우리는 인물의 준비 노력이 원고를 준비하는 그녀의 도움 에이미 Thomasson, 그리고 프레드릭 Skarstedt 라이언 크리스티을 인정합니다.

임상 시험 심사위원회의 승인을 받아, 전자 실험실 데이터베이스의 검색은 위장에서 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 감염 사례 조직 병리학 진단 (GI) 생검 (헤 마톡 실린을 나타내는 (FFPE) 블록 및 임베디드 포르말린 고정, 파라핀을 확인하기 위해 수행되었다 에오신 (H &amp; E) 및 / 또는 면역 조직 화학 (IHC)). FFPE GI 생검 조직에서 1. 조직 처리 <ol><li> 사이토 메갈로 바이러스 (CMV)에 대한 FFPE GI 생검 조직 블록을 상환 정량 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에). 이러한 블록을 실온에서 저장된다. </li><li> 블록의 고유 한 식별 번호와 함께 사전 라벨 1.7 밀리리터의 microfuge 튜브. </li><li> 마이크로톰 핸드 휠을 잠급니다. </li><li> 카세트 클램프로 조직 블록 좌석. </li><li> 신선하지 않는 블레이드를 사용하여 마이크로톰에 칼 각도로 블록을 맞 춥니 다. </li><li> 10 μm의 두께 부분을 잘라 마이크로톰을 조정합니다. </li><li> 일의 잠금을 해제전자 핸드 휠 미리 블레이드를 향해 블록. </li><li> 각각의 컷이 조직의 스크롤에 출시 할 수 있도록, 10 μm의 두께 간격으로 블록의 5 부분을 잘라냅니다. 각 스크롤 원하는 생검 조직의 적절한 표현이 포함되어 있는지 확인합니다. </li><li> 마이크로톰 핸드 휠을 잠급니다. </li><li> 포셉으로 만 교차 오염 가능성을 줄이기 위해 파라핀으로 스크롤을 조작주의하면서, 미리 라벨링 원심 분리기 튜브에 조직의 모든 5 스크롤을 배치합니다. 튜브에 뚜껑을 스냅 랙에 다시 배치합니다. </li><li> 마이크로톰에서 조직 블록을 제거합니다. </li><li> 제거하고 잎을 버린다. </li><li> 이전의 조직과 접촉 할 수있는 어떤 표면 또는 장비의 오염을 제거. </li><li> 칼 홀더에 신선한, 사용하지 않는 날을 놓습니다. </li><li> 반복 처리 할 각 추가 블록 1.4-1.14 단계를 반복합니다. 티슈 두루마리 함유의 microfuge 튜브 포까지 실온에서 저장 될 수있다DNA 추출의 전자. </li></ol> FFPE GI 생검 조직의 스크롤 2. DNA 추출 참고 :이 프로토콜이 FFPE 조직의 DNA 추출 키트 (: 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조주의)의 패키지 삽입에서 적응됩니다. <ol><li> 각 샘플의 미세 튜브에 1 ㎖의 크실렌 (MSDS를 참조하십시오주의)를 추가합니다. 적극적으로 10 초 동안 뚜껑과 소용돌이를 닫습니다. </li><li> 구체적으로 다음과 같은 수정과 제조업체의 제품 삽입에 설명 된 DNA 추출을 진행합니다. </li><li> 먼저 각각의 미세 튜브 내부 통제 (IC)의 6 μl를 추가합니다. <ol><li> 1 시간 동안 56 ° C에서 ATL / 단백질 분해 효소 K 용해 배양 한 다음, 1 시간 30 분 동안 99 ° C에서보다는 90 ° C를 품어. </li><li> 최종 DNA 용출 단계 동안, 정중 DNA 정화 컬럼의 뚜껑을 열고 오히려 buffe보다 막의 중앙에 50 μL DNase의 증류 / RNase가없는 물을 적용R은 ATE. 주 : 해당 스토리지 및 시약의 준비를위한 패키지 안내서를 참조하십시오. DNA는 5 FFPE 스크롤에서 추출해야합니다. 실내 온도 (15-25 ℃)에서 모든 원심 분리 단계를 수행합니다. </li></ol></li></ol> CMV 3. qPCR에 <ol><li> 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 프로 시저 <ol><li> CMV 분석 실행을위한 엑셀 PCR 워크 시트를 생성합니다. 