우리는 많은 도움이 토론 이브 Couder에게 특별한 감사를드립니다. 우리는 캔틸레버와 토론의 교정을 위해 테프 Asnacios 감사합니다. 우리는 비판적 읽기 리사 윌리스, 엘리엇 Meyerowitz, 올리버 Hamant 감사합니다. 이 작품은 인간 프론티어 과학 프로그램 보조금 RGP0062/2005-C에 의해 부분적으로 투자되었습니다; 직원은 국립 드 라 공들인는 &#39;&#39; &#39;&#39; Growpec, &#39;&#39;과 &#39;&#39; Mechastem를 투영합니다.

1. 샘플 장착 용 유리 슬라이드를 준비합니다 <ol><li> 아가로 오스 매체 복제 인간의 DNA 준비 : 10 % 만니톨 (물)의 0.7 % 저 융점 아가. </li><li> 강한 금속기구 (예를 들면 드릴 팁, 라임)을 사용하여 현미경 유리 슬라이드의 중심에 0.5 × 0.5 cm의 영역을 에칭. 또는 그 대신, 아랄 다이 접착제를 사용하여 유리 슬라이드에 유리 라멜라 (약 20 × 200 ㎛)의 작은 조각을 접착제. NOTE :이되도록하여 아가로의 부착을 용이하게하기 위해 표면을 거칠게하는 슬라이드 아가 미디어 스틱 또는 수정. 이 슬라이드는 재사용 할 수 있습니다. </li><li> 유리 슬라이드의 에칭 지역에 아가로 오스 매체 복제 인간의 DNA의 약 20 μL의 방울을 배치합니다. 따라서, 아가 로스의 박막을 준다. </li><li> 습기가 상자에 유리 슬라이드를 저장하고 아가 로스 미디어가 응고 될 때까지 기다립니다. </li></ol> 2. 분열 조직 샘플을 해부 및 설치 <ol><li> 공 초점 이마 기위한 Microdissect 분열 조직NG : 초 미세 핀셋을 아래로 당겨서 줄기에서 꽃 봉오리 하나 하나를 제거합니다. 그것은 (P1 원기 14 즉) 꽃받침 잎을 나타내지 않는 꽃 봉오리에 모든 꽃 봉오리를 제거하는 것이 중요합니다. </li><li> 면도날이나 핀셋의 끝 부분을 사용하여, 멀리 줄기에서 분열 조직을 잘라. 컷은 AFM으로 측정한다 분열 조직 표면의 영역에 평행해야한다. 얻어진 정점은 300 μm의 AFM 팁 아래에 맞게 높은 600 μm의 사이에 있어야한다. </li><li> 단계 1.1.4에서 준비 아가로 오스 미디어의 영화로 정점을 밀어 넣습니다. 유리 슬라이드 / 아가로 오스의 위치를​​ 선택하고 분열 조직은 유리 슬라이드에 접촉 직접적이며, 아가로 오스에서 밖으로 돌출 부드럽게 등을 밀어 넣습니다. 그것은 줄기에서의 컷을 따라 몇 초 내에 아가로 오스의 분열 조직의 위치를​​ 매우 중요합니다. NOTE :이 건조로부터 분열을 방지하기 위해서이다. 이 단계에서, 분열 조직은 CRAC 서한다아가로 오스는 압력의인가시 골절 때문에 K. </li><li> 그들은 같은 높이의이고 하나의 슬라이드에 서로 미만 500 μm의 위치하도록 제공하고, 여러 분열 조직에게 일괄 이미징이 방법을 준비합니다. 추가 샘플을 해부하는 동안 습기 상자에 준비 분열 조직을 유지. 참고 : 교정에서 오는 변화를 제한합니다. 각 조건의 적 2 샘플을 준비하고 무작위로 측정 할 수있다. 지금까지 측정 (스트레스 유발 응답)에 배치 영상의 더 관찰 된 효과가 없습니다. 이 한천 및 / 또는 설치 솔루션 스트레스 신호 전달 분자의 희석에 대한 감사가 될 수 있습니다. 