YL에 NIH 교부금 (R43/44CA122444) 및 DOD BRCP 부여 (W81XWH-06-1-0682)에 의해 부분적으로 지원.

1. 샘플, 장비 및 시약 준비 <ol><li> 실내 온도 (25 ° C)에서 16-32 시간 동안 신선한 10 % 중성 포르말린에 고정하고 파라핀에 포함, 두께 3 ~ 4 ㎜의 블록으로 조직 표본을 잘라. FFPE 블록에서 5 ± 1 μm의 두께 섹션으로 FFPE 컷, 슬라이드 및 공기 건조에 섹션을 탑재합니다. 참고 : 슬라이드 최대 3 개월 동안 건조하에 실온에서 저장 될 수있다. 탑재 된 조직 슬라이드는 이전 RNAscope 분석에 1 시간 동안 60 ° C에서 이상 건조에 구운해야합니다. </li><li> 40 ° C.에 하이브리드 오븐을 가지고 습도 제어 트레이에 가습 용지를 넣습니다. 완전히 젖은 가습 용지에 50 ㎖ Dh를 2 O를 추가합니다. 사용하기 전에 적어도 30 분 동안 prewarm에 오븐에 덮여 트레​​이를 삽입합니다. </li><li> 확인 700 ㎖의 1X 전처리 dH보다 2 O.에서 10 배 전처리 솔루션을 희석하여 2 솔루션 (10 NL, pH가 6 구연산 버퍼) 1X 전처리 2 끓여 솔루션과 마이 열오버 비등 방지하면서 100 ~ 104 ° C 사이의 온도를 ntain. </li><li> dH보다 2 O.에서 데워진 50 배 세척 버퍼를 희석하여 3 L 1X 세척 버퍼 (0.1X의 SSC)를 확인 </li><li> 흄 후드 탈 파라핀에 2 × 200 자일 렌 ㎖ 및 100 %의 EtOH 2 × 200 ㎖를 준비합니다. </li><li> 흄 후드 후 염색을 위해 50 % 헤 마톡 염색 용액과 블루 잉 시약 (0.01 % 암모니아수)를 준비합니다. </li><li> 흄 후드 탈수 자일 렌 200 ㎖, 200 ㎖의 70 %, 2 × 200 ㎖의 100 %의 EtOH를 준비합니다. </li><li> 10 분 동안 40 ° C 및 DAB 원체 브라운과 브라운-B를 제외하고, RTU AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, 앰프 5 - 브라운, 그리고 Amp6 - 브라운을 포함하여, 실온으로 RTU 검출에게 키트 시약을 가지고 Prewarm 대상 프로브 . </li></ol> 2. RNAscope 분석 탈 파라핀 및 탈수 베이킹 후, 자주 교반과 함께 2 × 5 분 자일 렌의 조직 섹션을 deparaffinize 및 탈수자주 교반과 함께 2 × 3 분 동안 100 %의 EtOH에. 에어 5 분 동안 건조하고 소수성 장벽 펜 조직 섹션 주위에 소수성 장벽을 그립니다. 전 (前) 처리 <ol><li> 전처리로 한 조직 절편을 배양한다 내인성 퍼 옥시 다제 활성의 담금질을위한 RT에서 10 분 동안, dH보다 2 O. 린스 </li><li> dH보다 2 O. 두번 씻어 RNA 검색을 위해 15 분 동안 비점 온도에서 유지 전처리이있는 조직 절편을 부화 </li><li> dH보다 2 O에 두 번 씻어 HybEZ 오븐에서 단백질 소화를 위해 40 ° C에서 30 분 동안 전처리 3 조직 섹션을 품어 </li></ol> 대상 프로브 하이브리드 대상 프로브 HPV-HR 7 풀은 다음을 포함한다 : HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, 및 58. 개별적으로 세 개의 인접 조직 섹션에 HPV 프로브, 유비퀴틴 C (UBC)와 박테리아 유전자 dapB 프로브를 추가합니다. 2 오븐에서 40 ° C에서 하이브리드시간은 다음 실온에서 2 × 2 분 1X 세척 버퍼에 헹군다. 신호 증폭 <ol><li> 40 ° C에서 30 분 동안 40 ° C, AMP3 (앰프)에서 15 분 동안 40 ° C, AMP2 (배경 감속기)에서 30 분 동안 AMP1 (프리 앰프)와 조직 섹션을 품어하고 AMP4 (라벨 프로브) 15 분 HybEZ 오븐에서 40 ° C에서. 각 혼성화 단계 후, 실온에서 2 × 2 분 1X 세척 버퍼에 헹군다. </li><li> RT에서 15 분 30 분, Amp6에 Amp5와 조직 섹션을 품어. 각 배양 단계 후, 실온에서 2 × 2 분 1X 세척 버퍼에 헹군다. </li></ol> 신호 검출 실온에서 10 분 동안 브라운 - 브라운-B의 동량을 혼합 1:1 DAB 혼합물과 조직 섹션을 품어, dH보다 2 O에 두 번 씻어 Counterstaining <p조직이 보라색을 유지하면서 슬라이드 명확 때까지 클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; RT에서 2 분 50 % 헤 마톡 솔루션을 얼룩 조직 섹션은, dH보다 2 O 씻어. 딥 배에 대한 dH보다 2 O 0.01 %의 암모니아에 슬라이드 및 dH보다 2 O 5 딥에 따라 슬라이드 장착 2 분마다 70 %, 100 % 및 100 %의 EtOH의 조직 절편을 탈수, 크실렌 5 분간, 크실렌 계 장착 매체 마운트.

