우리는 인물의 준비 노력이 원고를 준비하는 그녀의 도움 에이미 Thomasson, 그리고 프레드릭 Skarstedt 라이언 크리스티을 인정합니다.

임상 시험 심사위원회의 승인을 받아, 전자 실험실 데이터베이스의 검색은 위장에서 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 감염 사례 조직 병리학 진단 (GI) 생검 (헤 마톡 실린을 나타내는 (FFPE) 블록 및 임베디드 포르말린 고정, 파라핀을 확인하기 위해 수행되었다 에오신 (H &amp; E) 및 / 또는 면역 조직 화학 (IHC)). FFPE GI 생검 조직에서 1. 조직 처리 <ol><li> 사이토 메갈로 바이러스 (CMV)에 대한 FFPE GI 생검 조직 블록을 상환 정량 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에). 이러한 블록을 실온에서 저장된다. </li><li> 블록의 고유 한 식별 번호와 함께 사전 라벨 1.7 밀리리터의 microfuge 튜브. </li><li> 마이크로톰 핸드 휠을 잠급니다. </li><li> 카세트 클램프로 조직 블록 좌석. </li><li> 신선하지 않는 블레이드를 사용하여 마이크로톰에 칼 각도로 블록을 맞 춥니 다. </li><li> 10 μm의 두께 부분을 잘라 마이크로톰을 조정합니다. </li><li> 일의 잠금을 해제전자 핸드 휠 미리 블레이드를 향해 블록. </li><li> 각각의 컷이 조직의 스크롤에 출시 할 수 있도록, 10 μm의 두께 간격으로 블록의 5 부분을 잘라냅니다. 각 스크롤 원하는 생검 조직의 적절한 표현이 포함되어 있는지 확인합니다. </li><li> 마이크로톰 핸드 휠을 잠급니다. </li><li> 포셉으로 만 교차 오염 가능성을 줄이기 위해 파라핀으로 스크롤을 조작주의하면서, 미리 라벨링 원심 분리기 튜브에 조직의 모든 5 스크롤을 배치합니다. 튜브에 뚜껑을 스냅 랙에 다시 배치합니다. </li><li> 마이크로톰에서 조직 블록을 제거합니다. </li><li> 제거하고 잎을 버린다. </li><li> 이전의 조직과 접촉 할 수있는 어떤 표면 또는 장비의 오염을 제거. </li><li> 칼 홀더에 신선한, 사용하지 않는 날을 놓습니다. </li><li> 반복 처리 할 각 추가 블록 1.4-1.14 단계를 반복합니다. 티슈 두루마리 함유의 microfuge 튜브 포까지 실온에서 저장 될 수있다DNA 추출의 전자. </li></ol> FFPE GI 생검 조직의 스크롤 2. DNA 추출 참고 :이 프로토콜이 FFPE 조직의 DNA 추출 키트 (: 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조주의)의 패키지 삽입에서 적응됩니다. <ol><li> 각 샘플의 미세 튜브에 1 ㎖의 크실렌 (MSDS를 참조하십시오주의)를 추가합니다. 적극적으로 10 초 동안 뚜껑과 소용돌이를 닫습니다. </li><li> 구체적으로 다음과 같은 수정과 제조업체의 제품 삽입에 설명 된 DNA 추출을 진행합니다. </li><li> 먼저 각각의 미세 튜브 내부 통제 (IC)의 6 μl를 추가합니다. <ol><li> 1 시간 동안 56 ° C에서 ATL / 단백질 분해 효소 K 용해 배양 한 다음, 1 시간 30 분 동안 99 ° C에서보다는 90 ° C를 품어. </li><li> 최종 DNA 용출 단계 동안, 정중 DNA 정화 컬럼의 뚜껑을 열고 오히려 buffe보다 막의 중앙에 50 μL DNase의 증류 / RNase가없는 물을 적용R은 ATE. 주 : 해당 스토리지 및 시약의 준비를위한 패키지 안내서를 참조하십시오. DNA는 5 FFPE 스크롤에서 추출해야합니다. 실내 온도 (15-25 ℃)에서 모든 원심 분리 단계를 수행합니다. </li></ol></li></ol> CMV 3. qPCR에 <ol><li> 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 프로 시저 <ol><li> CMV 분석 실행을위한 엑셀 PCR 워크 시트를 생성합니다. 