이 Excel 워크 시트는 마그네슘과 마스터 믹스를 만들기 위해 필요한 각 시약의 총 금액을 계산합니다. 이 샘플 당 필요한 각 시약의 양을 아래 나열된 배 샘플 및 컨트롤의 수와 곱 하나 (때문에 피펫으로 손실을 보상하기 위해). <ol><li> 양의 각 PCR 반응에 다음과 같은 시약은 표시 다음을 포함한다 : 시약0; 샘플 당 금액 CMV의 LC 마스터 믹스 유리 병 12.5 μL MG 솔루션 노란색 유리 병 2.5 μL 총 양 15.0 μL </li></ol></li><li> 물이나없는 대상 컨트롤 (NTC), 음성 대조군, 낮은 양성 대조군, 높은 긍정적 인 제어, QS3 또는 QS4 하나, 모든 환자의 샘플을, 모든 분석에 포함 실행합니다. 모세 혈관의 순서로 설정해야합니다. </li><li> 4 ℃에서 저장되는 실시간 PCR 기기의 냉각 블록 별을 얻 냉각 블록에 적합한 모세관 튜브를 놓습니다. 모세관 튜브의 표면을 만지지 마십시오. 모세 혈관을 취급 할 때는 항상 장갑을 사용합니다. </li><li> 증폭 생산에 오염되지 않은 깨끗한 후드의 모든 중합 효소 연쇄 반응을 설정TS. <ol><li> 모든 환자 샘플, 플러스 5 컨트롤을 테스트하기 위해 PCR 키트에서 마스터 튜브의 정확한 수를 제거합니다. 하자 마스터 유리 병, 마그네슘 용액 냉각 블록 PCR 등급 물 해동. 각 마스터 유리 병 (12) 시험에 대한 충분한 시약이 포함되어 있습니다. </li><li> 조심스럽게 마스터 유리 병 와동 빠른 최대 속도로 원심 분리기를 회전. </li><li> 하나의 유리 병에 각 마스터 유리 병의 내용을 결합하고 다시 부드럽게 소용돌이. </li><li> 하나의 멸균의 microfuge 튜브에 PCR 워크 시트에 표시된 금액의 마스터 믹스와 마그네슘의 솔루션을 결합합니다. </li><li> 정량 표준 (QS)입니다 위치 5 모세관을 제외하고, 각 모세관 튜브에 부드럽게 나누어지는 마그네슘과 마스터 믹스 15 μl를 섞는다. </li></ol></li><li> 깨끗한 후드에서 처리 후드 Mg를 모세관 및 마스터 믹스를 함유하는 냉각 블록을 이동. </li><li> 마스터의 나머지 30 μL에 내부 통제의 2 μL (IC)를 추가Mg를 섞는다. 위치 5 모세관 (QS에 대한 위치)에 부드럽게 나누어지는 15 μl를 섞는다. </li><li> 물 피펫 10 μL은 해당 모세관 튜브에 DNA, 또는 샘플의 DNA를 제어 할 수 있습니다. 캐핑 도구를 사용하여 모세관 튜브를 모자. </li><li> 실시간 PCR 기기에 블록 / 샘플을 냉각 가라. </li></ol></li><li> 실시간 PCR 장비를 프로그램 (표 1 참조) </li><li> 증폭과 검출은 실시간 PCR 기기에서 수행 <ol><li> 컴퓨터에 로그온 </li><li> 두 악기 아이콘을 클릭하고 소프트웨어에 로그인합니다. </li><li> 실시간 PCR 기기를 켭니다 </li><li> 전면 화면에서 &quot;CMV / EBV&quot;를 클릭하십시오. </li><li> 매크로 마법사의 지시를 따릅니다. </li><li> 소프트웨어에서 메시지가 표시되면 자체 테스트를 실행하는 상자를 선택합니다. 자체 테스트 기기를 사용하고있는 각각 하루에 한 번 수행해야합니다. </li><li> 실행의 이름을 지정합니다. </li><li> LEF 상부에 위치한 샘플 개수를 조정컨트롤과 환자의 합계 페이지 t 코너는 실행에 포함 된 각각의 환자 샘플의 식별 번호를 입력합니다. </li><li> &quot;애비 양의&quot;탭을 클릭합니다. </li><li> &quot;샘플 유형&quot;에서 표준에 해당하는 샘플의 유형을 지정합니다. </li><li> 정량 표준 (QS)의 예상 농도를 입력합니다. </li><li> 쿨러 블록에서 모세관 튜브를 제거하고 (블록 샘플 중 1 냉각 등, 회전 목마에 위치 # 1에 배치해야합니다) 회전 목마의 해당 위치에 배치합니다. </li><li> 악기의 원심 분리기를 눌러 시작으로 회전 목마를 놓습니다. </li><li> 원심 분리기를 열고 회전 목마를 제거합니다. </li><li> 실시간 PCR 기기에 회전 목마를 놓습니다. 