 단백질의 추출은 추가적인 정량적 데이터는 데이터를 묘화에 대응 제공한다.

생존에 필요한 영양분을 얻기 위해, 악성 종양 환자의 혈류에 대한 액세스를 필요로한다. 이 액세스하기 위해, 종양 세포는 혈관 신생 따라서이 알려져 정상 생리적 과정을 하이재킹, 종양으로의 새로운 혈관의 성장을 자극하는 화학적 신호를 방출. 그것은 전이 (즉, 다른 장기 암의 확산)이 발생할 수있는 혈관을 통해 생성 된 혈관을 통해도. 혈관 신생 과정은 암과 같은 다양한 종류의 진행에 매우 중요하기 ​​때문에, 항암 치료 연구 (3)에서 매력적인 표적이다. 혈관 생성을 정량화하기 위해 사용되는 하나의 방법은 세포 외 매트릭스 상에 배치 할 때 튜브를 형성하는 혈관 내피 전구 세포의 능력을 측정하는 것이다. 이러한 관의 형성은 환경 조건 (소정 주식의 예 존재 또는 부재를 테스트 혈관 신생에 중요한 초기 단계이기 때문에,mpound) 자극 또는 억제 할 수있는 관 형성은 혈관 신생을 억제하는 대상이 될 수있는 특정 단계에 대한 통찰력을 제공합니다. 내피 세포의 관 형성 분석법은 튜브를 형성하는 세포의 능력을 측정하는 가장 널리 사용되는 4 시험 관내 방법 중 하나이다. 그것은 상대적으로 적은 부품 및 짧은 배양 기간 5를 필요로 간단한 분석이다. 아마도 가장 중요한 것은, 분석이 유형에서 얻은 데이터를 정량화 점이다. 관 형성 어 세이를 사용하는 예를 저감 성장 인자 (GFR) 외 기질 대 외 매트릭스상에서 성장한 혈관 내피 세포의 튜브의 개발을 비교 포함한다. 라미닌, IV 형 콜라겐, 성장 인자 및 프로테오글리칸은 세포 외 기질이 육종 세포의 주요 구성 요소에서 고립 된 기저막과 같은 소재입니다. 일부 화합물의 튜브를 형성하는 세포의 능력에 상이한 효과를 가질감소 된 성장 인자 감소 헤파 란 황산 프로테오글리칸 (HSPGs)와 환경. HSPGs 크게 GFR 외 기질이 감소되는 세포 외 매트릭스의 구성 요소이다. 예로서, 상기 가정은 HSPGs이 풍부한 관 형성을 방해하기 위해 상당히 강한 능력을 차단 CXCR2 수용체, SB225002와 같은 혈관 신생 억제제는 다음 세포 외 기질 및 GFR 외 매트릭스의 관 형성 활성의 비교임을인지 HSPGs의 제어를 통해 혈관 신생 억제 가능성 탐구 중요. 일반적으로 혈관에서의 화합물의 효과를 결정하기 위해 사용되는 다른 분석은 생체 내 방법에있다. 이 중 주목할만한 예는 닭 계란을 사용하여 병아리 융모 막 (CAM) 분석 (6), 그리고 생체 내 마트 리겔은 마우스를 사용하여 혈관 신생 분석 (7)를 연결합니다. 생체 내 방법은 t에서 혈관 신생을 측정하는 동안HREE 치수 및 관내 관 형성 분석법에 비하여 인체에 더욱 대표적인, 그들은 훨씬 더 많은 시간을 필요로한다는 결점을 겪고 상당히 더 수행하기 어렵다. 캠 분석 및 세포 플러그 분석 모두 비하여 관 형성 분석법은 하루에 수행 될 수 있지만, 이렇게하는 적어도 하나의 주 8 가지고 그것은 동물 사용을 요구하지 않는다. 이 보고서에서 사용한 혈관 내피 세포는 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)는 것을 주목하는 것이 중요하다. 이들 세포는 혈관 새싹 및 혈관의 성장에 중요한 역할을하고, 충분한 양의 시험 관내 및 생체 내 실험 9 항 - 혈관 형성 활성을 평가하는데 사용될 암에서 내피 세포 유사하다. 일차 미세 혈관 내피 세포와 같은 다른 세포도 사용될 수있다. 낮은 갖는 외에주의하는 것도 중요하다정상 세포 외 기질에 비해 HSPGs 수준은 또한 GFR 외 매트릭스는 여러 요소 레벨을 감소시켰다. 이 포함되지만 이에 국한되지 않습니다 : EGF, IGF-1, PDGF와 TGF 베타. 혈관 신생 관련 화합물의 중요성을 공부하고 그 수행하는 실험은 GFR 세포 외 기질을 사용하여에 관심이있을 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>EGM-2 complete growth medium (EGM-2 bullet kit CC-3162 )</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9525043</td>
			<td>HUVEC complete growth medium: EGM-2 base medium mixed with BBE (Bovine Brain Extract), hEGF (Human Epidermal Growth Factor), Hydrocortisone, GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin-B), 2% FBS (Fetal Bovine Serum), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-&#946; (Human Fibroblast Growth Factor Beta), R3-IGF-1 (Long R Insulin-like Growth Factor One), Ascorbic Acid, and Heparin.&#160; Aliquot the medium and its components and store them at -20 oC, warm&#160; in 37 oC&#160; before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATRIGEL MATRIX 10ML Growth Factor Reduced (GFR); 10mL; LDEV-Free</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CB-40230&#160;</td>
			<td>Growth Factor Reduced (GFR) extracellular matrix, keep in&#160;&#160; -20 oC , warm in 4 &#176;C&#160; before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATRIGEL MATRIX 10ML ; 10mL; LDEV-Free</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CB-40234&#160;</td>
			<td>extracellular matrix, keep in&#160;&#160; -20 oC, warm in 4 &#176;C&#160; before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB225002</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>559405</td>
			<td>CXCR2 inhibitor, keep in&#160;&#160; -20 oC, warm in room temperature&#160; before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)&#160;</td>
			<td>ScienCell Research Laboratories&#160;</td>
			<td>8000</td>
			<td>culture it according reference&#160; 10.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%-EDTA phenol red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>keep in 4 oC, warm&#160; in 37 oC&#160; before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon ECLIPSE Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Inverted Research Microscope.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.20.02 64 bit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Inverted Research Microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph-pad Prism 5</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>scientific 2D graphing and&#160;statistics software, to calculate IC50.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