<ol>
	<li>Parkin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+health+burden+of+infection-associated+cancers+in+the+year+2002.">The global health burden of infection-associated cancers in the year 2002.</a> Int. J. Cancer. 118 (12), 3030-3044 (2006).</li><li>Chaturvedi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+papillomavirus+and+rising+oropharyngeal+cancer+incidence+in+the+United+States.">Human papillomavirus and rising oropharyngeal cancer incidence in the United States.</a> J. Clin. Oncol. 29 (32), 4294-4301 (2011).</li><li>Ang, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+papillomavirus+and+survival+of+patients+with+oropharyngeal+cancer.">Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer.</a> N. Engl. J. Med. 363 (1), 24-35 (2010).</li><li>Smeets, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+algorithm+for+reliable+detection+of+human+papillomavirus+in+paraffin+embedded+head+and+neck+cancer+specimen.">A novel algorithm for reliable detection of human papillomavirus in paraffin embedded head and neck cancer specimen.</a> Int. J. Cancer. 121 (11), 2465-2472 (2007).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J. Mol. Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+regulation+of+NRG1+isoform+expression+by+neuronal+activity.">Specific regulation of NRG1 isoform expression by neuronal activity.</a> J. Neurosci. 31 (23), 8491-8501 (2011).</li><li>Yan, K. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+RNA+in+situ+Hybridization+for+Detection+of+Restricted+Clonal+Expression+of+Low+Abundance+Immunoglobulin+Light+Chain+mRNA+in+B-Cell+Lymphoproliferative+Disorders.">Ultrasensitive RNA in situ Hybridization for Detection of Restricted Clonal Expression of Low Abundance Immunoglobulin Light Chain mRNA in B-Cell Lymphoproliferative Disorders.</a> Am. J. Surg. Pathol. In press, (2013).</li><li>Ukpo, O. C., Flanagan, J. J., Ma, X. J., Luo, Y., Thorstad, W. L., Lewis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-risk+human+papillomavirus+E6/E7+mRNA+detection+by+a+novel+in+situ+hybridization+assay+strongly+correlates+with+p16+expression+and+patient+outcomes+in+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma.">High-risk human papillomavirus E6/E7 mRNA detection by a novel in situ hybridization assay strongly correlates with p16 expression and patient outcomes in oropharyngeal squamous cell carcinoma.</a> Am. J. Surg. Pathol. 35 (9), 1343-1350 (2011).</li><li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptionally-active+high-risk+human+papillomavirus+is+rare+in+oral+cavity+and+laryngeal/hypopharyngeal+squamous+cell+carcinomas--a+tissue+microarray+study+utilizing+E6/E7+mRNA+in+situ+hybridization.">Transcriptionally-active high-risk human papillomavirus is rare in oral cavity and laryngeal/hypopharyngeal squamous cell carcinomas--a tissue microarray study utilizing E6/E7 mRNA in situ hybridization.</a> Histopathology. 60 (6), 982-991 (2012).</li><li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+p16+staining+in+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma:+extent+and+pattern+correlate+with+human+papillomavirus+RNA+status.">Partial p16 staining in oropharyngeal squamous cell carcinoma: extent and pattern correlate with human papillomavirus RNA status.</a> Mod. Pathol. 25 (9), 1212-1220 (2012).</li><li>Bishop, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+transcriptionally+active+high-risk+HPV+in+patients+with+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+as+visualized+by+a+novel+E6/E7+mRNA+in+situ+hybridization+method.">Detection of transcriptionally active high-risk HPV in patients with head and neck squamous cell carcinoma as visualized by a novel E6/E7 mRNA in situ hybridization method.</a> Am. J. Surg. Pathol. 36 (12), 1874-1882 (2012).</li><li>Schache AG, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+novel+diagnostic+standard+in+HPV-positive+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma.">Validation of a novel diagnostic standard in HPV-positive oropharyngeal squamous cell carcinoma.</a> Br. J. Cancer. 108 (6), 1332-1339 (2013).</li><li>Mehrad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Papillary+Squamous+Cell+Carcinoma+of+the+Head+and+Neck:+Clinicopathologic+and+Molecular+Features+With+Special+Reference+to+Human+Papillomavirus.">Papillary Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck: Clinicopathologic and Molecular Features With Special Reference to Human Papillomavirus.</a> Am. J. Surg. Pathol. Jun. , (2013).</li><li>Jordan, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+methods+for+oropharyngeal+cancer+HPV+status+determination+in+US+cooperative+group+trials.">Validation of methods for oropharyngeal cancer HPV status determination in US cooperative group trials.</a> Am. J. Surg. Pathol. 36, 945-954 (2012).</li><li>Hammond, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+Society+of+Clinical+Oncology/College+of+American+Pathologists+guideline+recommendations+for+immunohistochemical+testing+of+estrogen+and+progesterone+receptors+in+breast+cancer+(unabridged+version).">American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer (unabridged version).</a> Arch. Pathol. Lab. Med. 134 (7), 48-72 (2010).</li></ol>