대안 적 스트레스 반응에 관계없이 제조 된 샘플의 양과 동일하다. </li><li> 다음 단계로 이동하기 전에 분열과 꽃 봉오리의 경계가 건조해야합니다. 그렇지 않으면, 완만하게 여과지를 사용하여 과잉의 물을 제거한다. 이것은 녹은 다음 단계에 방지해야아가로 인해 모세관 힘에 샘플을 홍수. </li><li> 20 μL 피펫으로 충분히 추가 단계 1.2.3에서 생성 된 균열을 채우기 위해 아가로 오스 장착 녹아있다. 각 분열 조직을 둘러싸. 아가로 오스가 제거 된 꽃 봉오리 (primordium)의 흉터의 수준에 도달해야한다. 이것을 달성하기 위해서는, 균열의 각 단부에 아가 로스를 첨가 할 필요가있을 수도있다. </li><li> 아가 로스를 첨가되면 신속 균열로 범람 할 것이다; 피펫을 사용하여, 분열 조직 슬라이드의 가장 높은 지점에 있는지 확인하는 아가로 오스 장착 용융의 일부를 빨아. 이 영상 중에 이동할 수 있도록이 분열을 해결합니다. </li></ol> 3. 설치 루트 또는 배축 샘플 <ol><li> 뿌리와 배축의 경우, 절개가 필요하지 않습니다. 제조 된 유리 슬라이드에 아가로 오스의 박막에서 직접 유리에 에칭 위 또는 유리의 얇은 판을 따라 하나 홈을합니다. 그것과 접촉하는 것을 보장이 홈에 루트 또는 배축을 놓고그것의 전체 길이를 따라 유리. </li><li> 다음 단계로 이동하기 전에 샘플 표면에 건조해야합니다. 그렇지 않으면, 완만하게 여과지를 사용하여 과량의 물을 제거한다. </li><li> 추가 단계 1.2.6에서와 같이 시료의 주위에 아가로 오스 장착 녹아있다. </li></ol> 4. AFM 준비 및 감도 교정 (JPK Nanowizard AFM 용) <ol><li> AFM의 캔틸레버를 탑재합니다. 캔틸레버는 둥근 모양 인 덴터에 장착해야합니다. 반경은 X, Y, Z의 해상도와 정확한 측정이 보관 될 수있는에 압입 깊이를 결정합니다. <ol><li> 표피의 표면에서 메조 나노 측정을 수행하려면, 50 nm의 반경 라운드 압자를 사용; , 중규모 측정을 0.5 μm의 반경 라운드 압자를 사용하는; (2 ~ 3 세포를 통해) 마이크로 측정을 위해, 2.5 μm의 반경 라운드 압자를 사용합니다. </li></ol></li><li> 캔틸레버의 끝에서 레이저의 위치. 중간에 레이저를 맞 춥니 다미러를 사용한 포획의. </li><li> AFM에서 깨끗한 유리를 배치합니다. NOTE : 다음은 캔틸레버의 변형에 AFM 수용체에 레이저의 위치 신호를 변환하도록 설정하고, 강제로 번역하기 위해, 캔틸레버의 스프링 정수를 평가하는 것이다. </li><li> 1 V.의 목표 힘 &quot;세트 포인트&quot;로 접근 </li><li> &quot;힘 분광&quot;를 선택합니다. 2 V에 최대 &quot;상대 세트 포인트&quot;를 설정하여 들여 쓰기를 수행, 40 μm의 / 초에 &quot;속도를 확장&quot;, 5 μm의 &quot;Z 길이&quot;. </li><li> &quot;교정 관리&quot;메뉴에서 &quot;적합 범위를 선택&quot;버튼을 사용하여 감도에 맞게 앞으로 곡선의 선형 부분을 선택합니다. &quot;상대 세트 포인트&quot;는 &quot;m&quot;에 &quot;볼트&quot;에서 변형되어야한다. </li><li> &quot;교정 관리&quot;메뉴에서 엘에게 평가하는 &quot;스프링 상수&quot;를 선택열적 변동을 이용하여 캔틸레버의 asticity. 