我々は、多くの有用な議論のためにイヴCouderに特別な感謝を与える。私たちは、カンチレバーと議論のキャリブレーションのためのアテフAsnaciosに感謝します。我々は重要な読書のためにリサ·ウィリス、エリオットマイヤーウィッツ、そしてオリバーHamantに感謝します。この作品は、ヒューマン·フロンティア·サイエンス·プログラムグラントRGP0062/2005-Cによって部分的に資金を供給された。通信社国立·デ·ラ·ルシェルシュは&#39;&#39;&#39;&#39; Growpec、&#39;&#39;と&#39;&#39; Mechastemを投影する。

1。試料載用ガラススライドを準備<ol><li>アガロースメディアを埋め込む準備：10％マンニトール（水中）での0.7％低融点アガロースを。 </li><li>強力な金属器具（ 例えばドリル先端、ライム）を使用して、顕微鏡スライドガラスの中央にある0.5×0.5センチメートルの領域をエッチングする。またはその代わりに、アラルダイト接着剤を使用してスライドガラスにガラスラメラ（約20×200ミクロン）の小片を接着します。注：これはスライドにアガロースメディアスティックまたは修正のことを確認するためにアガロースの付着を容易にするために、表面を粗くする。このスライドは、再利用することができます。 </li><li>スライドガラスのエッチングされた領域の上にアガロースメディアを埋め込む約20μlの液滴を配置します。これは、アガロースの薄膜を提供します。 </li><li>湿度の高いボックス内のガラススライドを保存し、アガロースメディアが固化するのを待ちます。 </li></ol> 2。分裂組織のサンプルを解剖し、取付<ol><li>共焦点想像力のための顕微解剖分裂組織NG：超微細ピンセットでそれらを引いて、茎から花芽を一つずつ削除してください。それは、がく片（ すなわち 、P1の原基14）を示さない芽までのすべての花芽を除去することが重要である。 </li><li>かみそりの刃やピンセットの先端を使って、離れて茎から分裂組織をカット。カットはAFMを用いて測定される分裂組織表面の領域に平行であるべきである。得られた頂点は300ミクロンとAFMチップの下に収まるように高さ600μmの間であるべきである。 </li><li>ステップ1.1.4で調製したアガロースメディアのフィルムに頂点を押し込みます。ガラススライド/アガロース上の位置を選択し、分裂組織は、スライドガラスに接触して、直接的であり、アガロースから突出するようなゆっくりと押し込みます。これは、茎からのカットに従って数秒以内にアガロース中分裂組織を配置することが重要である。注：これは、分裂組織からの乾燥を防止するためである。この段階では、分裂組織は、CRACに立ってされますアガロースは、圧力を加えると破断のでkである。 </li><li>彼らは同じ高さのものであり、スライドに互いに500μm未満に位置していることを条件に、バッチ画像化のために、いくつかの分裂組織をこのように準備します。さらにサンプルを解剖しながら、湿度の高いボックスで作成分裂組織を維持する。 注：キャリブレーションからの変化を制限します。各条件の理想的に2サンプルを調製し、無作為に測定することができる。これまでの測定（ストレス誘発性応答）上のバッチ·イメージングの無影響はありません。これは、寒天および/または取り付け、溶液中のストレスシグナル伝達分子の希釈のおかげである可能性があります。代わりにストレス応答に関係なく、用意されたサンプルの量に同じです。 </li><li>次のステップに移る前に、分裂組織及び花芽の境界が乾燥していることを確認してください。そうでない場合、穏やかに濾紙を用いて余分な水分を除去する。これは溶け、次のステージに防ぐ必要がありますアガロース毛管力によるサンプルをフラッディングします。 </li><li> 20μlのピペットを用いて、ステップ1.2.3で作成した亀裂を埋めるために、アガロース取り付け溶融十分を追加します。各分裂組織を取り囲むように。アガロースは、削除された花芽（原基）の瘢痕のレベルに達する必要があります。これを達成するためには、亀裂の各端部にアガロースを添加する必要があり得る。 </li><li>アガロースを添加する場合、それはすぐにクラック内にフラッディングし;ピペットを用いて、溶融分裂組織がスライド上の最高点であることを保証するために、アガロースマウントの一部を吸う。それは撮像中に移動できないようにするためには、成長点が修正されています。 </li></ol> 3。取付ルートまたは胚軸サンプル<ol><li>根と胚軸の場合は、何解剖は必要ありません。準備されたスライドガラス上のアガロースの薄膜では、直接ガラスエッチングの上やガラスラメラに沿っていずれかの溝を作る。それが接触していることを保証する、この溝のルートや胚軸を置きその全長に沿ってガラス。 </li><li>次のステップに進む前に、サンプルがその表面に乾燥していることを確認してください。そうでない場合は、ゆっくりと、ろ紙を用いて水の過剰を取り除く。 </li><li>追加ステップ1.2.6のように、試料周辺のアガロース取り付け溶融。 </li></ol> 4。原子間力顕微鏡の準備と感度校正（JPK Nanowizard AFM用） <ol><li> AFMにカンチレバーをマウントします。カンチレバーは丸い形の圧子を装着しなければならない。半径のx、y、zの分解能と正確な測定をアーカイブすることができた時の押し込み深さを決定する。 <ol><li>表皮の表面にメソスケールの測定を行うために、半径50nmの丸い圧子を使用します。メソスケールの測定値を取るために、0.5μmの半径ラウンド圧子を使用します。 （2-3セル間）マイクロスケールの測定値を取るために、2.5μmの半径ラウンド圧子を使用しています。 </li></ol></li><li>カンチレバーの先端にレーザーを配置します。中央にレーザーの位置を合わせますミラーを用いキャプターの。 </li><li>原子間力顕微鏡の下にきれいなガラスを配置します。 注：以下は、カンチレバーの変形に原子間力顕微鏡の受容体上のレーザー位置の信号を変換するように設定して、カンチレバーのバネ定数を評価することによって、力に翻訳することです。 </li><li> 1 Vの目標力」セットポイント」とアプローチ</li><li> 「力分光法」を選択します。 2 Vまで最大「相対セットポイント」を設定することで、インデントを行い、40ミクロ​​ン/秒に「スピードを引き出す」、および5μmで「Z長」。 </li><li> 「キャリブレーションマネージャ」メニューから、「フィット範囲を選択」ボタンを使用して感度に合わせて前進曲線の直線部分を選択します。 「相対セットポイント」は、「メートル」に「ボルト」から変換する必要があります。 </li><li> 「キャリブレーションマネージャ」メニューから、ELを評価するために、「ばね定数」を選択熱揺らぎを利用しカンチレバーのasticity。カンチレバーのスペクトル密度プロットを取得するために押して「ファイル名を指定して実行」。最も低い周波数で共振ピークを見つける。 「フィット範囲を選択」ボタンを使用して、それに合う。 注1：熱変動のチューニングの詳細については、Cook ら 15を読む 注2：これは、（既知の剛性を有する材料または）基準カンチレバーを用いてカンチレバーの弾力性を評価するために直接法を用いることが好ましい。