strategic endothelial cell tube formation assay: comparing extracellular matrix and growth factor reduced extracellular matrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.

상당한 건강 내피 관 형성을 용이 현미경 이미지에서 관 형성 억제를 대조 할 수있다. 건강 관 형성은 모세 혈관 같은 구조 (그림 1)의 조직 웹으로 나타납니다. 비교, 억제 관 형성 흩어져 세포 (그림 2) 자체를 명시한다. 관 형성 어 세이 데이터 모세관 (표 1)의 전체 길이의 튜브를 측정함으로써 정량한다. 전체 길이의 튜브 외에, 분기점의 평균 길이의 튜브, 튜브의 전체 개수, 또는 전체 수를 측정 할 수있다. 구조화 된 관 형성을 저해 분산 튜브의 성장보다 더 순 튜브 길이를 산출한다. 도 3에서, 투여 량 반응 곡선은 GFR 외 기질 및 CXCR2의 억제제 SB225002 된 HUVEC의 실험 조건에서 IC (50)의 계산을 허용한다. 세포 외 기질과 성장 인자 감소 (GFR) 세포 외 기질에 그림 1. 내피 t의 우베 형성. 두 이미지는 세포 외 기질 (A) 및 GFR 세포 외 기질 (B)에 성공적으로 관 형성을 보여줍니다. 튜브의 상호 연결된 네트워크는 명확 튜브의 성장이 HUVECs를 건강 있음을 보여줍니다. 스케일 바 = 10 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54074/54074fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54074/54074fig2.jpg" /> 에 인자 감소 (GFR)을 CXCR2 억제제 SB225002 (5.6 μM)에 의해 세포 외 기질 세포와 성장. 관 형성의 그림 2. 억제 두 이미지는 튜브를 표시세포 외 매트릭스 (A) 및 GFR 외 매트릭스 (B)의 CXCR2 억제제 SB225002 (5.6 μM)에 의해 억제되어 형성. 이 화상 표시에서 본 HUVEC 세포의 단리는 세포 덩어리 서로 접속할 필요 튜브를 형성 할 수있는 것이 아니었다. 스케일 바 = 10 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54074/54074fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54074/54074fig3.jpg" /> 성장 인자 - 감소 (GFR) 세포 외 매트릭스도 3 용량 반응 곡선. X 축은 길이의 튜브를 도시하고, Y 축은 CXCR2의 억제제의 농도를 나타낸다. 용량 반응 곡선은 GFR 외 매트릭스에서 CXCR2 저해제로 HUVEC 응답이 농도 의존적​​ 인 것을 알 수있다. 이 IC (50) (반 최대한 억제Y 농도), 예를 들어, 소프트웨어 (13)를 이용하여 세포 외 기질에 대한 투여 량 반응 곡선과 비교할 수에 의해 산출 하였다. IC (50)은 50 %에 대한 응답을 저하 억제제의 농도이다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 성장 인자 감소 (GFR) 세포 외 기질과 저해제 (4 각 복제) </td><td> 총 튜브 길이 평균 (픽셀) (1 픽셀 = 0.34 μm의) </td><td> 표준 편차 </td><td> P 값 </td></tr><tr><td> GFR 외 매트릭스 제어 </td><td> 2,447 </td><td> 168.174 </td><td></td></tr><tr><td> GFR 세포 외 기질 + 0.56 μM의 SB225002 </td><td> 1422.5 </td><td> 185.4218 </td><td> 0.000395 </td></tr><tr><td>GFR 세포 외 기질 + 1.1 μM의 SB225002 </td><td> 1,004 </td><td> 126.1784 </td><td> 2.14 × 10 -5 </td></tr><tr><td> GFR 세포 외 기질 + 5.6 μM의 SB225002 </td><td> 519.25 </td><td> 129.6368 </td><td> 4.19 × 10 -6 </td></tr><tr><td> GFR 세포 외 기질 + 11 μM의 SB225002 </td><td> 393.75 </td><td> 212.6857 </td><td> 1.21 × 10 -5 </td></tr></tbody></table> 표 1. 다양한 조건에서 성장 인자 - 감소 (GFR) 세포 외 매트릭스의 총 길이의 튜브를 정량화. CXCR2 억제제를 다양한 농도로 GFR 외 매트릭스상에서 성장한 샘플에 기록 된 전체 길이의 튜브를 사용하여 테이블의 일부. 데이터는 CXCR2 억제제 관 형성을 억제하는 않는 것을 나타낸다. 이러한 네 가지 복제, 표준 편차의 평균 및 P 값과 관련된 값이 포함되어 있습니다. 보여 픽셀 단위로 측정내 보낸 데이터. IC (50)은 통계 소프트웨어 (13)를 사용하여 계산 될 수있다. (1 픽셀 = 0.34 μm의)