뚜껑을 닫습니다. </li><li> 을 눌러 &quot;시작 실행&quot;. </li><li> 실시간 PCR 악기 샘플은 각각의 위치를​​ 확인합니다. 이 검사가 완료 될 때까지 악기에서 멀리 떨어진 곳에서 걷지 않는다 ESPE모세관의 하나가 컨베이어에없는 경우 cially. 악기는이를 기록하고 실행이 계속 될 경우 요청합니다. 떠나기 전에 예라고 응답. </li><li> 실행이 완료되면, 생성 된 보고서를 닫습니다. </li><li> &quot;절대 정량&quot;을 클릭합니다. </li><li> 다음 색상 보정에있는 화살표를 클릭합니다. </li><li> 드롭 다운 상자에서 &quot;색상 선택 보상&quot;을 클릭합니다. </li><li> 실행에 적용 할 최신 색 보정 파일을 선택합니다. </li><li> 상자가 뜨면 확인을 클릭합니다. </li><li> 표준 곡선의 화살표를 클릭합니다. </li><li> 드롭 다운 메뉴에서 &quot;외부 사용&quot;을 선택합니다. </li><li> 가장 최근의 외부 표준 곡선 파일을 선택한 다음 확인을 클릭합니다. </li><li> 농도가 할당되어있는 경우 곡선이 존재하지 일직선를 보장하기 위해 절대 정량 메뉴의 각 곡선 봐. 705/Back (530)의 절대 정량이 자동으로 분석됩니다. </li></ol></li><li> 숨어품 질 관리 <ol><li> 어느 쪽이든 더 자주하는 쪽을 택 시약의 새로운 로트 번호가 수신 될 때마다 새로운 표준 곡선, 또는 6 개월마다, 생성합니다. </li><li> 마그네슘과 마스터 믹스에 각 표준의 10 μl를 추가합니다. 이전에 추출 된 DNA와 키트에 포함 된 기준을 고려한다. </li><li> 마그네슘은 정확한 정량을 보장하기 위해 표준 곡선을 생성하는 데 사용과 마스터 믹스에 각 표준에 대한 내부 통제의 1 μl를 추가합니다. 아니 템플릿 컨트롤 (NTC)에 대한 밀리그램 마스터 믹스에 IC를 추가하지 마십시오. </li><li> 16 데이터 포인트에 달하는, NTC 및 정량 표준 QS 4, 3, 2, 1, 표준 곡선을 생성하기위한 실행 QS4의 1:10 희석의 세 개의 반복을 준비한다. </li><li> 반복 된 표준에 대한 드롭 다운 메뉴 &quot;의 복제&quot;를 선택합니다 </li><li> 채널 530/back의 없음을 선택하고 실행을 분석 할 때 색 보정을 켜 </li><li> &quot;(런) 표준 곡선&quot;에서 &quot;선택 전으로 저장영원한 &quot;곡선의 이름을 지정합니다. 저장할 때 &quot;표준 곡선으로 적용&quot;주석을 입력합니다. </li><li> 결과를 그래프. 그 결과 선형 계수는 0.81 ≥해야합니다. </li><li> 매일 실행의 경우, 런타임에서 컨트롤로 QS3 또는 QS4의 복사본을 포함한다. 현재 외부 표준 곡선은 분석 단계에서 실행으로 가져올 수있다. </li><li> 실행 관리 : DNA 제어, 음성 대조군, 낮은, 높은 양을 제어합니다. 예상 바이러스 부하가 결정하고 각 공급 업체 및 로트 번호에 따라 조정된다. </li><li> 각 샘플에 IC를 추가하고 DNA를 추출하는 동안 제어 할 수 있습니다. </li><li> 컨트롤의 범위 밖으로 떨어질 경우, 받아 들일 수없는 결과를 기록하고, 문제 해결에 대한 분석을 참조하십시오. </li></ol></li><li> 컨트롤의 주파수 <ol><li> NTC, 음, 낮은 양, 양의 높은, 및 표준 제어 : 모든 실행에 포함. </li></ol></li></ol> 참고 : 컨트롤에 대한 허용 한계를. 더 피크가 관찰 될 수 없습니다노 템플릿 (NTC) 및 음성 대조군에 대한 개발. 봉우리는 530 채널에 존재해야하며, 예상 바이러스 부하는 결정 낮고 높은 긍정적 인 컨트롤의 각 공급 업체 및 로트 번호에 따라 조정됩니다.