ここで使用する1は親切にアテフAsnacios 16から寄贈された。 </li><li>カンチレバー先端の下で10％マンニトール溶液200μlを加える。ミラーを用いた捕獲の中央にレーザーを再調整。 </li><li> 「キャリブレーションマネージャ」メニューから、「不明」ボタンをクリックしてください。：感度を再調整繰り返します2.5に至るまで2.3を繰り返します。 </li></ol> 5データ収集：見かけのヤング率地図作成<ol&gt; <li>原子間力顕微鏡の下に取り付けられた試料を置き、試料上に10％のマンニトール溶液500μl滴を追加します。マンニトール溶液は数分以内に細胞をplasmolyzes。 </li><li> 20 NNの目標力（「設定値」）とのアプローチ（「セットポイント」は3 V以上にはなりません） </li><li> 200 NNの「相対的なセットポイント」とインデントは、40ミクロ​​ン/秒の「速度を引き出す」、および5μmの「Z長」。 </li><li>カンチレバーマウントまたは1ミクロン/ 5以下のため0.5μmのカンチレバーを搭載し200nmで、100ナノメートルのインデントを得るためには、「相対的なセットポイント」を調整してください。 </li><li> ;分裂組織に、解像度64×64の（「ピクセル」）と70ミクロンX 70ミクロン：「強制マッピング」モードでは、スキャンする地域を選択胚軸と根のため、64×64の解像度を持つ100ミクロン×100ミクロン。 </li><li>を押して、実験を起動するためにスキャンします。出力を保存します。 </李&gt; </ol> 6データ解析：見かけのヤング率の計算<ol><li>データ解析ソフトウェアにデータファイルを開きます。 </li><li>単一のマップのすべての曲線に同じ分析を適用するために、「バッチ処理」を選択します。 </li><li>その押し込み深さを抽出する &quot;カンチレバーの曲げのための高さを修正する」を選択します。 </li><li>力はインデントの面積に比例すると仮定します &quot;ヤングフィット関数」を選択します。インデントの形状が放物線であることを前提とする放物線する「先端形状」を設定します。 </li><li>先端の半径を示している。 </li><li>それは、 &quot;拡張&quot;曲線よりも地形の影響を受けにくいため、優先的に分析するため、「後退」曲線を選択します。プローブの重要な固着が中に存在する場合は、「後退、「固着の影響を受けない「延長」曲線を使用しています。 </li><li>セット0.5ポアソン比。出力を分析し、保存を押します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+in+vitro+extensibility+of+growing+plant+cell+walls.">Measuring in vitro extensibility of growing plant cell walls.</a> Methods in molecular biology. 715, 291-303 (2011).</li><li>Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+plant+cell+wall+extension+(creep)+induced+by+acidic+pH+and+by+alpha-expansin.">Measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic pH and by alpha-expansin.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , 1263 (2009).</li><li>Durachko, D. a. n. i. e. l. M., C, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Plant+Cell+Wall+Extension+(Creep)+Induced+by+Acidic+pH+and+by+Alpha-Expansin.">Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin.</a> J. Vis. Exp.. , 25 (2009).</li><li>Suslov, D., Verbelen, J. 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A., Hofte, H., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+mechanical+contributions+of+the+pectin+matrix:+Insights+for+cell+growth.">Probing the mechanical contributions of the pectin matrix: Insights for cell growth.</a> Plant signaling &amp; behavior. 7, 1037-1041 (2012).</li><li>Routier-Kierzkowska, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+force+microscopy+for+in+vivo+measurements+of+plant+tissue+mechanics.">Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics.</a> Plant physiology. 158, 1514-1522 (2012).</li><li>Agudelo, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TipChip:+a+modular,+MEMS-based+platform+for+experimentation+and+phenotyping+of+tip-growing+cells.">TipChip: a modular, MEMS-based platform for experimentation and phenotyping of tip-growing cells.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 1057-1068 (2013).</li><li>Miedes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xyloglucan+endotransglucosylase/hydrolase+(XTH)+overexpression+affects+growth+and+cell+wall+mechanics+in+etiolated+Arabidopsis+hypocotyls.">Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH) overexpression affects growth and cell wall mechanics in etiolated Arabidopsis hypocotyls.