우리는 메르켈 세포 폴리오마 바이러스 감염에 대한 첫 번째 세포 배양 모델을 제시했다. 프로토콜은 진피 섬유아세포의 격리, MCPyV 바이러스 감염의 준비, 면역 형광 염색 및 시상 혼성화에서형화를 포함한다. 이 프로토콜은 바이러스 유전자의 과발현과 관련된 유물을 피하면서 MCPyV 전염성 주기 및 숙주 세포와의 상호 작용을 연구할 수 있게 합니다.
시작하려면 가위 한 쌍을 사용하여 인간의 신생아 포피에서 지방 및 피하 조직을 다듬습니다. 피부 샘플을 반이나 분기로 자릅니다. 항생제 항mycotic로 보충 된 밀리 리터 디스 기반 II NPBS 당 10 밀리그램의 5 밀리리터에 조직을 배치합니다.
하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 배양하십시오. 다음 날, 미세 절 집게를 사용하여 10 센티미터 접시에 진피 층에서 표피를 조심스럽게 분리하십시오. 결과 진피 조직을 15 밀리리터 원내 형질 관에 전달하여 항생제-해부학으로 보충된 FBS 프리 배지에서 밀리리터 콜라게나아제 타입 IV당 2 밀리리터 5밀리리터를 함유하고 있습니다.
시료를 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 배양하고 4~6시간 동안 주기적인 흔들림을 가하면 몇 개의 거시적 조직 골거체만 남게 됩니다. 그 후, 10 밀리리터 파이펫을 사용하여 시료 용액을 10번 위아래로 피펫하여 진피로부터 단일 셀을 방출합니다. 원심 분리기는 180g에서 5분간, 상체를 폐기합니다.
DMEM 배지를 보충하여 해리된 세포를 플레이트. 늦은 오후 또는 저녁에, 씨앗 6 백만 293TT28 세포를 보충 DMEM 매체를 포함 하는 10 센티미터 접시에 세포. 이산화탄소 5%와 섭씨 37도에서 배양합니다.
다음 아침, 세포가 약 50%의 컨실루티,이 세포를 트랜스펙트 66 마이크로리터의 트랜스페트 R17B DNA, 8.4 마이크로그램의 ST 발현 플라스미드 pMtB, 및 9.6 마이크로그램의 LT 발현 플라미드 pADL을 통해 세포를 트랜스펙트한다. 이산화탄소5%로 섭씨 37도에서 하룻밤 사이에 세포를 배양합니다. 다음 날, 전염된 세포가 거의 혼잡할 때, 세포를 트립시로 하고 계속 확장을 위해 15센티미터 접시로 옮기습니다.
그 요리가 거의 혼잡해지면 세포를 새로운 15센티미터 요리 3개로 옮기게 합니다. 그 새로운 요리가 거의 혼잡하게 될 때, 텍스트 프로토콜에 설명 된 대로 세포를 수확. 실온에서 180g의 원심분리기는 5분간.
그런 다음 상체를 제거하고 DPBS 마그네슘의 세포 부피를 추가합니다. 25 마이크로몰라 암모늄 황산염을 추가하고, 그 다음으로 0.5%트리톤 X-100, 0.1%벤조나아제, ATP 의존DNAe의 0.1%를 넣습니다. 잘 섞어서 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 배양하십시오.
다음 날, 15 분 동안 얼음에 혼합물을 냉각. 다음으로, 염화 나트륨의 0.17 부피를 추가합니다. 얼음에 섞고 인큐베이션을 15분 더 기다립니다.
10 분 동안 섭씨 4도에서 12,000g의 원심 분리기. 상체가 명확하지 않은 경우 튜브를 부드럽게 반전시키고 원심 분리를 반복하십시오. 이 후, 새로운 튜브에 상체를 전송합니다.
염화 나트륨 의 0.8 두더지로 보충 DPBS의 1 부피에서 펠릿을 다시 중단. 원심분리기는 섭씨 4도에서 12,000g으로 10분 간. 상체가 명확하지 않은 경우 튜브를 부드럽게 반전시키고 원심 분리를 반복하십시오.
두 개의 수퍼나티와 원심분리기를 섭씨 4도에서 12,000g으로 10분간 다시 결합합니다. 그런 다음 파이펫을 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 iodixanol의 그라데이션을 얇은 벽5 밀리리터 폴리알로머 튜브로 증착합니다. 준비된 iodixanol 그라데이션 위에 명확한 바이러스 함유 상체의 3 밀리리터를 로드합니다.
SW 55 Ti 로터가 있는 원심분리기는 234,000g, 섭씨 16도에서 3.5시간 동안 가속과 감속을 느리게 설정합니다. 초원심분리가 완료되면 실리콘 튜브에서 12개의 분수를 수집합니다. 세포를 유지 및 분리 한 후, 10 밀리리터의 보충 DMEM 및 F12 배지에서 접시에.
세포 용액을 15 밀리리터 튜브로 전송합니다. 원심 분리기 180g에서 2분 동안. 상체를 버리고 밀리리터 당 20,000~40,000개의 세포 밀도에서 보충된 DMEM 및 F12 배지에서 세포를 다시 중단한다.
이어서, 종자 200 또는 400 마이크로리터는 콜라게나아제 타입 IV의 밀리리터당 1밀리그램으로 각각 24 또는 96웰 플레이트의 각 웰로 보충한다. MCPyV 비론 스톡을 영하 80도 냉동고에서 제거하고 얼음 위에 놓아 해동하십시오. 감염될 각 2500에서 5000개의 세포에 대해 iodixanol의 1개의 마이크로리터 당 MCPyV virions의 10억 바이러스 게놈 등가물을 추가합니다.