캔틸레버의 스펙트럼 밀도 플롯을 얻기를 눌러 &quot;실행&quot;. 가장 낮은 주파수와 공진 피크를 찾을 수 있습니다. &quot;맞는 범위를 선택&quot;버튼을 사용하여 장착합니다. 주 1 :. 열 변동 조정에 대한 자세한 내용은 쿡 등 15 읽기 NOTE 2 : 이것은 (알려진 또는 강성 소재) 참조 캔틸레버를 이용하여 캔틸레버의 탄성을 평가하는 직접적인 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 여기에 사용 된 하나 친절하게 테프 Asnacios (16)에 의해 기증되었다. </li><li> 캔틸레버 끝에서 10 % 만니톨 용액 200 μl를 추가합니다. 미러를 사용한 포획의 중앙에 레이저를 재조정. </li><li> 감도를 재 보정 : &quot;교정 관리&quot;메뉴에서, &quot;알 수없는&quot;버튼을 클릭; 반복 2.5을 통해 2.3 단계를 반복합니다. </li></ol> . 5 데이터 수집 : 명백한 영률지도 제작 <ol&gt; <li> AFM 아래에 장착 된 샘플의 위치를​​ 샘플에 10 % 만니톨 용액 500 μL 방울을 추가합니다. 만니톨 용액 분 이내에 세포를 plasmolyzes. </li><li> 20 윈의 목표 힘 ( &quot;지점을 설정&quot;)에 접근 ( &quot;설정 포인트는&quot;3 개 이상 V이어야한다) </li><li> 200 윈의 &quot;상대 세트 포인트&quot;와 들여 쓰기, 40 μm의 / 초 &quot;속도를 확장&quot;, 5 ㎛, &quot;Z 길이&quot;. </li><li> 캔틸레버 또는 1 μm의 / 5 μm의 장착 캔틸레버 0.5 μm의 장착 뉴 멕시코 200 100 ㎚의 들여 쓰기를 얻기 위해 &quot;상대 설정치를&quot;조정합니다. </li><li> , 분열 조직을 위해, 해상도 64 X 64 ( &quot;픽셀&quot;)와 70 μm의 X 70 μm의 &quot;힘 매핑&quot;모드에서 스캔 할 영역을 선택 배축과 뿌리, 64 X 64의 해상도와 100 μm의 × 100 μm의. </li><li> 를 눌러 실험을 시작하기 위해 검사합니다. 출력을 저장합니다. </리&gt; </ol> . 6 데이​​터 분석 : 명백한 영의 계수 계산 <ol><li> 데이터 분석 소프트웨어로 데이터 파일을 연다. </li><li> 단일 맵의 모든 곡선에 같은 분석을 적용하는 &quot;일괄 처리&quot;를 선택합니다. </li><li> 그래서 압입 깊이를 추출하는 &quot;캔틸레버의 휨의 높이를 수정&quot;을 선택합니다. </li><li> 힘이 들여 쓰기의 영역에 비례 가정합니다 &quot;탄성 계수 맞는 기능&quot;을 선택합니다. 들여 쓰기 형태가 포물선이라고 가정 할 포물선하기 위해 &quot;팁 모양&quot;을 설정합니다. </li><li> 팁의 반경을 나타냅니다. </li><li> 는 &quot;확장&quot;곡선보다 지형에 덜 민감하기 때문에 우선적으로 분석을위한 &quot;후퇴&quot;커브를 선택합니다. 프로브의 중요한 고집이 동안이 경우, &quot;후퇴&quot;고집에 민감하다 &quot;확장&quot;곡선을 사용합니다. </li><li> 세트0.5 포아송 비. 눌러에서 분석하고 결과를 저장합니다. </li></ol>

