HUVEC 튜브 형성 분석은 혈관 신생에 천연 물의 영향을 평가하기 위해

관 형성 분석은 새로운 혈관의 형성으로 이어지는 몇 가지 단계의 기본 분자 메커니즘을 연구하는 시험관 내 테스트입니다. 이 분석법은 혈관 신생에 관련된 화합물 및 신호 폭포를 식별 할 수 있습니다. 한 번의 테스트를 통해 RGWE와 같은 천연 화합물은 내피 세포가 튜브와 같은 구조를 형성하는 능력을 감소시키고, 세포 생존가능성에 영향을 미치지 않으며, 이 효과는 MEK/ERK 경로의 활성화에 달려 있음을 보여줄 수 있습니다. 적절한 수의 셀로 테스트를 수행하는 것이 중요합니다. 사실, 너무 많거나 너무 많은 세포는 튜브의 올바른 형성을 허용할 수 없었다. 이러한 이유로, 세포의 정확한 수를 알아내기 위해 예비 테스트를 수행하는 것이 좋습니다. 루카 올가 파스토리노, 내 실험실에서 박사 과정 학생, 절차를 보여줍니다. 먼저 봄과 여름철에는 루타 자갈렌즈 잎을 모으세요. 다진 잎 250그램을 원뿔 플라스크에 넣고 원고에 설명된 대로 증류수, 끓기 및 필터 1리터를 추가합니다. 다음 날, 잎 추출물을 lyophilize하기 위해 lyophilizer를 사용합니다. 분말을 얻은 후, 무게를 측정하고, 알리 쿼트로 분할. 텍스트 프로토콜에 따라 내피 세포 성장 배지에서 HUVECs를 배양합니다. 세포가 80%에 도달하면 세포를 1~3의 비율로 통과시합니다. 2번 통과5항 사이에 얻어진 세포를 사용한다. 일단 통과된 HUVECs가 70%의 수렴성에 도달하면, 관심 유전자를 포함하는 벡터의 1마이크로그램으로 변환합니다.희석된 리포펙타민 2000의 3개의 마이크로리터와 DNA의 1마이크로그램을 결합합니다.그런 다음 HUVECs에서 배지를 제거하고 신선한 완전한 매체의 1밀리리터로 대체하십시오. 세포에 변환 용액을 추가하고 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 트랜스포팅 후 3시간 후, 7밀리리터의 신선한 완전 배지를 추가하고, 24~48시간 동안 세포를 배양한다. 지하 준비 직전에, 얼음에 미리 차가운, 96 웰 접시를 넣고, 각 우물에 차가운 매트릭스의 50 마이크로 리터를 추가합니다. 플레이트가 인큐베이션하는 동안, PBS/EDTA 용액 1밀리리터로 HUVEC를 세척합니다. 그런 다음, Trypsin-EDTA 용액의 1밀리리터를 세포에 추가하고 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다.중단된 세포를 함유하는 배지를 수집하고 원심분리를 통해 세포를 수확한다. 그런 다음 PBS의 1 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다. 트라이판 블루 용액을 사용하여 세포 서스펜션의 0.2 밀리리터를 PBS의 0.5 밀리리터로 전송합니다. 실온에서 5분 동안 서스펜션을 유지한 후, 세포를 B로 세어