이 Excel 워크 시트는 마그네슘과 마스터 믹스를 만들기 위해 필요한 각 시약의 총 금액을 계산합니다. 이 샘플 당 필요한 각 시약의 양을 아래 나열된 배 샘플 및 컨트롤의 수와 곱 하나 (때문에 피펫으로 손실을 보상하기 위해). <ol><li> 양의 각 PCR 반응에 다음과 같은 시약은 표시 다음을 포함한다 : 시약0; 샘플 당 금액 CMV의 LC 마스터 믹스 유리 병 12.5 μL MG 솔루션 노란색 유리 병 2.5 μL 총 양 15.0 μL </li></ol></li><li> 물이나없는 대상 컨트롤 (NTC), 음성 대조군, 낮은 양성 대조군, 높은 긍정적 인 제어, QS3 또는 QS4 하나, 모든 환자의 샘플을, 모든 분석에 포함 실행합니다. 모세 혈관의 순서로 설정해야합니다. </li><li> 4 ℃에서 저장되는 실시간 PCR 기기의 냉각 블록 별을 얻 냉각 블록에 적합한 모세관 튜브를 놓습니다. 모세관 튜브의 표면을 만지지 마십시오. 모세 혈관을 취급 할 때는 항상 장갑을 사용합니다. </li><li> 증폭 생산에 오염되지 않은 깨끗한 후드의 모든 중합 효소 연쇄 반응을 설정TS. <ol><li> 모든 환자 샘플, 플러스 5 컨트롤을 테스트하기 위해 PCR 키트에서 마스터 튜브의 정확한 수를 제거합니다. 하자 마스터 유리 병, 마그네슘 용액 냉각 블록 PCR 등급 물 해동. 각 마스터 유리 병 (12) 시험에 대한 충분한 시약이 포함되어 있습니다. </li><li> 조심스럽게 마스터 유리 병 와동 빠른 최대 속도로 원심 분리기를 회전. </li><li> 하나의 유리 병에 각 마스터 유리 병의 내용을 결합하고 다시 부드럽게 소용돌이. </li><li> 하나의 멸균의 microfuge 튜브에 PCR 워크 시트에 표시된 금액의 마스터 믹스와 마그네슘의 솔루션을 결합합니다. </li><li> 정량 표준 (QS)입니다 위치 5 모세관을 제외하고, 각 모세관 튜브에 부드럽게 나누어지는 마그네슘과 마스터 믹스 15 μl를 섞는다. </li></ol></li><li> 깨끗한 후드에서 처리 후드 Mg를 모세관 및 마스터 믹스를 함유하는 냉각 블록을 이동. </li><li> 마스터의 나머지 30 μL에 내부 통제의 2 μL (IC)를 추가Mg를 섞는다. 위치 5 모세관 (QS에 대한 위치)에 부드럽게 나누어지는 15 μl를 섞는다. </li><li> 물 피펫 10 μL은 해당 모세관 튜브에 DNA, 또는 샘플의 DNA를 제어 할 수 있습니다. 캐핑 도구를 사용하여 모세관 튜브를 모자. </li><li> 실시간 PCR 기기에 블록 / 샘플을 냉각 가라. </li></ol></li><li> 실시간 PCR 장비를 프로그램 (표 1 참조) </li><li> 증폭과 검출은 실시간 PCR 기기에서 수행 <ol><li> 컴퓨터에 로그온 </li><li> 두 악기 아이콘을 클릭하고 소프트웨어에 로그인합니다. </li><li> 실시간 PCR 기기를 켭니다 </li><li> 전면 화면에서 &quot;CMV / EBV&quot;를 클릭하십시오. </li><li> 매크로 마법사의 지시를 따릅니다. </li><li> 소프트웨어에서 메시지가 표시되면 자체 테스트를 실행하는 상자를 선택합니다. 자체 테스트 기기를 사용하고있는 각각 하루에 한 번 수행해야합니다. </li><li> 실행의 이름을 지정합니다. </li><li> LEF 상부에 위치한 샘플 개수를 조정컨트롤과 환자의 합계 페이지 t 코너는 실행에 포함 된 각각의 환자 샘플의 식별 번호를 입력합니다. </li><li> &quot;애비 양의&quot;탭을 클릭합니다. </li><li> &quot;샘플 유형&quot;에서 표준에 해당하는 샘플의 유형을 지정합니다. </li><li> 정량 표준 (QS)의 예상 농도를 입력합니다. </li><li> 쿨러 블록에서 모세관 튜브를 제거하고 (블록 샘플 중 1 냉각 등, 회전 목마에 위치 # 1에 배치해야합니다) 회전 목마의 해당 위치에 배치합니다. </li><li> 악기의 원심 분리기를 눌러 시작으로 회전 목마를 놓습니다. </li><li> 원심 분리기를 열고 회전 목마를 제거합니다. </li><li> 실시간 PCR 기기에 회전 목마를 놓습니다. 