모든 저자는 고급 휴대 진단, 주식 회사의 주식에 의해 자신의 고용

RNAscope HPV 분석은 HPV 관련 머리와 목 편평 상피 세포 암에 현장에서 E6/E7 mRNA를 직접 시각화를 허용했다. RNAscope 분석은 정기적으로 고정 된 종양 조직과 완벽하게 호환 및 조직 병리학 적 상관 관계에 대한 조직 형태 (그림 2)를 유지합니다. 기존의 CISH 방법을 통해 RNAscope 분석의 주요 장점은 특히 배경 잡음 (그림 2C 및 2 층)를 증폭하지 않고 하이브리드 신호 (그림 2B 및 2E)를 증폭한다는 것입니다. 실제로, RNAscope HPV 분석 절차는 8 시간 이내에 완료 될 수 있거나 편리 이틀간 나누었다. RNAscope HPV 분석은 참조 방법 (16)으로서 QRT-PCR을 사용하여 97 %의 민감성 및 93 %의 특이성을 보여주는, 두경부 편평 세포 암종에서 12-16 HPV 상태를 결정하는 데 사용되었다. 기존 CHRHR-HPV DNA에 대한 omogenic ISH는 매우 구체적인이지만 80 % 12 ~의 감도를 가지고 있습니다. 휴대 대리 마커 P16에 대한 면역 조직 화학 (IHC) 염색은 우수한 감도를 보여줍니다 만, 특히 nonoropharyngeal 머리와 목 암 (15)의 거짓 긍정적 인 결과 15,18를 생성 할 수 있습니다. HPV E6/E7 mRNA의 검출을위한 QRT-PCR의 현재 &quot;황금 표준&quot;방법은 실험실 연구에 사용을 제한하는, 최적의 결과를 위해 냉동 조직을 필요로하며, 기술적으로 복잡하다. 또, 그것이 불가능한 조직 병리학으로 HR-HPV E6/E7 mRNA 발현의 상관 관계를 만드는 RNA 추출을 필요로한다. RNAscope 분석의 성공에 대한 몇 가지 중요한 요소가 있습니다. 첫째, 최상의 결과를 위해, 조직은 ASCO / CAP 지침 19에 따라 16-32 시간 동안 실온에서 신선한 10 % 중성 포르말린에 고정되어야한다. 그것을 활성화 이후 두 번째로, HybEZ 오븐은 매우 좋습니다프로브와 혼성화 신호 증폭 단계에 대한 온도 및 습도의 최적 제어를들. 셋째, 각 단계 이전에 초과 잔류 버퍼를 제거하지만, 여전히 이러한 단계를 수행하는 동안 건조 조직 섹션을 유지하는 것이 중요합니다. 여기에 설명 된 매뉴얼 RNAscope 절차는 완전히 상용 슬라이드 자동 염색 시스템 (10)에 자동화되어 있습니다. 이것은 크게 분석 조건과 임상 병리 실험실에서 절약의 소중한 육체 노동의 표준화를 촉진한다. 또, 전용의 이미지 분석 소프트웨어는 자동적 주관성을 제거하고 채점에서 재현성을 개선하는 데 도움이되어야 디지털화 슬라이드상의 세포 염색 신호를 식별하기 위해 열을 개발되었다. 요약하면, RNAscope HPV 분석은 FFPE 조직에서 현장의 HR-HPV E6/E7 mRNA의 성적 증명서의 존재를 감지합니다. 그것은 임상 병리 연구소 용에 익숙한 워크 플로우가조직 섹션에서 이들의 직접 시각화를 허용하여 토리. 그것은 (FFPE) 조직 샘플을 조사하기위한 이상적인 플랫폼을 제공하고, 쉽게 진단 병리 실험실에서 채용 할 수있다.