</a> Journal of experimental botany. 64, 2481-2497 (2013).</li><li>Byrne, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+leaves1+mediates+leaf+patterning+and+stem+cell+function+in+Arabidopsis.">Asymmetric leaves1 mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis.</a> Nature. 408, 967-971 (2000).</li><li>Cook, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+implementation+of+dynamic+methods+for+measuring+atomic+force+microscope+cantilever+spring+constants.">Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants.</a> Nanotechnology. 17, 20135-22145 (2006).</li><li>Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creep+function+of+a+single+living+cell.">Creep function of a single living cell.</a> Biophysical journal. 88, 2224-2233 (2005).</li><li>Peaucelle, A., Braybrook, S., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+mechanics+and+growth+control+in+plants:+the+role+of+pectins+revisited.">Cell wall mechanics and growth control in plants: the role of pectins revisited.</a> Frontiers in plant science. 3, 121 (2012).</li><li>Mittler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+signaling:+the+new+wave.">ROS signaling: the new wave.</a> Trends in plant science. 16, 300-309 (2011).</li><li>Braybrook, S. A., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-chemical+aspects+of+organ+formation+in+Arabidopsis+thaliana:+the+relationship+between+auxin+and+pectin.">Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin.</a> PLoS. 8, e57813 (2013).</li><li>Asnacios, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanics+behind+cell+polarity.">The mechanics behind cell polarity.</a> Trends in cell biology. 22, 584-591 (2012).</li><li>Meister, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FluidFM:+combining+atomic+force+microscopy+and+nanofluidics+in+a+universal+liquid+delivery+system+for+single+cell+applications+and+beyond.">FluidFM: combining atomic force microscopy and nanofluidics in a universal liquid delivery system for single cell applications and beyond.</a> Nano letters. 9, 2501-2507 (2009).</li><li>Lintilhac, P. M., Wei, C., Tanguay, J. J., Outwater, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ball+tonometry:+a+rapid,+nondestructive+method+for+measuring+cell+turgor+pressure+in+thin-walled+plant+cells.">Ball tonometry: a rapid, nondestructive method for measuring cell turgor pressure in thin-walled plant cells.</a> Journal of plant growth regulation. 19, 90-97 (2000).</li><li>Kroeger, J. H., Zerzour, R., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulator+or+driving+force?+The+role+of+turgor+pressure+in+oscillatory+plant+cell+growth.">Regulator or driving force? The role of turgor pressure in oscillatory plant cell growth.</a> PloS one. 6, e18549 (2011).</li><li>Forouzesh, E., Goel, A., Mackenzie, S. A., Turner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+extraction+of+Arabidopsis+cell+turgor+pressure+using+nanoindentation+in+conjunction+with+finite+element+modeling.">In vivo extraction of Arabidopsis cell turgor pressure using nanoindentation in conjunction with finite element modeling.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 509-520 (2013).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