<ol>
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A., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-chemical+aspects+of+organ+formation+in+Arabidopsis+thaliana:+the+relationship+between+auxin+and+pectin.">Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin.</a> PLoS. 8, e57813 (2013).</li><li>Asnacios, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanics+behind+cell+polarity.">The mechanics behind cell polarity.</a> Trends in cell biology. 22, 584-591 (2012).</li><li>Meister, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FluidFM:+combining+atomic+force+microscopy+and+nanofluidics+in+a+universal+liquid+delivery+system+for+single+cell+applications+and+beyond.">FluidFM: combining atomic force microscopy and nanofluidics in a universal liquid delivery system for single cell applications and beyond.</a> Nano letters. 9, 2501-2507 (2009).</li><li>Lintilhac, P. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+extraction+of+Arabidopsis+cell+turgor+pressure+using+nanoindentation+in+conjunction+with+finite+element+modeling.">In vivo extraction of Arabidopsis cell turgor pressure using nanoindentation in conjunction with finite element modeling.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 509-520 (2013).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

식물에서, 기계적 특성 변화는 성장 및 형태 형성을 연출에서 중요한 역할을한다. 현재까지이 식물 성장을 제어하는​​ 유전 및 화학 네트워크를 이루는에 큰 진전되고 있지만, 이러한 네트워크에 기여하고 기계적 특성의 변화에​​ 의해 영향을받는 방법에 대한 우리의 지식은 초보했다. 이 방법은이 공백을 채울 할 수있게해야하고, 그래서 식물의 성장이나 형태 형성의 모든 측면을 연구 과?...

식물의 성장은 유기체의 각각의 셀을 둘러싸 강성 세포벽 코디 팽창에 의해 달성된다. 증거를 축적하는 것은 식물이 로컬이 확장을 제어하는​​ 세포 벽 화학의 변경을 나타냅니다. 팽창은 셀의 높은 팽압 기인 셀벽에 변형에 의해 주로 구동되는 것으로 생각된다; 팽압이 변형 응답은 셀 벽 (1)의 기계적 특성에 의해 지배된다. 약간은 이러한 기계적 특성으로 알려져 있으며, 그들이 개발하는 동안 변경하는 방법. 더욱이 작은 이러한 기계적 특성은 피드백 명백하게 조직에 걸쳐 조정되는 방식으로 셀 벽 화학을 변경할지 여부를 올릴 제어되는 방법으로 알려져있다. 우리는 화학 및 기계적 개발 중에 식물 세포벽의 변화, 그리고 궁극적으로 이러한 방법에 미세한 상호 작용을 제어하는​​ 발전소 사이의 연결을 이해하는 경우에의 거시적 성장, 세포 또는 조직 규모로 장기를 개발하는 셀 벽의 기계적 특성을 모니터링 할 방법이 요구된다. 원자 힘 현미경 (AFM) 방법은 마이크로 미터 또는 나노 미터 티슈 압박 또는 만입 부에 기초하는, 기재, 세포 이하의 해상도에서 동시에 장기를 개발하고 조직의 전 영역에 걸쳐 세포 벽의 기계적 성질을 측정하기 위해 정밀하게 개발되었다. 다른 방법이 하나 너무 낮거나 너무 높은 해상도 : 신율은 밀리미터 규모 2-4, 초기 이벤트를 측정하기에 너무 큰 예를 들어 인 규모로 전체 조직의 평균 기계적 특성을 측정하기 만 할 수있다 기관 형성; microindenter는 나노 미터 스케일에서 세포 이하의 해상도로 측정 할 수 있지만, 고립 된 세포가 아닌 세포 또는 장기 5-7의 그룹을 측정으로 제한됩니다. AFM으로는 필요D 조직, 세포 및 세포 이하의 해상도는 8 ~ 10을 달성 할 수있다. 최근 여러 프로토콜도 11, 12을 사용할 수 식물 조직의 역학을 측정하기 위해 특별히 개발되었다. 우리는 명백 영률 (13)의 측정을 통해 조직의 탄성을 평가하는 방법을 여기에 제시한다. 영 모듈러스는 일반적으로 재료의 강성을 설명하는 데 사용된다. 작은 변형 중에 재료를 변형 시키는데 필요한 힘은 압입의 면적에 비례한다. 젊은 계수이 계수이다. 연속 균질 재료의 경우에는 동일 계수에 관계없이 압입 타입 (크기 및 형상)의 측정되지만 둘레의 속도로 변화 할 것이다. 식물 조직의 복잡한 구조의 경우에, 우리는 지금까지 힘이 판단을 허용하는 변형에 비례한다는 관찰우리가 &quot;명백한 젊은 계수&quot;의 이름을 비례 계수. 식물의 연속 MEDIAS에서 대조적으로,이 명백한 젊은 계수는 들여 쓰기의 크기에 민감합니다. 그것은 순수 세포벽의 젊은 계수에 대응하지 않는다. 그것은 최고의 조직의 세포 벽의 발판의 신축성을 설명합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="850">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AFM</td>
			<td style="width:348px;">JPK</td>
			<td style="width:119px;">NanoWizard</td>
			<td style="width:167px;">All the 3-generation are abele to do the work withe the same preferment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AFM stage</td>
			<td style="width:348px;">JPK</td>
			<td style="width:119px;">CellHesion</td>
			<td>Required for sample withe low topography (les then 11&#181;m between the lowest and the highest point in the aria of force scanning).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AFM optics</td>
			<td style="width:348px;">JPK</td>
			<td style="width:119px;">Top View Optics&#160;</td>
			<td>Very important in order to position the sample. Cold be replaces by long range a binocular or microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stereo Microscopes&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">M125</td>
			<td>Any type of stereo microscopes could do.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">150nm mounted cantilever&#160;</td>
			<td style="width:348px;">nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">R150-NCL-10</td>
			<td>To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">1&#181;m mounted cantilever&#160;</td>
			<td style="width:348px;">nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland</td>
			<td>SD-Sphere-NCH-S-10&#160;</td>
			<td>to measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tipless cantiliver</td>
			<td style="width:348px;">nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland</td>
			<td>TL-NCH-20&#160;</td>
			<td>to measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5&#181;m mounted cantilever. We attached a 5&#181;m borasilicate bead to a tipless cantiliver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5&#181;m silicon microspheres</td>
			<td style="width:348px;">Corpuscular</td>
			<td style="width:119px;">C-SIO-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aradilte&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Bartik S.A. 77170 Coubet France</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Aradilte for fixing the bead to the tip les cantiliver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;low melting Agarows</td>
			<td style="width:348px;">Fishersci Fair Lawn , new jersey 07410</td>
			<td style="width:119px;">BP160-100</td>
			<td>34-45 Gelation Temperature</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">D-Mannitol</td>
			<td style="width:348px;">Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St Louis Mo 63103 USA)</td>
			<td style="width:119px;">M4125-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">2&#160; Stainless Steel No. 5 Tweezers</td>
			<td style="width:348px;">Ideal-Tek 6828 Balerna Switzerland&#160;</td>
			<td align="right">951199</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