접시의 측면을 부드럽게 누르고 5 %의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 배양하십시오. 먼저, 10분 동안 PBS에서 4%PFA로 커버 슬립에 세포를 고정한 다음, PBS로 커버 슬립을 두 번 세척하고 세포를 투과화하기 위해 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 70%에탄올로 치료합니다. 다음 날, 에탄올을 프로브 수분 공급 버퍼로 교체하고 실온에서 60분 동안 배양하여 시료를 미리 혼성화합니다.
혼성화가 시작되기 30분 전, 프로브 혼성화 용액의 프로브를 1:500 희석으로 희석하고 섭씨 45도에서 배양합니다. 배큐어가 완료되면, 각 커버 슬립에 대한 현미경 슬라이드에 희석 된 프로브 혼합물의 약 10 마이크로 리터. 각 커버 슬립 셀 면을 각각의 혼성화 믹스 액적에 놓습니다.
자유로운 양의 고무 시멘트를 사용하여 각 커버의 가장자리와 뒷면을 슬라이드로 밀봉합니다. 열 블록의 평평한 쪽에 슬라이드를 설정하고 3 분 동안 섭씨 94도로 가열합니다. 그 후 슬라이드를 가습 챔버로 옮기고 하룻밤 사이에 섭씨 45도에서 배양하십시오.
다음 날, 조심스럽게 고무 시멘트를 벗겨 집게를 사용합니다. 커버 슬립 셀 측을 24 웰 플레이트의 우물에 올려 놓고 실온에서 프로브 워시 버퍼로 세 번 씻습니다. 커버 슬립을 포함하는 각 웰에 200 마이크로리터의 증폭 버퍼를 추가하고 실온에서 30~60분 동안 배양합니다.
한편, 각각 90초 동안 섭씨 94도로 가열한 다음 30분 동안 실온으로 냉각하여 별도의 PCR 튜브에서 프로브를 인식하는 올리고뉴클레오티드 헤어핀두 개 각각을 음침합니다. 1:50의 희석에 증폭 버퍼에 함께 머리핀을 혼합. 다음으로, 12웰 플레이트 뚜껑의 열린 면 위에 파라핀 필름을 스트레치하여 증폭 반응을 위한 표면을 만듭니다.
각 커버 슬립에 대한 파라핀 필름에 헤어핀 혼합물의 파이펫 50-100 마이크로리터 방울. 집게를 사용하여, 조심스럽게 사전 증폭 용액에서 각 커버 슬립을 제거하고 건조 다공성 일회용 닦아에 가장자리를 터치. 각 말린 커버 슬립 셀 면을 증폭 액적에 놓습니다.
플레이트 뚜껑을 가습 챔버로 옮기고 실온과 어둠 속에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 24 웰 플레이트의 우물에 커버 슬립을 반환합니다. 각 웰에 밀리리터 당 0.5 마이크로그램의 농도로 DAPI를 포함하는 5X SSCT를 추가하고 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오.
그 후 실온에서 5X SSCT로 샘플을 두 번 세척합니다. 세척된 커버 슬립을 현미경 슬라이드에 장착하고 반전된 형광 현미경을 사용하여 세포를 분석하고 샘플을 이미지화합니다. 이 연구에서는, 인간 진피 섬유아세포의 거의 균질한 인구는 고립됩니다.
면역형성 염색은 고립된 인간 진피 세포의 거의 100%가 진피 섬유아세포 마커, 바이멘틴 및 콜라겐을 위해 긍정적으로 염색되지만 인간의 포피 케나티노사이클 마커 K14에 대해 부정적임을 보여준다. MCPyV virions는 그 때 생성된 후에 그라데이션의 코어에 집중된 MCPyV virions의 밴드를 시각화한 후에, 500 마이크로리터 분획이 수집되고 MCPyV qPCR은 피크 분획을 식별하기 위하여 수행됩니다. MCPyV에 감염된 HDFs의 면역형염색 이미지는 여기에 표시되며, LT 양성, VP1 양성 또는 LT 및 VP1 양성 세포가 MCPyV 감염에 대해 양성으로 간주됩니다.
셀의 30% 이상이 LT 양성이며 10% 이상은 VP1 양성입니다. 감염된 세포에서 복제된 MCPyV 게놈은 HCR DNA 물고기와 면역형광-HCR DNA FISH를 사용하여 검출됩니다. HCR-DNA FISH는 복제 공장에서 존재하는 MCPyV DNA의 현지화를 드러내지만, 면역형광-HCR-DNA FISH 방법은 복제 센터에서 MCPyV DNA와 LT 단백질의 동시 검출을 허용합니다.
최고의 바이러스 감염 효율을 달성하기 위해, MCPyV는 요오독사놀이 세포에 독성이기 때문에 마이크로리터 당 적어도 2 x 10 ~ 8번째 바이러스 게놈에 집중되는 것이 매우 중요합니다. 진피 섬유아세포의 MCPyV 감염에 이어 면역형광, 면역 차단, 면역포지시비케이션 및 qPCR 기반 분석등을 포함한 많은 분자 생물학적 분석이 수행될 수 있다. 우리가 설명한 감염 시스템은 연구원이 핵 밀매 및 바이러스 성 포장 같이 MCPyV 감염의 단계를 공부하는 가능하게 합니다.
MCPyV는 BSL-2 바이러스입니다, 그러나 실험실 조정에서 달성된 양에 있는 병리학을 위한 그것의 잠재력에 관하여 거의 알려져 있습니다. 따라서, 연구원은 바이러스에 노출을 피하기 위해 예방 조치를 취해야 한다.