전 세계적으로 1 모든 암의 약 5 %에 대한 위험이 높은 사람 유두종 바이러스 (HR-HPV) 감염 계정. HPV 관련 인두 암의 발병률은 특히 남성들, 지난 수십 년 동안 증가하고 있습니다. HPV 양성 구강 인두 편평 상피 세포 암 (OPSCC)의 가능성이 향후 20 년간 2 년에 미국에있는 머리와 목 암의 대부분을 구성합니다. HPV에 의해 발생 구인두 편평 상피 세포 암이 유리한 생존과 연관된 종양 HPV 상태는 생존 3에 대한 강력하고 독립적 인 예후 인자됩니다. 바이러스 종양 유전자 E6와 E7의 전사 활성에 대한 증거는 임상 적으로 관련된 HPV 4의 존재에 대한 황금 표준으로 간주된다. 그러나, RT-PCR 기법으로 신선한 종양 조직에서 E6/E7 mRNA의 검출은 일상 임상에서 실용적이지와 연구 실험실에 국한되었다. 최근에, 우리는 근래전자는 포르말린 고정 파라핀 조직 표본 (FFPE) 5-10 단일 RNA 분자 감도 개별 세포에서 다중 검출 할 수 RNAscope라는 새로운 RNA의 ISH 기술을 개발했다. 우리는 단일 분자 검출 5에 대한 증거의 세 가지 라인을 제공했다. 첫째, RNAscope 프로브 설계 및 신호 증폭 시스템은 헬라와 SK-BR-3 세포주의 단일 복사본 HER2 게놈 DNA 표적의 탐지를 허용했다. HER2 게놈 DNA 신호와 비교할 때 둘째, HeLa 세포에서 HER2 mRNA의 신호 점의 형광 농도의 분포는 도트 당 하나의 분자와 일치했다. 셋째, 셀당 HER2 mRNA의 신호 점들의 수는 상기 단일 분자 검출을 지원하는 밀접 용액 기반의 정량 분석​​에 의해 추정 된 HER2 mRNA의 카피 수를 일치. 또한, 형광 현미경이나 시야 현미경 헤 마톡 실린과 DAPI로 핵의 counterstaining는 뭐, 개별 핵의 시각화를 할 수 있습니다ICH 차례로 단일 셀 단위 (10)에 검출 및 RNA 표적을 정량화한다. 일상적인 임상 표본 현장에서 유전자 발현을 분석 할 수있는 능력은 특히 FFPE 조직 섹션 기반의 분석 10, 11, RNAscope 진단 병리를위한 유망한 플랫폼 있습니다. 우리는 유전자형 특정 프로브의 풀을 사용하여 일곱 고위험 HPV의 유전자형 (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, 58)의 E6/E7 mRNA를 검출하는 RNAscope 기반 HPV 분석을 개발했습니다. OPSCC 우리의 최근의 연구는 RNAscope HPV 분석이 FFPE 조직 12-17에 HPV 상태를 결정하는 매우 민감하고 특정이며, 또한 OPSCC (12, 16)에서 예후를 알려 것으로 나타났습니다. RNAscope 기술의 원리는 이전에 5를 설명 하였다. 여기, 우리는 완전한 RNAscope 분석 프로토콜을 설명하고 FFPE 종양 조직 섹션에서 HR-HPV의 검출에있는 그것의 사용을 보여줍니다.