植物では、変化する機械的特性は、成長や形態形成を演出に大きな役割を果たしている。これまでに存在し、植物の成長を制御する遺伝的および化学的なネットワークの解明に大きな進歩であったが、これらのネットワークはに貢献し、機械的性質の変化によってどのような影響を受けるかについての我々の知識は、初歩的でもあります。このメソッドは、このギャップを埋めるために私た?...

植物における成長は、各々を取り囲む硬質細胞壁の協調膨張および生物のあらゆる細胞によって達成される。証拠が蓄積することは、植物が局所的にこの膨張を制御すること、細胞壁の化学的性質の改変によるものであることを示している。膨張は、細胞の高い膨圧によって引き起こされる、セル壁に株によって主に駆動されると考えられている;膨圧この歪み応答は、細胞壁1の機械的特性によって支配される。少しは、これらの機械的特性が知られており、それらは開発中にどのように変化するか。さらには、これらの小さな機械的特性を制御する方法で明らかにし、この組織を横切って調整されるようにして細胞壁の化学的性質を変化させるために貢献するかどうかは知られている。我々は、開発中に、植物細胞壁中の化学的および機械的変化との間の接続を理解することであり、これらの微視的な相互作用は、プラントを管理する場合には、最終的にどのようにの巨視的成長、細胞または組織スケールでの臓器の開発における細胞壁の機械的特性を監視することができる方法が必要とされる。 原子間力顕微鏡（AFM）マイクロメートルまたはナノメートルの組織の圧迫又はくぼみに基づいてここで説明する方法は、正確に細胞下解像度で同時に臓器の開発に組織の全領域にわたって細胞壁の機械的特性を測定するために開発された。伸びは、ミリメートルスケール2-4における全組織の平均的な機械的特性を測定することができるだけであり、例えばにおける初期事象を測定するには大きすぎる規模：他の方法が低すぎたり高すぎる解像度のいずれかを有する器官形成; microindenterは、ナノメートルスケールでの細胞内の分解能で測定を行うことができますが、単離した細胞ではない細胞または器官5-7のグループの測定に限定されている。 AFMで、必要とするdは、組織、細胞、および細胞下解像度は8-10達成することができる。最近、いくつかのプロトコルはまた、11、12を用いることができる植物組織の力学を測定するために特別に開発されてきた。 私たちは、見かけのヤング率13の測定により組織の弾力性を評価する方法をここに紹介します。 ヤング率は、一般に材料の剛性を説明するために使用される。微小変形中に材料を変形させるのに必要な力は、くぼみの面積に比例する。ヤング率は、この係数である。連続均質な材料の場合には同一の係数に関係なくインデントの種類（サイズと形状）の測定されますが、測定の速度で変化します。植物組織の複雑な構造の場合、我々はこれまで力判定を可能にする変形に比例することを観察した我々は「見かけヤング &quot;という名前を比例係数。植物中の連続メディアからこれとは対照的に、この見かけヤング率は、インデントの大きさに敏感である。それは、純粋な細胞壁の若いモジュラスに対応していない。それは最高の組織の細胞壁の足場の弾力性を説明しています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="850">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AFM</td>
			<td style="width:348px;">JPK</td>
			<td style="width:119px;">NanoWizard</td>
			<td style="width:167px;">All the 3-generation are abele to do the work withe the same preferment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AFM stage</td>
			<td style="width:348px;">JPK</td>
			<td style="width:119px;">CellHesion</td>
			<td>Required for sample withe low topography (les then 11&#181;m between the lowest and the highest point in the aria of force scanning).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AFM optics</td>
			<td style="width:348px;">JPK</td>
			<td style="width:119px;">Top View Optics&#160;</td>
			<td>Very important in order to position the sample. Cold be replaces by long range a binocular or microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stereo Microscopes&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">M125</td>
			<td>Any type of stereo microscopes could do.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">150nm mounted cantilever&#160;</td>
			<td style="width:348px;">nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">R150-NCL-10</td>
			<td>To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">1&#181;m mounted cantilever&#160;</td>
			<td style="width:348px;">nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland</td>
			<td>SD-Sphere-NCH-S-10&#160;</td>
			<td>to measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tipless cantiliver</td>
			<td style="width:348px;">nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland</td>
			<td>TL-NCH-20&#160;</td>
			<td>to measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5&#181;m mounted cantilever. We attached a 5&#181;m borasilicate bead to a tipless cantiliver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5&#181;m silicon microspheres</td>
			<td style="width:348px;">Corpuscular</td>
			<td style="width:119px;">C-SIO-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aradilte&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Bartik S.A. 77170 Coubet France</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Aradilte for fixing the bead to the tip les cantiliver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;low melting Agarows</td>
			<td style="width:348px;">Fishersci Fair Lawn , new jersey 07410</td>
			<td style="width:119px;">BP160-100</td>
			<td>34-45 Gelation Temperature</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">D-Mannitol</td>
			<td style="width:348px;">Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St Louis Mo 63103 USA)</td>
			<td style="width:119px;">M4125-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">2&#160; Stainless Steel No. 5 Tweezers</td>
			<td style="width:348px;">Ideal-Tek 6828 Balerna Switzerland&#160;</td>
			<td align="right">951199</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