afm-based mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions

우리는 JPK AFM 위해, 원자 힘 현미경 (AFM)의 마이크로 / 나노 만입를 사용 식물 조직의 표면의 기계적 성질을 측정하기 위해 최근 개발 된 방법을 서술. 특히,이 프로토콜에서 우리는 꽃 분열 조직, 배축, 뿌리의 × 100 μm의 최대 100 μM의 지역에 걸쳐 세포 내 해상도에서 세포벽의 겉보기 탄성 계수를 측정한다. 이 샘플의주의 준비, 마이크로 압자 및 압입 깊이의 올바른 선택이 필요합니다. 단, 측정 셀 plasmolyze 따라서 세포 팽압의 기여를 제거하기 위해 만니톨의 고농도 용액으로 수행되어 세포벽 특성을 고려하여. 다른 현존하는 기술과 대조적으로, 다른 덴터 및 압입 깊이를 사용함으로써,이 방법은, 동시 다중 스케일의 측정을 허용 <em&gt; 세포 이하의 해상도에서와 조직을 포함하는 수백 개의 셀에 걸쳐 즉. 이 때문에 공간적, 시간적으로 성장 및 분화와 상관되는 이러한 변경을 가능하게 개발 중에 셀 벽의 기계적 특성에서 일어나는 변화를 특성화하는 것이 가능하다는 것을 의미. 이 조정 미세한 세포 변화가 거시적 인 형태 발생 이벤트를 가져올 방법을 이해하는 중요한 단계를 나타냅니다. 그러나, 몇 가지 제한 사항이 남아 있습니다 방법은 (직경 100 μm의 정도) 만 외부 조직에 매우 작은 샘플을 사용할 수 있습니다; 이 방법은 조직의 지형에 민감하다; 그것은 조직의 복잡한 기계적 특성의 특정 측면을 측정합니다. 기술이 급속도로 개발되고 있으며 이러한 제한의 가장 가까운 미래에 해결 될 가능성이있다.