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저자가 공개하는 게 없다.

많은 실험 방법은 혈청 학적 검사, 바이러스 배양, 분자 바이러스 혈증의 분석, 조직 검사 재료의 조직 학적, 그리고 포르말린 고정, 파라핀 - 임베디드 (FFPE) 조직 검사 최근에 설명 된대로, 분자 분석을 포함하여 거대 세포 바이러스의 진단 (CMV) 감염을 사용할 수 있습니다 조직 5,6. 혈청 검사는 진단의 의지가 한 번 만 안정적으로 노출을 식별하고 급성 CMV 감염 7과 잘 상관하지 않?...

임상 검체에서 거대 세포 바이러스 (CMV) 감염의 해석은 매우 중요하다. CMV는 헤르페스 바이러스의 betaherpesvirinae 아과의 구성원입니다. 다른 헤르페스 바이러스와 유사하게, CMV 활성 바이러스 복제 하나의 부족에 의해 특징 영구 또는 잠복 감염을 확립하는 기능을 갖는다. 바이러스의 재 활성화는 질병의 증상 2-4을 동반 할 수 비리 릴리스 특징 활성 바이러스 복제, 선도, 스트레스 또는 다른 면역 억제의 시간 동안 발생할 수 있습니다. 위장 (GI) CMV 질환의 증상은 자주 복통 및 / 또는 혈변 1이 (가) 있습니다. 조직 학적으로 거대 세포 바이러스 위장염의 진단은 헤 마톡 실린 및 CMV 바이러스 흠을 식별 할 수 에오신 (H &amp; E)를 사용합니다. 임상 혐의가 높은 아직 명백한 흠이 발생하지 않습니다되는 경우, 면역 조직 화학 (IHC)는 자주 외래 시험 방법으로 사용됩니다. 그러나, IHC또한 해석이 어려운 (그림 2) 5 만들고, 드문 비 고전 나타나는 세포의 염색 패턴 (모호한)에 의해 방해 할 수 있습니다. 이는 포르말린 고정 파라핀 (FFPE) GI 생검 조직과 GI 생검에서 CMV를 검출하는 정량 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에)로부터 추출 된 DNA를 사용하고자 하였다. 이 기술은 GI 생검에서 거대 세포 바이러스의 검출에 유용한 것으로 표시하고, 모호한 IHC 염색의 경우 5,6에 특히 도움이되었습니다. 또한, qPCR에 또한 6 사용할 수있는 경우 추가 임상 CMV 테스트 데이터와 상관 관계가 표시되었습니다. CMV를 감지하는 qPCR에의 사용은 CMV에 대한 임상 혐의가 높은 경우 초기 진단과 치료로 이어질 수 있지만, H &amp; E 및 CMV IHC는 부정적이다.

