이 프로토콜을 사용하면 다양한 유형의 배양을 확인하고 세포 외 행렬과의 상호 작용을 관찰할 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 당신이 얻는 매트릭스가 섬유 아세포에 의해 재생되고 생체 내에서 생성 된 것과 매우 유사하다는 것입니다. 우리는 베이킹 접시에서 얻은 섬유 아세포를 사용할 때이 질병이 무관하다고 생각합니다.
이러한 세포에서 매트릭스를 설정하면 지속적인 상황과 같은 영향을 미칠 수있는 방법을 계몽 할 수 있습니다. 이러한 방법은 또한 매트릭스 소유주의 생존자에게 물리적 인 연구( 예를 들어) 적용 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 시각화는 리젠트가 필요한 단계의 파이펫 팅 기술을 관찰하는 것이 중요합니다.
이러한 메서드를 처음 시도할 때 예상보다 더 많은 시간이 걸릴 수 있습니다. 우리의 조언은 사전에 준비하고 다음 단계에 대한 준비를위한 기간 기간을 사용하는 것입니다. 원고 방향에 따라 0.2%의 젤라틴, 1%글루타랄데히드 및 1개의 어금니 에탄올라민 솔루션을 준비하는 것으로 시작합니다.
사용하기 전에 0.22 마이크로미터 필터를 통해 각 솔루션을 실행해야 합니다. 다음으로, 아스코르브 산과 리시스 버퍼를 준비합니다. 원고에 설명된 대로 PBS 펜 스트렙을 희석하고 10%의 FBS로 DMEM을 준비합니다.
살균물 100밀리리터에 BSA 2그램을 추가하고 끓는 수조에서 7분간 데우어 열변2%BSA를 준비합니다. 그런 다음 페니실린, 연쇄상 구균, 젠타미신 및 amphotericin B.Culture 재조합 텔로미어가 불멸의 인간 포피 섬유아세포 및 DMEM을 10%FBS로 변형시키고 37°C와 이산화탄소 5%로 유지했습니다. 1 차적인 섬유아세포 배양을 설치하기 위하여는, 약 2 3 밀리리터의 작은 조각으로 조직 견본을 잘라내고 항생제의 고농도로 FPS에 그(것)들을 종자.
첫 번째 섬유아세포가 나타나면 배지를 세포 유지 관리를 위한 FBM 배지로 바꿉시다. 6웰 플레이트의 각 웰에 0.2%의 젤라틴 용액 2밀리리터를 넣고 섭씨 37도 또는 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 젤라틴을 흡인하고 PBS의 2 밀리리터로 각각 잘 씻으세요.
각 웰에 글루타랄데히드 의 1 %의 2 밀리리터를 추가하고 젤라틴을 교차 연결하는 30 분 동안 실온에서 접시를 배양합니다. 글루타랄데히드를 흡인하고 5분 동안 PBS의 2밀리리터로 우물을 씻습니다. 남은 글루타랄데히드를 차단하려면 어금니 에탄올라민 1마리의 밀리리터 2개를 넣고 30분 동안 실온에서 플레이트를 배양합니다.
에탄올라민을 흡인하고 PBS로 세치를 반복합니다. 10%FPS로 DMEM 1밀리리터를 추가합니다. 매체가 즉시 분홍색으로 변하면 제거한 다음 PBS 2밀리리터로 우물을 한 번 씻고 DMEM의 또 다른 밀리리터를 추가하십시오.
각 우물에서 5 x 10을 가진 섬유 아세포 현탁액의 1 밀리리터를 씨앗과 100%의 합류가 도달 할 때까지 세포를 배양. 그런 다음 매체를 제거하고 10 % FBS와 밀리리터 아스코르브 산 당 50 마이크로 그램으로 DMEM으로 대체하십시오. 6일 동안 2일마다 배지를 교체합니다.
마지막 아스코르브 산 치료 후 이틀 은 매체를 제거하고 PBS의 두 밀리리터로 우물을 세척. 세척 후, 천천히 예열 된 용해 버퍼의 1 밀리리터를 추가하고 섬유 아세포가 용해 될 때까지 5 ~ 10 분 동안 실온에서 플레이트를 배양합니다. 리시스 버퍼를 제거하지 않고 각 웰에 PBS 2 밀리리터를 조심스럽게 추가한 다음 약 2.5 밀리리터를 흡입합니다.
총 세개의 세차재에 대해 이 과정을 두 번 반복합니다. 마지막 세척 후, 펜 스트렙과 PBS의 두 밀리리터를 추가합니다. 필름으로 접시를 밀봉하고 최대 3 개월 동안 섭씨 4도에서 보관하십시오.
최대 합류가 될 때까지 2%의 FBS로 HUVEC 세포와 EMB-2를 성장시보아 주어드실 수 있습니다. 그런 다음 8 시간 동안 FBS없이 EBM-2로 매체를 교체하십시오. 세포 씨를 위해 행렬을 준비하려면 냉장고에서 꺼내 실온에서 1 시간 동안 둡니다.
2밀리리터의 열변성 2%BSA를 추가하고 1시간 동안 섭씨 37도에서 배양하여 행렬을 차단합니다. 그런 다음 BSA를 흡인하고 PBS의 2 밀리리터로 세척하십시오. 종자 2 x 10 제5 HUVEC 세포에 섬유아세포 유래 행렬로 코팅된 판의 각 웰에.
세포를 섭씨 37도에서 16시간 동안 배양한 다음 20-40배율의 표준 밝은 필드 현미경하에서 튜브와 같은 구조를 검사합니다. 이 프로토콜은 섬유아세포 유래 매트릭스 형성에 PDGF 치료의 영향을 검사하기 위해 사용되었다. PDGF로 배양 된 BGH 세 번째 섬유 아세포PDGF없이 배양 보다 행렬에서 더 정렬 된 세포 분포를 보였다.
콜라겐 1 및 fibronectin 단백질 발현PDGF 자극 섬유아세포로부터 유래된 행렬에서 증가하였고 결과적으로 매트릭스 두께가 증가하였다. 더욱이, 방향성 히스토그램은 콜라겐 1과 섬유네틴이 평행 패턴을 나타낸다는 것을 보여줍니다. HUVEC 세포가 PDGF 자극 섬유아세포에서 파생된 탈세포화 행렬에 종자되었을 때 자극되지 않은 조건하에서보다 더 많은 모세혈관 과 같은 구조를 개발했습니다.
PDGF-BB자극 섬유아세포에서 파생된 행렬이 내피 세포 활성화를 촉진한다는 것을 확인한다. 이 절차를 수행할 때 솔루션을 미리 준비하고 세포가 시작하기 전에 준비되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 내피 세포 연구 외에도 행렬은 상피 세포로 종자 될 수 있으며 미디어 또는 세포 독성 약물의 상태와 같은 외부 요인에 대한 반응을 관찰 할 수 있습니다.
세포 외 매트릭스의 생성은 종양 거시 환경 실험의 디자인에 매우 중요합니다.