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Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

전략적 내피 세포 관 형성의 분석 : 감소 세포 외 매트릭스 세포 외 기질과 성장 인자를 비교

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

13.3K 조회수.  Wayne State University School of Medicine. This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

비디오: Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

사후 조직에서 Cardiomyocyte 핵의 분리

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

연구

의학

Matrix-assisted Autologous Chondrocyte Transplantation for Remodeling and Repair of Chondral Defects in a Rabbit Model

Articular cartilage defects are considered a major health problem because articular cartilage has a limited capacity for self-regeneration 1. Untreated cartilage lesions lead to ongoing pain, negatively affect the quality of life and predispose for osteoarthritis. During the last decades, several surgical techniques have been developed to treat such lesions. However, until now it was not possible to achieve a full repair in terms of covering the defect with hyaline articular cartilage or of providing satisfactory long-term recovery 2-4. Therefore, articular cartilage injuries remain a prime target for regenerative techniques such as Tissue Engineering. In contrast to other surgical techniques, which often lead to the formation of fibrous or fibrocartilaginous tissue, Tissue Engineering aims at fully restoring the complex structure and properties of the original articular cartilage by using the chondrogenic potential of transplanted cells. Recent developments opened up promising possibilities for regenerative cartilage therapies.
The first cell based approach for the treatment of full-thickness cartilage or osteochondral lesions was performed in 1994 by Lars Peterson and Mats Brittberg who pioneered clinical autologous chondrocyte implantation (ACI) 5. Today, the technique is clinically well-established for the treatment of large hyaline cartilage defects of the knee, maintaining good clinical results even 10 to 20 years after implantation 6. In recent years, the implantation of autologous chondrocytes underwent a rapid progression. The use of an artificial three-dimensional collagen-matrix on which cells are subsequently replanted became more and more popular 7-9.
MACT comprises of two surgical procedures: First, in order to collect chondrocytes, a cartilage biopsy needs to be performed from a non weight-bearing cartilage area of the knee joint. Then, chondrocytes are being extracted, purified and expanded to a sufficient cell number in vitro. Chondrocytes are then seeded onto a three-dimensional matrix and can subsequently be re-implanted. When preparing a tissue-engineered implant, proliferation rate and differentiation capacity are crucial for a successful tissue regeneration 10. The use of a three-dimensional matrix as a cell carrier is thought to support these cellular characteristics 11.
The following protocol will summarize and demonstrate a technique for the isolation of chondrocytes from cartilage biopsies, their proliferation in vitro and their seeding onto a 3D-matrix (Chondro-Gide, Geistlich Biomaterials, Wollhusen, Switzerland). Finally, the implantation of the cell-matrix-constructs into artificially created chondral defects of a rabbit's knee joint will be described. This technique can be used as an experimental setting for further experiments of cartilage repair.