<table><tbody><tr><td>1.7 ml Microfuge tubes</td><td>Costar</td><td>3620</td><td></td></tr><tr><td>Serrated forceps</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>62086-1S</td><td>Micro Forceps MF-1</td></tr><tr><td>Tabletop centrifuges (microfuge)</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher</td><td>Fisher Scientific: X3P</td><td>1 gallon</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>Fisher Scientific: ET108</td><td>96-100%</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA FFPE Tissue Kit</td><td>Qiagen</td><td>56404</td><td></td></tr><tr><td>artus CMV LightCycler PCR ASR</td><td>Qiagen</td><td>4500025</td><td></td></tr><tr><td>CMV LC PCR Supplement Kit</td><td>Qiagen</td><td>1031873</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler centrifuge</td><td>Roche</td><td>75005087</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler Cooling Block</td><td>Roche</td><td>10800058001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler Capping Tool</td><td>Roche</td><td>3357317</td><td></td></tr><tr><td>Color Compensation Kit</td><td>Roche</td><td>2158850</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 20 &amp;mu;l Capillaries</td><td>Roche</td><td>1 909 339</td><td></td></tr><tr><td>Blades</td><td>Sakura</td><td>Fisher Scientific: 4689</td><td>Accu-Edge low profile</td></tr></tbody></table>

qpcr is a sensitive and rapid method for detection of cytomegaloviral dna in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue

그것은 심각한 감염을 개발하기 위해 자신의 더 큰 위험 관련, 위장 (GI) 면역 억제 환자의 기관에 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 감염을 식별하는 데 매우 중요합니다. CMV 감염의 검출을위한 다수의 실험 방법 혈청학, 바이러스 배양, 분자 및 방법을 포함하여 개발되었다. 종종, 이러한 방법은 CMV와 조직의 참여를 반영하고 특히 지역 조직의 참여를 식별하지 않습니다. 따라서 위장관에서 CMV 감염의 검출은 자주 생검 조직의 조직 학적 전통에 의해 이루어집니다. 면역 조직 화학 (IHC)과 함께 헤 마톡 실린과 에오신 (H &amp; E) 염색이 생검 검사의 대들보가 남아있다. H &amp; E와 IHC 때로는 해석이 어려워, 비정형 (모호한) 염색 패턴을 초래한다. 그것은 CMV 정량적 폴리머 라제 연쇄 반응 (qPCR에)이 성공적으로 매우 포르말린 - 고정 파라핀 (FFPE) 조직 검사 조직에서 수행 될 수 있다는 것을 나타내었다민감도와 특이도가 높은. 이 프로토콜의 목적은 임상 실험실 설정에 FFPE 생검 조직에서 CMV의 검출을위한 qPCR에 테스트를 수행하는 방법을 설명하는 것입니다. 이 방법은 GI 조직 검사에서 CMV에 대한 모호한 염색의 경우 환자에 대한 큰 도움이 될 전망이다.

228 조직 블록의 총 모호 CMV IHC와 조직학 및 긍정적 인 면역 조직 화학 (IHC), 18 일을 기준으로 91 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 긍정적 인 사례로 구성되었다 정량적 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에), 79 음의 컨트롤에 의해 테스트되었습니다. 도 2에 도시 된 바와 같이, CMV 양성 케이스 전형적인 CMV 바이러스 개재물 (A) 및 / 또는 양성 IHC 염색 (B)을 보여준 것이다. 음성...