&#160;
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="580">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="39">
			<td height="60" rowspan="2" style="height:60px;width:145px;">SuperFrost Plus slides</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">12-550-15</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:145px;">HybEZ Oven, Tray, and Rack</td>
			<td style="width:145px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:145px;">310011, 310012, 310014</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:145px;">RNAscope 2.0 FFPE Reagent Kit - Brown</td>
			<td style="width:145px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:145px;">310035</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:145px;">RNAscope HPV-HR7 Probe for HPV 16,18,31,33,35,52 and 58, E6/E7 mRNA</td>
			<td style="width:145px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:145px;">312351</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:145px;">ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td style="width:145px;">Vector Laboratory</td>
			<td style="width:145px;">H-4000</td>
			<td style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="80" rowspan="2" style="height:80px;width:145px;">100% EtOH</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">American Master Tech Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">ALREAGAL</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:145px;">Xylene&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">X3P-1GAL</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="80" rowspan="2" style="height:80px;width:145px;">Gill&#8217;s Hematoxylin I</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">American Master Tech Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">HXGHE1LT</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="80" rowspan="2" style="height:80px;width:145px;">Ammonia hydroxide</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">320145-500mL</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="80" rowspan="2" style="height:80px;width:145px;">Cover Glass 24x50 mm</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">12-545-F</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:145px;">Hot Plate</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">11-300-49SHP</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="99">
			<td height="120" rowspan="2" style="height:120px;width:145px;">Drying Oven</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Capable of holding temperature at 60 &#177; 1&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="99">
			<td height="120" rowspan="2" style="height:120px;width:145px;">Water Bath</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">Capable of holding temperature at 40 &#177; 1&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
	</tbody>
</table>

rnascope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma

종양 HPV 검출을위한 &#39;황금 표준&#39;은 종양 조직에서 전사적으로 활성화 고위험 HPV의 데모입니다. 그러나, 정량 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (QRT-PCR)에 의해 E6/E7 mRNA의 검출은 형태학의 상관에 대한 종양 조직 컨텍스트 임계 파괴하고 일상적인 임상에서 채택 될 어려웠다 RNA 추출을 필요로한다. 현장 하이브리드 기술, RNAscope 우리의 최근에 개발 된 RNA는 단일 분자 감도 및 RNA 바이오 마커의 현장 분석에 매우 민감하고 특정 할 수 단일 셀 해상도와 포르말린 고정, 파라핀 - 임베디드 (FFPE) 조직에서 RNA를 직접 시각화를 허용 일상적인 임상 표본. RNAscope HPV의 유전자형 분석은 특정 프로브의 풀을 사용하여 E6/E7 일곱 고위험 HPV의 유전자형의 mRNA (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, 58)를 감지하도록 설계되었습니다. 그것은 우수한 감도를 보여 주었다와 QRT-PCR에 의해 E6/E7 mRNA를 검출 현재 &#39;황금 표준&#39;방법에 대한 특이성. RNAscope에 의해 결정 HPV 상태는 구강 인두 암 환자의 임상 적 결과의 강력한 예후입니다.

RNAscope HPV 분석 워크 플로우 RNAscope 분석 (그림 1) IHC 유사한 매우 능률적 인 워크 플로우가 있습니다. 전처리, 하이브리드, 신호 증폭, 검출 : 그것은 네 가지 주요 단계로 구성됩니다. 그것은 높은 충실도의 신호 증폭 5를 보장하는 고유 한 프로브 설계 전략을 사용한다. RNAscope HPV 분석에서 일곱 HR-HPV 프로브 세트는 모두 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP)에 연결된 동일한 신호 증폭 시스템에서 인식, 풀됩니다. HRP에 의해 형성된 갈색 침전물이 쉽게 표준 밝은 필드 현미경으로 시각화 할 수있는 기판으로 DAB를 사용하여 발색 반응을 촉매로 특정 하이브리드 신호가 감지됩니다. HPV 검출을위한 대표적인 염색 그림 2는 머리와 목 편평 상피 세포 암의 스테인드 FFPE 섹션에서 예제 이미지를 보여줍니다. HPV 양성의 경우 (도우레의 2A), HR-HPV 프로브는 특히 종양 세포에 강한 점 모양의 신호를 감지했습니다. UBC 프로브는 종양 세포와 기질 세포 (그림 2B) 모두에서 다수의 작은 반점이 세포질 신호를 감지했습니다. 세균의 유전자 dapB 프로브는 깨끗한 배경 (그림 2C)를 보여 주었다. 강한 신호가 UBC 프로브 (도 2E)를 이용하여 검출 하였다 반면 HPV 부정적인 경우, HR-HPV 프로브 및 dapB 프로브 모두는 제공된 신호 (도 2D 및 2F)을 검출되지. 이 분석에서, UBC 배경 신호를 음성 대조군으로 조직의 RNA의 품질과 dapB을 평가하는 긍정적 인 제어를 제공합니다. HPV 상태 결정에 대한 점수는 각각의 경우에 대한 세 가지 슬라이드를 검토합니다. 음성 대조군 슬라이드 (dapB) 슬라이드의 염색 수준은 컷오프로 사용됩니다 : HPV 양성은 반점이 세포질 및 / 또는 dabpB 슬라이드의 신호 이상이었다 핵 염색의 존재에 의해 정의된다. <p클래스 = &quot;jove_content&quot;FO : 유지 - together.within 페이지를 = &quot;항상&quot;&gt; <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51426/51426fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51426/51426fig1.jpg" /> 그림 1. RNAscope 분석 워크 플로우의 RNAscope 분석의 흐름도. 그림. RNAscope 분석은 4 가지 주요 단계, 전처리, 대상 프로브 하이브리드, 신호 증폭 및 신호 검출이 포함되어 있습니다. 전체 분석 절차는 8 시간에 완료 할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51426/51426fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51426/51426fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51426/51426fig2.jpg" /> 그림 2. RNAscope 스테인드 슬라이드의 예 이미지. HR-HPV, UBC (양성 대조군) 및 dapB위한 프로브로 염색 FFPE 섹션 (음성 대조군)두 HNSCC 케이스에서. AC. HPV 양성 케이스. 종양 세포에있는 A, HR-HPV E6/E7 mRNA 발현. 삽입, 반점이 신호를 표시하는 40 배 확대. B와 C). DF) HPV 음성 인 경우. D) 각각 HPV E6/E7 mRNA에 대한 염색을 긍정적 인 UBC 염색 (B) 및 dapB (C 마이너스)를 보여주는 인접 조직 섹션 , dapB 음성 대조군 (F)와 유사. E) UBC 긍정적 인 염색. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51426/51426fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