An experimental technique for the treatment of chondral defects in the rabbit's knee joint is described. The implantation of autologous chondrocytes seeded on a matrix is a well-accepted method for the remodeling and repair of articular cartilage lesions providing satisfying long-term results. Matrix-assisted autologous chondrocyte transplantation (MACT) offers a standardized and clinically established implantation method.

토끼 모델에서 Chondral 결함의 리모델링 및 수리를위한 매트릭스를 이용한자가 연골 세포 이식

Articular cartilage defects are considered a major health problem because articular cartilage has a limited capacity for self-regeneration 1. Untreated ...

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

The Focus Formation Assay provides a straightforward method to assess the transforming potential of a candidate oncogene.

형성 초점 : 세포 기반 분석은 유전자의 발암 성 가능성을 파악하기 위해

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Dupuytren&#8217;s disease (DD) is a fibroproliferative disease of the palm of the hand. Here, we present a protocol to culture resection specimens from DD in a three-dimensional (3D) culture system. Such short-term culture system allows preservation of the 3D structure and molecular properties of the fibrotic tissue.

인간의 Dupuytren의<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 근섬유 아세포의 연구와 세포 외 기질 상호 작용에 대한 문화

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

인간 유방암 조직과 세포주에서 Mammosphere 형성 분석

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.

Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.

Ciliopathy 마우스 돌연변이 달팽이관의 평면 셀 극성 표현형의 평가

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

암 세포 침윤 및 위성 종양 형성을 탐색하는 문화 분석 세 가지 차원

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage and that carries factor VIII in the circulation. VWF is synthesized by endothelial cells and is either released constitutively into the plasma or is stored in specialized organelles, called Weibel-Palade bodies (WPBs), for on-demand release in response to hemostatic challenge. Procoagulant and proinflammatory stimuli can rapidly induce WPB exocytosis and VWF release. The majority of VWF released by endothelial cells circulates in the plasma; however, a proportion of VWF is anchored to the endothelial cell surface. Under conditions of physiological shear, endothelial-anchored VWF can bind to platelets, forming a VWF-platelet string that may represent the nidus of thrombus formation. A flow chamber system can be used to visually observe the release of VWF from endothelial cells and the subsequent platelet capture in a manner that is reproducible and relevant to the pathophysiology of VWF-mediated thrombus formation. Using this methodology, endothelial cells are cultured in a flow chamber and are subsequently stimulated with secretagogues to induce WPB exocytosis. Washed platelets are then perfused over the activated endothelium. The platelets are activated and subsequently bind to elongated VWF strings in the direction of fluid flow. Using extracellular histones as a procoagulant and proinflammatory stimulus, we observed increased VWF-platelet string formation on histone-treated endothelial cells compared to untreated endothelial cells. This protocol describes a quantitative, visual, and real-time assessment of the activation of VWF-platelet interactions in models of thrombosis and hemostasis.

In this paper, we describe a method to assess endothelial von Willebrand factor release and the subsequent platelet capture under fluid shear stress in response to inflammatory stimuli using an in vitro flow chamber system.

조사 폰 Willebrand 요소 이상 모델을 사용 하는 흐름 챔버의 폰 Willebrand 요인-혈소판 문자열 형성

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular respiration, oxidative metabolism, signal transduction, and apoptosis. Consequently, mitochondrial dysfunction is reported to play an important role in the antifungal drug tolerance and virulence of pathogenic fungi. Recent data have also led to the recognition of the importance of the mitochondria as an important contributor to fungal pathogenesis. Despite the importance of the mitochondria in fungal biology, standardized methods to understand its function are poorly developed. Here, we present a procedure to study the basal oxygen consumption rate (OCR), a measure of mitochondrial respiration, and extracellular acidification rates (ECAR), a measure of glycolytic function in C. albicans strains. The method described herein can be applied to any Candidaspp. strains without the need to purify mitochondria from the intact fungal cells. Furthermore, this protocol can also be customized to screen for inhibitors of mitochondrial function in C. albicans strains.

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Here, we present a stepwise protocol to investigate the mitochondrial respiration and glycolytic function in Candida Albicans using an extra flux analyzer.

칸디 다 albicans 를 사용 하 여 실시간 세포 외 유출 분석의 바이오에 너 지론 조사

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

파라핀 내장 된 조직에서 인간과 뮤린 호중구 세포 외 트랩의 면역 형광 라벨링

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...