afm-based mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions

我々は、JPK AFMのために、原子間力顕微鏡（AFM）マイクロ/ナノくぼみを用いて植物組織の表面の機械的特性を測定するために、最近開発された方法を記載している。具体的には、このプロトコルでは、我々は花の分裂組織、胚軸および根×100ミクロンまで100μmの地域間で細胞内の解像度で細胞壁の見かけのヤング率を測定します。これは、サンプルの慎重な準備、マイクロ圧子とインデントの深さを正確に選択する必要があります。唯一の細胞壁の特性を考慮して、測定は、細胞を原形質分離を起こさせる、従って、細胞膨圧の寄与を除去するために、マンニトールの高濃度溶液中で行われる。 他の現存の技術とは対照的に、別の圧子の押し込み深さとを用いて、この方法は、マルチスケール同時測定を可能にする<em&gt;細胞下解像度で組織を含む細胞の数百横切って、すなわち。これは、空間的時間的に増殖および分化と相関することが、これらの変更を可能にする、開発中に、細胞壁の機械的特性で起こる変化を特徴付けることが可能であることを意味する。これは協調顕微鏡的細胞変化が巨視的形態形成のイベントをもたらすかを理解するために重要なステップを表します。 しかし、いくつかの制限が残っているこの方法はかなり小さな試料（直径100ミクロン程度）にして、外部の組織にのみ使用することができます。方法は、組織地形の影響を受けやすいです。それは、組織の複雑な機械的特性のみ特定の側面を測定します。技術が急速に開発されており、これらの制限のほとんどは、近い将来に解決される可能性がある。