머리와 목의 종양 조직에서 고위험 HPV의 존재는 유리한 결과와 관련이 있습니다. RNAscope라는 현장 하이브리드 기술에서 최근에 개발 된 RNA는 FFPE 조직 섹션에서 HPV E6/E7 mRNA를 직접 시각화 할 수 있습니다.

에 RNAscope<em&gt; 현장에서</em&gt; 헤드 전사적으로 활동 인간 Papillomavirus의 탐지와 목 편평​​ 상피 세포 암

The &#39;gold standard&#39; for oncogenic HPV detection is the demonstration of transcriptionally active high-risk HPV in tumor tissue. However, detection ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

27.1K 조회수.  Advanced Cell Diagnostics, Inc..  머리와 목의 종양 조직에서 고위험 HPV의 존재는 유리한 결과와 관련이 있습니다. RNAscope라는 현장 하이브리드 기술에서 최근에 개발 된 RNA는 FFPE 조직 섹션에서 HPV E6/E7 mRNA를 직접 시각화 할 수 있습니다. 

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Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

구강 편평 세포 암종의 Orthotopic 마우스 모델에서 종양 세포 침략의 다중 광자 이미징

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

연구

의학

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in either sporadic or familial (neurofibromatosis type 2, NF2) forms, both associated with inactivating defects in the NF2 tumor suppressor gene. Treatment for VSs is generally surgical resection or radiosurgery, however the morbidity of such procedures has driven investigations into less invasive treatments. Historically, lack of access to fresh tissue specimens and the fact that schwannoma cells are not immortalized have significantly hampered the use of primary cultures for investigation of schwannoma tumorigenesis. To overcome the limited supply of primary cultures, the immortalized HEI193 VS cell line was generated by transduction with HPV E6 and E7 oncogenes. This oncogenic transduction introduced significant molecular and phenotypic alterations to the cells, which limit their use as a model for human schwannoma tumors. We therefore illustrate a simplified, reproducible protocol for culture of primary human VS cells. This easily mastered technique allows for molecular and cellular investigations that more accurately recapitulate the complexity of VS disease.

Vestibular Schwannomas (VSs) are non-malignant tumors of Schwann cell (SC) origin, associated with mutations in the NF2 tumor suppressor gene. We report a reproducible, efficient protocol for primary human VS cell culture that allows for molecular and cellular experimental manipulation and analysis and recapitulates the heterogeneous nature of human disease.

인간의 전정 신경초종의 차 문화

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and highly vascularized, making it an ideal system for tumor implantation. Furthermore, the CAM contains extracellular matrix proteins such as fibronectin, laminin, collagen, integrin alpha(v)beta3, and MMP-2, making it an attractive model to study tumor invasion and metastasis. Scientists have long taken advantage of the physiology of the CAM by using it as a model of angiogenesis. More recently, the CAM assay has been modified to work as an in vivo xenograft model system for various cancers that bridges the gap between basic in vitro work and more complex animal cancer models. The CAM assay allows for the study of tumor growth, anti-tumor therapies, and pro-tumor molecular pathways in a biologically relevant system that is both cost- and time-effective. Here, we describe the development of CAM xenograft model of hepatocellular carcinoma (HCC) with embryonic survival rates of up to 93% and reliable tumor take leading to growth of three-dimensional, vascularized tumors.

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane CAM Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.