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qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR에 포르말린 고정, 파라핀 - 임베디드 생검 조직에서 Cytomegaloviral DNA의 검출에 대한 민감하고 빠른 방법입니다

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

qpcr-is-sensitive-rapid-method-for-detection-cytomegaloviral-dna

Research

JoVE Journal

Biology

15.7K 조회수.  Indiana University School of Medicine. This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

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Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative tumor of vascular endothelial cells and produces rare B cell lymphoproliferative diseases in the form of pleural effusion lymphomas (PEL) and some forms of multicentric Castleman's disease.3-5 Only 1-5% of cells in KS lesions actively support lytic replication of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), the etiological agent associated with KS, and it is clear that cellular factors must interact with viral factors in the process of oncogenesis and tumor progression.6,7 Identifying novel host-factor determinants which contribute to KS pathology is essential for developing prognostic markers for tumor progression and metastasis as well as for developing novel therapeutics for the treatment of KS.8 The accompanying video details the methods we use to identify host cell gene expression programs altered in dermal microvascular endothelial cells (DMVEC) after KSHV infection and in KS tumor tissue.9 Once dysregulated genes are identified by microarray analysis, changes in protein expression are confirmed by immunoblot and dual labeled immunofluorescence. Changes in transcriptional expression of dysregulated genes are confirmed in vitro by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Validation of in vitro findings using archival KS tumor tissue is also performed by dual labeled immunochemistry and tissue microarrays.8,10 Our approach to identifying dysregulated genes in the KS tumor tissue microenvironment will allow the development of in vitro and subsequently in vivo model systems for discovery and evaluation of potential novel therapeutic for the treatment of KS.

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Host cell factors play a critical role in the establishment and maintenance of Kaposi's sarcoma (KS). We outline methods to identify host cell factors altered in KSHV-infected DMVEC cells, and in KS tumor tissue. Cellular genes altered by virus will serve as potential target(s) for novel therapeutics.

Kaposi의 육종 - 관련 Herpesvirus (KSHV)에 의해 유도된 유전자를 식별 Dysregulated

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

연구

면역학 및 감염병학

Protocol for HER2 FISH Using a Non-cross-linking, Formalin-free Tissue Fixative to Combine Advantages of Cryo-preservation and Formalin Fixation

Morphologic assessment of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples has been the gold standard for cancer diagnostics for decades due to its excellent preservation of morphology. Personalized medicine increasingly provides individually adapted and targeted therapies for characterized individual diseases enabled by combined morphological and molecular analytical technologies and diagnostics. Performance of morphologic and molecular assays from the same FFPE specimen is challenging because of the negative impact of formalin due to chemical modification and cross-linking of nucleic acids and proteins. A non-cross-linking, formalin-free tissue fixative has been recently developed to fulfil both requirements, i.e., to preserve morphology like FFPE and biomolecules like cryo-preservation. Since FISH is often required in combination with histopathology and molecular diagnostics, we tested the applicability of FISH protocols on tissues treated with this new fixative. We found that formalin post-fixation of histological sections of non-cross-linking, formalin-free and paraffin-embedded (NCFPE) breast cancer tissue generated equivalent results to those with FFPE tissue in human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) FISH analysis. This protocol describes how a FISH assay originally developed and validated for FFPE tissue can be used for NCFPE tissues by a simple post-fixation step of histological sections.

Fluorescence in-situ hybridization (FISH) is often required in combination with histopathology and molecular diagnostics for selection of therapy in personalized medicine. A novel non-cross-linking, formalin-free tissue fixative that allows high quality morphologic, molecular and FISH analyses from the same specimen by addition of a post-fixation step before FISH is presented.

H e r 2에 대 한 프로토콜 Cryo 보전 및 포 르 말린 고정의 장점을 결합 하 여 크로스 연결 비, 포 르 말린-무료 조직 정착 액을 사용 하 여 물고기

Morphologic assessment of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples has been the gold standard for cancer diagnostics for decades due to its ...