뚜껑을 닫습니다. </li><li> 을 눌러 &quot;시작 실행&quot;. </li><li> 실시간 PCR 악기 샘플은 각각의 위치를​​ 확인합니다. 이 검사가 완료 될 때까지 악기에서 멀리 떨어진 곳에서 걷지 않는다 ESPE모세관의 하나가 컨베이어에없는 경우 cially. 악기는이를 기록하고 실행이 계속 될 경우 요청합니다. 떠나기 전에 예라고 응답. </li><li> 실행이 완료되면, 생성 된 보고서를 닫습니다. </li><li> &quot;절대 정량&quot;을 클릭합니다. </li><li> 다음 색상 보정에있는 화살표를 클릭합니다. </li><li> 드롭 다운 상자에서 &quot;색상 선택 보상&quot;을 클릭합니다. </li><li> 실행에 적용 할 최신 색 보정 파일을 선택합니다. </li><li> 상자가 뜨면 확인을 클릭합니다. </li><li> 표준 곡선의 화살표를 클릭합니다. </li><li> 드롭 다운 메뉴에서 &quot;외부 사용&quot;을 선택합니다. </li><li> 가장 최근의 외부 표준 곡선 파일을 선택한 다음 확인을 클릭합니다. </li><li> 농도가 할당되어있는 경우 곡선이 존재하지 일직선를 보장하기 위해 절대 정량 메뉴의 각 곡선 봐. 705/Back (530)의 절대 정량이 자동으로 분석됩니다. </li></ol></li><li> 숨어품 질 관리 <ol><li> 어느 쪽이든 더 자주하는 쪽을 택 시약의 새로운 로트 번호가 수신 될 때마다 새로운 표준 곡선, 또는 6 개월마다, 생성합니다. </li><li> 마그네슘과 마스터 믹스에 각 표준의 10 μl를 추가합니다. 이전에 추출 된 DNA와 키트에 포함 된 기준을 고려한다. </li><li> 마그네슘은 정확한 정량을 보장하기 위해 표준 곡선을 생성하는 데 사용과 마스터 믹스에 각 표준에 대한 내부 통제의 1 μl를 추가합니다. 아니 템플릿 컨트롤 (NTC)에 대한 밀리그램 마스터 믹스에 IC를 추가하지 마십시오. </li><li> 16 데이터 포인트에 달하는, NTC 및 정량 표준 QS 4, 3, 2, 1, 표준 곡선을 생성하기위한 실행 QS4의 1:10 희석의 세 개의 반복을 준비한다. </li><li> 반복 된 표준에 대한 드롭 다운 메뉴 &quot;의 복제&quot;를 선택합니다 </li><li> 채널 530/back의 없음을 선택하고 실행을 분석 할 때 색 보정을 켜 </li><li> &quot;(런) 표준 곡선&quot;에서 &quot;선택 전으로 저장영원한 &quot;곡선의 이름을 지정합니다. 저장할 때 &quot;표준 곡선으로 적용&quot;주석을 입력합니다. </li><li> 결과를 그래프. 그 결과 선형 계수는 0.81 ≥해야합니다. </li><li> 매일 실행의 경우, 런타임에서 컨트롤로 QS3 또는 QS4의 복사본을 포함한다. 현재 외부 표준 곡선은 분석 단계에서 실행으로 가져올 수있다. </li><li> 실행 관리 : DNA 제어, 음성 대조군, 낮은, 높은 양을 제어합니다. 예상 바이러스 부하가 결정하고 각 공급 업체 및 로트 번호에 따라 조정된다. </li><li> 각 샘플에 IC를 추가하고 DNA를 추출하는 동안 제어 할 수 있습니다. </li><li> 컨트롤의 범위 밖으로 떨어질 경우, 받아 들일 수없는 결과를 기록하고, 문제 해결에 대한 분석을 참조하십시오. </li></ol></li><li> 컨트롤의 주파수 <ol><li> NTC, 음, 낮은 양, 양의 높은, 및 표준 제어 : 모든 실행에 포함. </li></ol></li></ol> 참고 : 컨트롤에 대한 허용 한계를. 더 피크가 관찰 될 수 없습니다노 템플릿 (NTC) 및 음성 대조군에 대한 개발. 봉우리는 530 채널에 존재해야하며, 예상 바이러스 부하는 결정 낮고 높은 긍정적 인 컨트롤의 각 공급 업체 및 로트 번호에 따라 조정됩니다.