그림 1에서 우리는 꽃 분열 조직의 전형적인 젊은 계수 맵 (그림 1A 및 1B), 젊은이와 노인 배축 (그림 1C-F), 및 루트 분열 조직 (그림 1G 및 1H)를 제시. 모든 실험에서 압자는 반구형이지만, 다른 공간 해상도를 달성 할 수 있도록 그 반경이 다른 1C 및 1D는 메조 나노 압입 (50 nm의 깊이)과 메조 나노 인...

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AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

셀 벽의 탄성 특성의 AFM 기반의 매핑 : 조직, 세포 및 세포 이하의 해상도에서

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

afm-based-mapping-elastic-properties-cell-walls-at-tissue-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K 조회수.  Université Paris Diderot. We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

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Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

굴지 공동 침강 분석, F - 굴지에 바인딩 단백질의 분석

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

연구

생물학

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

이중층 탄성 등록 정보 모니터링 변경에 대한 단일 분자 방법

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 2 부 : 탄수화물

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

1 채널의 세포 부착 된 패치 클램프 녹음

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

배양 된 HL-1 심방 근육 세포 단층의 전압 및 칼슘 듀얼 채널 광학 매핑

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called the auditory bulla houses the ossicles, whereas the auditory capsule encloses the inner ear, namely the cochlea and semicircular canals. Murine ossicles are essential for hearing and thus of great interest to researchers in the field of otolaryngology, but their metabolism, development, and evolution are highly relevant to other fields. Altered bone metabolism can affect hearing function in adult mice, and various gene-deficient mice show changes in morphogenesis of auditory ossicles in utero. Although murine auditory ossicles are tiny, their manipulation is feasible if one understands their anatomical orientation and 3D structure. Here, we describe how to dissect the auditory bulla and capsule of postnatal mice and then isolate individual ossicles by removing part of the bulla. We also discuss how to embed the bulla and capsule in different orientations to generate paraffin or frozen sections suitable for preparation of longitudinal, horizontal, or frontal sections of the malleus. Finally, we enumerate anatomical differences between mouse and human auditory ossicles. These methods would be useful in analyzing pathological, developmental and evolutionary aspects of auditory ossicles and the middle ear in mice.

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

출생 후의 쥐의 청각 수포의 해부 : 중이의 뼈와 조직 학적 분석의 분리

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Zebrafish 독도에서 단일 셀 해상도 칼슘 이미징 사용 하 여 베타 세포 기능 분석

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

세포 전 형 구조의 슈퍼 해상도 라이브 세포 이미징

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic properties. Density is a cell type identifying property, directly related to its metabolic rate, differentiation, and activation status. Magnetic levitation allows a one-step approach to successfully separate, image and characterize circulating blood cells, and to detect anemia, sickle cell disease, and circulating tumor cells based on density and magnetic properties. This approach is also amenable to detecting soluble antigens present in a solution by using sets of low- and high-density beads coated with capture and detection antibodies, respectively. If the antigen is present in solution, it will bridge the two sets&#160;of beads, generating a new bead-bead complex, which will levitate in between the rows of antibody-coated beads. Increased concentration of the target antigen in solution will generate a larger number of bead-bead complexes when compared to lower concentrations of antigen, thus allowing for quantitative measurements of the target antigen. Magnetic levitation is advantageous to other methods due to its decreased sample preparation time and lack of dependance on classical readout methods. The image generated is easily captured and analyzed using a standard microscope or mobile device, such as a smartphone or a tablet.

This paper describes a magnetic levitation-based method that can specifically detect the presence of antigens, either soluble or membrane-bound, by quantifying changes in the levitation height of capture beads with fixed densities.

자기 적고를 이용한 세포 밀도 및 항원 적 특성의 정량화

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...