<em&gt; 비켜에서</em간세포 암의 효율적인 이종 이식 모델로&gt; 병아리 융모 막 (CAM) 분석

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local recurrence and distant metastasis. One hypothesis to explain this recurrence is the presence of cancer stem-like cells (CSCs) that present inherent chemo- and radio-resistance. In order to develop new therapeutic strategies, it is necessary to have experimental models that validate the effectiveness of targeted treatments and therefore to have reliable methods for the identification and isolation of CSCs. To this end, we present a protocol for the isolation of CSCs from human HNSCC cell lines that relies on the combination of two successive cell sortings performed by fluorescence activated cell sorting (FACS). The first one is based on the property of CSCs to overexpress ATP-Binding Cassette (ABC) transporter proteins and thus exclude, among others, vital DNA dyes such as Hoechst 33342. The cells sorted with this method are identified as a &#34;side population&#34; (SP). As the SP cells represent a low percentage (&#60;5%) of parental cells, a growing phase is necessary in order to increase their number before the second cell sorting. The next step allows for the selection of cells that possess two other HNSCC stem cell characteristics i.e. high expression level of the cell surface marker CD44 (CD44high) and the over-expression of aldehyde dehydrogenase (ALDHhigh). Since the use of a single marker has numerous limitations and pitfalls for the isolation of CSCs, the combination of SP, CD44 and ALDH markers will provide a useful tool to isolate CSCs for further analytical and functional assays requiring viable cells. The stem-like characteristics of CSCs was finally validated in vitro by the formation of tumorispheres and the expression of &#946;-catenin.

Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).

머리와 목 편평​​ 상피 세포 암의 모집단 갖는 줄기 세포 특성의 분리 및 특성

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of inner ear gene therapy is to find a delivery method which results in consistent transduction efficiency of targeted cell types while minimizing hearing loss. In this study, we describe the posterior semicircular canal approach as a viable method for inner ear gene delivery in neonatal mice. We show that gene delivery through the posterior semicircular canal is able to perfuse the entire inner ear. The easy anatomic identification of the posterior semicircular canal, as well as minimal manipulation of the temporal bone required, make this surgical approach an attractive option for inner ear gene delivery.

In this study, we describe the posterior semicircular canal approach as a reliable method for inner ear gene delivery in neonatal mice. We show that gene delivery through the posterior semicircular canal is able to perfuse the entire inner ear.

신생아 마우스에서 내가 유전자 납품을 위한 후부 반원의 운하 접근

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

In Vivo Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&#232;re's Disease Ears and Normal Hearing Ears

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this patient group but has yet to be confirmed. This protocol describes a method of in vivo evaluation of neural changes especially well suitable for cranial nerve analysis using magnetic resonance imaging (MRI). MD-patients and normal hearing persons were examined in a 3-T MR-scanner using a scan protocol including strongly T2-weighted 3D gradient-echo-sequence (3D-CISS). In the patient group, MD was additionally confirmed using MRI-based assessment of endolymphatic hydrops. Morphometric analysis was performed using a freeware DICOM viewer. Evaluation of cranial nerves included measurements of cross-sectional areas (CSAs) of the nerves at different levels as well as orthogonal diametric measurements.

&lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&amp;#232;re&#039;s Disease Ears and Normal Hearing Ears

To evaluate morphological changes of cranial nerves such as loss of neural structures or swelling of cranial nerves in Meni&#232;re&#39;s Disease (MD) or in healthy persons in vivo, a protocol of evaluation has been developed using magnetic resonance imaging (MRI). Additional MRI-based confirmation of MD was performed.

Vivo에서 Menière의 질병 귀 그리고 정상 청력 귀에 자기 공명 화상 진 찰을 사용 하 여 인간의 두개골 신경의 형태학 분석

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this ...

Porcine As a Training Module for Head and Neck Microvascular Reconstruction

Live models that resemble surgical conditions of humans are needed for training free-flap harvesting and anastomosis. Animal models for training purposes have been available for years in many surgical fields. We used the female (because they are easy to handle for the procedure) Yorkshire pigs for the head and neck reconstruction by harvesting the deep inferior epigastric artery perforator or the superior epigastric artery perforator flap. The anastomosis site (neck skin defect or tracheal wall defect) was prepared via the dissection of the common carotid artery and the internal jugular vein, in which 3.5&#215; loupe magnification was used for anastomosis as we use on human cases in real life. This procedure demonstrates a new training method using a reliable learning model and provides a detailed anatomy in a live scenario. We focused on the ischemia time, harvesting, vessel anastomosis, and designing the flap to fit the defect site. This model improves tissue handling and with the use of proper instruments can be repeated many times so that the surgeon is fully confident before starting the surgery on humans.