<ol>
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저자가 공개하는 게 없다.

많은 실험 방법은 혈청 학적 검사, 바이러스 배양, 분자 바이러스 혈증의 분석, 조직 검사 재료의 조직 학적, 그리고 포르말린 고정, 파라핀 - 임베디드 (FFPE) 조직 검사 최근에 설명 된대로, 분자 분석을 포함하여 거대 세포 바이러스의 진단 (CMV) 감염을 사용할 수 있습니다 조직 5,6. 혈청 검사는 진단의 의지가 한 번 만 안정적으로 노출을 식별하고 급성 CMV 감염 7과 잘 상관하지 않?...

임상 검체에서 거대 세포 바이러스 (CMV) 감염의 해석은 매우 중요하다. CMV는 헤르페스 바이러스의 betaherpesvirinae 아과의 구성원입니다. 다른 헤르페스 바이러스와 유사하게, CMV 활성 바이러스 복제 하나의 부족에 의해 특징 영구 또는 잠복 감염을 확립하는 기능을 갖는다. 바이러스의 재 활성화는 질병의 증상 2-4을 동반 할 수 비리 릴리스 특징 활성 바이러스 복제, 선도, 스트레스 또는 다른 면역 억제의 시간 동안 발생할 수 있습니다. 위장 (GI) CMV 질환의 증상은 자주 복통 및 / 또는 혈변 1이 (가) 있습니다. 조직 학적으로 거대 세포 바이러스 위장염의 진단은 헤 마톡 실린 및 CMV 바이러스 흠을 식별 할 수 에오신 (H &amp; E)를 사용합니다. 임상 혐의가 높은 아직 명백한 흠이 발생하지 않습니다되는 경우, 면역 조직 화학 (IHC)는 자주 외래 시험 방법으로 사용됩니다. 그러나, IHC또한 해석이 어려운 (그림 2) 5 만들고, 드문 비 고전 나타나는 세포의 염색 패턴 (모호한)에 의해 방해 할 수 있습니다. 이는 포르말린 고정 파라핀 (FFPE) GI 생검 조직과 GI 생검에서 CMV를 검출하는 정량 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에)로부터 추출 된 DNA를 사용하고자 하였다. 이 기술은 GI 생검에서 거대 세포 바이러스의 검출에 유용한 것으로 표시하고, 모호한 IHC 염색의 경우 5,6에 특히 도움이되었습니다. 또한, qPCR에 또한 6 사용할 수있는 경우 추가 임상 CMV 테스트 데이터와 상관 관계가 표시되었습니다. CMV를 감지하는 qPCR에의 사용은 CMV에 대한 임상 혐의가 높은 경우 초기 진단과 치료로 이어질 수 있지만, H &amp; E 및 CMV IHC는 부정적이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="745">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">1.7 mL microfuge tubes</td>
			<td style="width:195px;">Costar</td>
			<td align="right" style="width:160px;">3620</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">serrated forceps</td>
			<td style="width:195px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:160px;">62086-1S</td>
			<td>Micro Forceps MF-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Tabletop centrifuges (microfuge)</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:160px;">5424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Xylene</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific: X3P</td>
			<td>1 gallon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Ethanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific: ET108</td>
			<td>96-100%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">microtome</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:160px;">RM2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">QIAamp DNA FFPE Tissue Kit</td>
			<td style="width:195px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:160px;">56404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">artus CMV LightCycler PCR ASR</td>
			<td style="width:195px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:160px;">4500025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">CMV LC PCR Supplement Kit</td>
			<td style="width:195px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:160px;">1031873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler centrifuge</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">75005087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler Cooling Block</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">10800058001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler Capping Tool</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">3357317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">Color Compensation Kit</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:160px;">2158850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">LightCycler 20 &#956;L Capillaries</td>
			<td style="width:195px;">Roche</td>
			<td style="width:160px;">1 909 339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:224px;">blades</td>
			<td style="width:195px;">Sakura</td>
			<td style="width:160px;">Fisher Scientific: 4689</td>
			<td>Accu-Edge low profile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qpcr is a sensitive and rapid method for detection of cytomegaloviral dna in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue

그것은 심각한 감염을 개발하기 위해 자신의 더 큰 위험 관련, 위장 (GI) 면역 억제 환자의 기관에 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 감염을 식별하는 데 매우 중요합니다. CMV 감염의 검출을위한 다수의 실험 방법 혈청학, 바이러스 배양, 분자 및 방법을 포함하여 개발되었다. 종종, 이러한 방법은 CMV와 조직의 참여를 반영하고 특히 지역 조직의 참여를 식별하지 않습니다. 따라서 위장관에서 CMV 감염의 검출은 자주 생검 조직의 조직 학적 전통에 의해 이루어집니다. 면역 조직 화학 (IHC)과 함께 헤 마톡 실린과 에오신 (H &amp; E) 염색이 생검 검사의 대들보가 남아있다. H &amp; E와 IHC 때로는 해석이 어려워, 비정형 (모호한) 염색 패턴을 초래한다. 그것은 CMV 정량적 폴리머 라제 연쇄 반응 (qPCR에)이 성공적으로 매우 포르말린 - 고정 파라핀 (FFPE) 조직 검사 조직에서 수행 될 수 있다는 것을 나타내었다민감도와 특이도가 높은. 이 프로토콜의 목적은 임상 실험실 설정에 FFPE 생검 조직에서 CMV의 검출을위한 qPCR에 테스트를 수행하는 방법을 설명하는 것입니다. 이 방법은 GI 조직 검사에서 CMV에 대한 모호한 염색의 경우 환자에 대한 큰 도움이 될 전망이다.

228 조직 블록의 총 모호 CMV IHC와 조직학 및 긍정적 인 면역 조직 화학 (IHC), 18 일을 기준으로 91 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 긍정적 인 사례로 구성되었다 정량적 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에), 79 음의 컨트롤에 의해 테스트되었습니다. 도 2에 도시 된 바와 같이, CMV 양성 케이스 전형적인 CMV 바이러스 개재물 (A) 및 / 또는 양성 IHC 염색 (B)을 보여준 것이다. 음성...

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qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR에 포르말린 고정, 파라핀 - 임베디드 생검 조직에서 Cytomegaloviral DNA의 검출에 대한 민감하고 빠른 방법입니다

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

qpcr-is-sensitive-rapid-method-for-detection-cytomegaloviral-dna

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JoVE Journal

Biology

15.7K 조회수.  Indiana University School of Medicine. This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

비디오: qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

자기 변조 Biosensing 시스템을 사용하여 생물 학적 Assays의 급속한 동차 검색

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

연구

생물학

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

의 파라핀 - 임베디드 및 냉동 섹션 Drosophila 성인 근육

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

유전과 Epigenetic 분석을위한 파라핀 임베디드 재료에서 DNA 추출

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale quantitative analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. The procedure comprises four distinct steps. The first one is the preparation of sections from the FFPE material and microdissection of cells of interest. In the second step the isolated cells are lysed and processed using 'filter aided sample preparation' (FASP) technique. In this step, proteins are depleted from reagents used for the sample lysis and are digested in two-steps using endoproteinase LysC and trypsin. 
After each digestion, the peptides are collected in separate fractions and their content is determined using a highly sensitive fluorescence measurement. Finally, the peptides are fractionated on 'pipette-tip' microcolumns. The LysC-peptides are separated into 4 fractions whereas the tryptic peptides are separated into 2 fractions. In this way prepared samples allow analysis of proteomes from minute amounts of material to a depth of 10,000 proteins. Thus, the described workflow is a powerful technique for studying diseases in a system-wide-fashion as well as for identification of potential biomarkers and drug targets.

Archival formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) clinical samples are valuable material for investigation of diseases. Here we demonstrate a sample preparation workflow allowing in-depth proteomic analysis of microdissected FFPE tissue.

포르말린에서 프로테오믹스 샘플 준비 파라핀 조직에게 고정 및

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

마이크로 RNA<em&gt; 현장에서</em&gt; 포르말린 고정 신장 조직에 대한 하이브리드

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

라이브의 검출<em&gt; 대장균</em&gt; O157 : PMA-qPCR에 의한 H7 셀

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

조직 해리 차동 여과 이식 미토콘드리아의 신속한 분리 및 정제

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.

The goal of this video is to demonstrate how to perform&#160;automated DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) reference standard cell lines and digital droplet PCR&#160;(ddPCR) analysis to detect rare mutations in a clinical setting. Detecting mutations in FFPE samples demonstrates the clinical utility of ddPCR in FFPE samples.

디지털 물방울 PCR은 포르말린 고정 파라핀 포함 된 참조 표준 세포주에서 BRAF의 V600E 돌연변이를 검출하기 위해 채용

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

핵산의 여과 분리 : 간단하고 신속한 DNA 추출 방법

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

RNA 및 DNA 추출 모두 포르말린 고정 파라핀 - 임베디드 조직 코어의 제조

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...