図1において、我々は花の分裂組織（ 図1Aおよび1B）、老いも若きも胚軸（ 図1C-F）、および根分裂組織（ 図1G及び1H）の代表的なヤングモジュラスマップを提示する。全ての実験において圧子は、半球状であるが、異なる空間解像度が達成できるように、その半径が異なり1Cおよび1Dは、メソ...

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AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

細胞壁の弾性特性のAFMベースのマッピング：ティッシュ、携帯電話、および細胞内の解像度で

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.8K ビュー.  Université Paris Diderot. We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

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Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

アクチン共沈降アッセイ、F -アクチンへの結合タンパク質の解析のための

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

生物学

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

二層弾性特性の変化をモニタリングするための単一分子法

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

植物細胞壁の包括的な組成分析（リグノセルロース系バイオマス）パートII：炭水化物

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

一チャネルセル付パッチクランプ法

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

ネズミ弁内皮細胞の単離

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

培養HL-1心房筋細胞単層の電圧とカルシウムデュアルチャネル光学マッピング

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called the auditory bulla houses the ossicles, whereas the auditory capsule encloses the inner ear, namely the cochlea and semicircular canals. Murine ossicles are essential for hearing and thus of great interest to researchers in the field of otolaryngology, but their metabolism, development, and evolution are highly relevant to other fields. Altered bone metabolism can affect hearing function in adult mice, and various gene-deficient mice show changes in morphogenesis of auditory ossicles in utero. Although murine auditory ossicles are tiny, their manipulation is feasible if one understands their anatomical orientation and 3D structure. Here, we describe how to dissect the auditory bulla and capsule of postnatal mice and then isolate individual ossicles by removing part of the bulla. We also discuss how to embed the bulla and capsule in different orientations to generate paraffin or frozen sections suitable for preparation of longitudinal, horizontal, or frontal sections of the malleus. Finally, we enumerate anatomical differences between mouse and human auditory ossicles. These methods would be useful in analyzing pathological, developmental and evolutionary aspects of auditory ossicles and the middle ear in mice.

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

生後マウスにおける聴覚ブラの解剖：中耳の骨の単離および組織学的解析

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

ゼブラフィッシュ ランゲルハンス島における単一セルの解像度カルシウム イメージングを用いた β-細胞機能の解析

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

細胞下構造の超分解能ライブ細胞イメージング

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic properties. Density is a cell type identifying property, directly related to its metabolic rate, differentiation, and activation status. Magnetic levitation allows a one-step approach to successfully separate, image and characterize circulating blood cells, and to detect anemia, sickle cell disease, and circulating tumor cells based on density and magnetic properties. This approach is also amenable to detecting soluble antigens present in a solution by using sets of low- and high-density beads coated with capture and detection antibodies, respectively. If the antigen is present in solution, it will bridge the two sets&#160;of beads, generating a new bead-bead complex, which will levitate in between the rows of antibody-coated beads. Increased concentration of the target antigen in solution will generate a larger number of bead-bead complexes when compared to lower concentrations of antigen, thus allowing for quantitative measurements of the target antigen. Magnetic levitation is advantageous to other methods due to its decreased sample preparation time and lack of dependance on classical readout methods. The image generated is easily captured and analyzed using a standard microscope or mobile device, such as a smartphone or a tablet.

This paper describes a magnetic levitation-based method that can specifically detect the presence of antigens, either soluble or membrane-bound, by quantifying changes in the levitation height of capture beads with fixed densities.

磁気浮上を用いた細胞密度と抗原特性の定量化

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...