Here we present a protocol for the use of the pig superior epigastric artery perforator flap as a learning module for head and neck microvascular reconstruction.

돼지 머리와 목 Microvascular 재건을 위한 훈련 모듈

Live models that resemble surgical conditions of humans are needed for training free-flap harvesting and anastomosis. Animal models for training purposes ...

The Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer

Perineural invasion is a phenotype in which cancer surrounds or invades the nerves. It is associated with poor clinical outcome for head and neck squamous cell carcinoma and other cancers. Mechanistic studies have shown that the molecular crosstalk between nerves and tumor cells occurs prior to physical interaction. There are only a few in vivo models to study perineural invasion, especially to investigate early progression, before physical nerve-tumor interactions occur. The chick chorioallantoic membrane model has been used to study cancer invasion, because the basement membrane of the chorionic epithelium mimics that of human epithelial tissue. Here we repurposed the chick chorioallantoic membrane model to investigate perineural invasion, grafting rat dorsal root ganglia and human head and neck squamous cell carcinoma cells onto the chorionic epithelium. We have demonstrated how this model can be useful to evaluate the ability of cancer cells to invade neural tissue in vivo.&#160;

The Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer

Perineural invasion is an aggressive phenotype for head and neck squamous cell carcinomas and other tumors. The chick chorioallantoic membrane model has been used for studying angiogenesis, cancer invasion, and metastasis. Here we demonstrate how this model can be utilized to assess perineural invasion in vivo.

두경부암의 신경성 침윤을 평가하는 생체내 병아리 융모난토암 막

Perineural invasion is a phenotype in which cancer surrounds or invades the nerves. It is associated with poor clinical outcome for head and neck squamous ...

Learning Modern Laryngeal Surgery in a Dissection Laboratory

Surgery for laryngeal malignancies requires millimetric accuracy from the different endoscopic and open techniques available. Practice of this surgery is almost completely reserved to a few referral centers that deal with a large proportion of this pathology. Practice on human specimens is not always possible for ethical, economic, or availability reasons. The aim of this study is to provide a reproducible method for the organization of a laryngeal laboratory on ex vivo animal models where it is possible to approach, learn, and refine laryngeal techniques. Porcine and ovine larynges are ideal, affordable, models to simulate laryngeal surgery given their similarity to the human larynx in their anatomical layout and tissue composition. Herein, the surgical steps of transoral laser surgery, open partial horizontal laryngectomy, and total laryngectomy are reported. The merging of endoscopic and exoscopic views guarantees an inside-out perspective, which is vital for the comprehension of the complex laryngeal anatomy. The method was successfully adopted during three sessions of a dissection course &#34;Lary-Gym&#34;. Further perspectives on robotic surgical training are described.

The purpose of this paper is to illustrate how to organize a reproducible laboratory for laryngeal surgery on affordable and closely similar animal laryngeal models in order to improve anatomical and surgical knowledge and skills.

해부 실험실에서 현대 후두 수술 배우기

Surgery for laryngeal malignancies requires millimetric accuracy from the different endoscopic and open techniques available. Practice of this surgery is ...

Preparation of Decellularized Kidney Scaffolds in Rats

Tissue engineering is a cutting-edge discipline in biomedicine. Cell culture techniques can be applied for regeneration of functional tissues and organs to replace diseased or damaged organs. Scaffolds are needed to facilitate the generation of three-dimensional organs or tissues using differentiated stem cells in vivo. In this report, we describe a novel method for developing vascularized scaffolds using decellularized rat kidneys. Eight-week-old Sprague-Dawley rats were used in this study, and heparin was injected into the heart to facilitate flow into the renal vessels, allowing heparin to perfuse into the renal vessels. The abdominal cavity was opened, and the left kidney was collected. The collected kidneys were perfused for 9 h using detergents, such as Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate, to decellularize the tissue. Decellularized kidney scaffolds were then gently washed with 1% penicillin/streptomycin and heparin to remove cellular debris and chemical residues. Transplantation of stem cells with the decellularized vascular scaffolds is expected to facilitate the generation of new organs. Thus, the vascularized scaffolds may provide a foundation for tissue engineering of organ grafts in the future.

This protocol introduces a method to develop a scaffold using decellularized rat kidneys. The protocol includes decellularization and recellularization processes to confirm bioavailability. Decellularization is performed using Triton X-100 and sodium dodecyl sulfate.

쥐에 있는 세포탈구형 신장 비계의 준비

Tissue engineering is a cutting-edge discipline in biomedicine. Cell culture techniques can be applied for regeneration of functional tissues and organs ...

Methods Article

에 RNAscope