암 연구학

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of cancer development. By using non-invasive or pre-malignant lesions from patients who later develop invasive disease, gene expression analyses may help identify early molecular alterations that predispose to cancer risk. It has been well described that nucleic acids recovered from FFPE tissues have undergone severe physical damage and chemical modifications, which make their analysis difficult and generally requires adapted assays. MicroRNAs (miRNAs), however, which represent a small class of RNA molecules spanning only up to ~18&#8211;24 nucleotides, have been shown to withstand long-term storage and have been successfully analyzed in FFPE samples. Here we present a 3&#39; barcoded complementary DNA (cDNA) library preparation protocol specifically optimized for the analysis of small RNAs extracted from archived tissues, which was recently demonstrated to be robust and highly reproducible when using archived clinical specimens stored for up to 35 years. This library preparation is well adapted to the multiplex analysis of compromised/degraded material where RNA samples (up to 18) are ligated with individual 3&#39; barcoded adapters and then pooled together for subsequent enzymatic and biochemical preparations prior to analysis. All purifications are performed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), which allows size-specific selections and enrichments of barcoded small RNA species. This cDNA library preparation is well adapted to minute RNA inputs, as a pilot polymerase chain reaction (PCR) allows determination of a specific amplification cycle to produce optimal amounts of material for next-generation sequencing (NGS). This approach was optimized for the use of degraded FFPE RNA from specimens archived for up to 35 years and provides highly reproducible NGS data.

Formalin-fixed paraffin-embedded specimens represent a valuable source of molecular biomarkers of human diseases. Here we present a laboratory-based cDNA library preparation protocol, initially designed with fresh frozen RNA, and optimized for the analysis of archived microRNAs from tissues stored up to 35 years.

회고전 예측에 관한 시퀀싱: 보완 DNA 도서관 준비 프로토콜 포 르 말린 고정 파라핀 포함 RNA 견본을 사용 하 여

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

유전학

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge in the field of virology; in particular for nuclear-replicating persistent DNA viruses that involve animal models for their study. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. Latent virus serves as reservoir, from which it reactivates and induces a new herpetic episode. The cell biology of HSV-1 latency remains poorly understood, in part due to the lack of methods to detect HSV-1 genomes in situ in animal models. We describe a DNA-fluorescent in situ hybridization (FISH) approach efficiently detecting low-copy viral genomes within sections of neuronal tissues from infected animal models. The method relies on heat-based antigen unmasking, and directly labeled home-made DNA probes, or commercially available probes. We developed a triple staining approach, combining DNA-FISH with RNA-FISH&#160;and immunofluorescence, using peroxidase based signal amplification to accommodate each staining requirement. A major improvement is the ability to obtain, within 10 &#181;m tissue sections, low-background signals that can be imaged at high resolution by confocal microscopy and wide-field conventional epifluorescence. Additionally, the triple staining worked with a wide range of antibodies directed against cellular and viral proteins. The complete protocol takes 2.5 days to accommodate antibody and probe penetration within the tissue.

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

We established a fluorescent in situ hybridization protocol for the detection of a persistent DNA virus genome within tissue sections of animal models. This protocol enables studying infection process by codetection of the viral genome, its RNA products, and viral or cellular proteins within single cells.

형광에 의한 신경 조직의 영구 DNA 바이러스의 게놈 및 성적 증명서의 검출 현장에서 하이브리드 면역 염색과 결합

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

신경과학

암 조직 샘플의 종양 유발 요인에 대한 FISH 분석 개선

Robust Detection of Gene Amplification in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Samples by Fluorescence In Situ Hybridization

Focal gene amplification, such as extrachromosomal DNA (ecDNA), plays an important role in cancer development and therapy resistance. While sequencing-based methodologies enable an unbiased identification of ecDNA, cytogenetic-based techniques, such as fluorescence in situ hybridization (FISH), remain time and cost-effective for identifying ecDNA in clinical specimens. The application of FISH in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue samples offers a unique avenue for detecting amplified genes, particularly when viable specimens are not available for karyotype examination. However, there is a lack of consensus procedures for this technique. This protocol provides comprehensive, fully optimized, step-by-step instructions for conducting FISH to detect gene amplification, including ecDNA, in FFPE tissue samples which present unique challenges that this protocol aims to overcome and standardize. By following this protocol, researchers can reproducibly acquire high-quality imaging data to assess gene amplification.

저자 스포트라이트: 암 표본에서 정확한 유전자 증폭 평가를 위한 도구로서의 FISH

This protocol provides a reproducible method to visualize gene amplification in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue specimens.

Fluorescence In Situ hybridization에 의한 포르말린 고정 파라핀 포매 시료에서 유전자 증폭의 강력한 검출

Focal gene amplification, such as extrachromosomal DNA (ecDNA), plays an important role in cancer development and therapy resistance. While ...

Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) infection can lead to Merkel cell carcinoma (MCC), a highly aggressive form of skin cancer. Mechanistic studies to fully investigate MCPyV molecular biology and oncogenic mechanisms have been hampered by a lack of adequate cell culture models. Here, we describe a set of protocols for performing and detecting MCPyV infection of primary human skin cells. The protocols describe the isolation of human dermal fibroblasts, preparation of recombinant MCPyV virions, and detection of virus infection by both immunofluorescent (IF) staining and in situ DNA-hybridization chain reaction (HCR), which is a highly sensitive fluorescence in situ hybridization (FISH) approach. The protocols herein can be adapted by interested researchers to identify other cell types or cell lines that support MCPyV infection. The described FISH approach could also be adapted for detecting low levels of viral DNAs present in the infected human skin.

Here, we present a protocol to infect primary human dermal fibroblast with MCPyV. The protocol includes isolation of dermal fibroblasts, preparation of MCPyV virions, virus infection, immunofluorescence staining, and fluorescence in situ hybridization. This protocol can be extended for characterizing MCPyV-host interactions and discovering other cell types infectable by MCPyV.

메르켈 세포 폴리오 감염 및 탐지

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) infection can lead to Merkel cell carcinoma (MCC), a highly aggressive form of skin cancer. Mechanistic studies to fully ...

A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample that can provide information about antigen coexpression and spatial distribution of the markers. However, a lack of suitable antibodies for formalin-fixed tissues may restrict the nature of markers that can be detected. In addition, the staining method is time-consuming. Here we describe a rapid method to perform multispectral fluorescence imaging on frozen tissues. The method includes the fluorophore combinations used, detailed steps for the staining of mouse and human frozen tissues, and the scanning, acquisition, and analysis procedures. For staining analysis, a commercially available semiautomated multispectral fluorescence imaging system is used. Through this method, up to six different markers were stained and detected in a single frozen tissue section. The machine learning analysis software can phenotype cells that can be used for quantitative analysis. The method described here for frozen tissues is useful for the detection of markers that cannot be detected in FFPE tissues or for which antibodies are not available for FFPE tissues.

We describe a rapid staining method to perform multispectral imaging on frozen tissues.

냉동 조직 섹션의 다스펙트럼 형광 이미징을위한 신속한 방법

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample ...

qPCR에 포르말린 고정, 파라핀 - 임베디드 생검 조직에서 Cytomegaloviral DNA의 검출에 대한 민감하고 빠른 방법입니다

요약

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Kaposi의 육종 - 관련 Herpesvirus (KSHV)에 의해 유도된 유전자를 식별 Dysregulated

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Fluorescence In Situ hybridization에 의한 포르말린 고정 파라핀 포매 시료에서 유전자 증폭의 강력한 검출

Fluorescence In Situ hybridization에 의한 포르말린 고정 파라핀 포매 시료에서 유전자 증폭의 강력한 검출

Fluorescence In Situ hybridization에 의한 포르말린 고정 파라핀 포매 시료에서 유전자 증폭의 강력한 검출

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