이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG)에 의해 지원되었다, 우리는 기술 지원을 Ayele Tsedeke Taddese을 감사드립니다.

1. 유리 바늘의 준비 (그림 1) <ol><li> 주사 바늘 (그림 1A)를 준비하기 위해 825 ㎜의 유리 모세관을 사용합니다. </li><li> 바늘 풀러에 유리 모세관을 놓고 다음과 같은 매개 변수를 사용하여 바늘을 당겨 : 난방 사이클 값 : 463; 사이클 값 당기는 : 230; 속도 : 150 밀리 초; 시간 : 150 밀리 초 (그림 1B). </li><li> 마이크로 미터의 접안 렌즈와 입체경에서 20 μm의 직경 바늘을 생산하는 시계 제조 핀셋 뽑아 유리 모세관 휴식. </li><li> 바늘을 날카롭게하고 20 μm의 경사 (그림 1C 및 1D)를 생산하기 위해 젖은 고무 물레와 선반을 사용합니다. 참고 : 샤프 빗면 바늘 뇌실에 삽입의 용이성을 향상시키고, 따라서 조직에 손상을 최소화하고 천공 근육 바늘 (도 1E-G)의 제거 후에 다시 봉인하는 것을 허용한다. </li></ol> 2. Prepar모르 폴리 솔루션의 ATION <ol><li> 7.5 mM의 최종 농도로 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)에서 동결 건조 된 모르 폴리 용해시켜 모르 폴리 콘텐츠를 준비한다. [자세한 내용은 제조업체의 지침 (재료 표)를 참조]. </li><li> 3.5 MM의 모르 폴리 노 0.5 mM의 엔도 - 포터의 최종 농도 2.8 ㎕의 엔도 - 포터 원액 (1 ㎜) (재료 표 참조) 2.5 μL의 모르 폴리 노 원액 (7.5 mm)를 혼합하여 모르 폴리 노 주입 솔루션을 준비합니다. </li></ol> 3. 모르 폴리 노 주입의 준비 (그림 2) <ol><li> 10 μL microloader 피펫 팁과 마이크로 피펫을 사용하여이 솔루션의 5 μL와 경 사진 유리 바늘을 넣습니다. </li><li> 압축 공기를 넣은 피코 펌프 (그림 2A-C)에 연결된 미세 조작기의 바늘 홀더에 유리 바늘을 삽입합니다. </li><li> 다음 현미경으로 바늘 홀더를 놓고 바늘 만 요구되도록유충 (그림 2A)의 심실에 삽입 한 평면 방향으로 이동합니다. </li><li> 약 45 °에서 주사의 각도를 조정합니다. </li><li> 대기 압력 : 다음과 같이 microinjector 값을 설정 평방 인치 (PSI) 당 20 파운드; 토출 압력 : 15 PSI; 게이트의 100 밀리 초 범위는 1.9의 기간 값 (10.9 밀리 초에 해당). </li><li> 1.5 %의 20 ㎖ (w / v) 겔을 생산하는 표준 마이크로 웨이브를 이용하여 1X PBS에서 융해. 10cm 페트리 접시에 녹은 젤을 붓는다. 일단 경화, 아가로 오스가 진정 유충 (11) (그림 2D 및 2E)을 배치 할 수있는 고랑이되도록 따뜻한 아가로 오스에 홈이 분사 형태를 놓습니다. </li></ol> 4. 주사 (그림 3) <ol><li> 20 ㎎ / L의 tricaine (L-에틸-m-아미노 벤조 에이트 메탄 설포 네이트)가 터치 응답을 중지 할 때까지 수족관 물 100 ㎖에 애벌레를 마취. </li><li> 플라스틱 파스퇴르 pipett를 사용복부 측면은 홈 (그림 3A)의 수직 아가 벽에 향하도록 전자 신중하게 젖은 아가로 오스 금형의 홈에 진정 유충을 전송합니다. </li><li> 심실 멀리 주사 바늘 (그림 3A)에서 향하도록 실체 현미경 아가로 오스 플레이트를 놓습니다. </li><li> 심장 심실에 삽입 바늘을 낮 춥니 다. 만 1 ~ 2 μm의 너무 깊이 바늘 (그림 3B 및 3C)를 삽입되지 않도록주의 심실에 바늘을 삽입합니다. </li><li> 바늘이 삽입되면, 하트 (도 3D 및 3E)의 소거를 허용하도록 간격을 기다리고, 4-6 펄스, 용액의 각 전달 3 NL과 심실로 모르 폴리 용액을 주입. </li><li> 주사 후 바늘 (삽입의 평면에 평행)를 제거하고 조심스럽게 E3 매체의 혈중 알코올 농도로 채워진 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 유충을 전송E3 신선한 배지를 포함하는 페트리 접시로 케이. </li><li> 주입 된 유충을 전송할 때 바늘의 건조를 막기 위해, 1X PBS를 함유하는 페트리 접시로 바늘을 배치. </li><li> 반복 4.1-4.6에게 실험 기간 동안 매일 12 ~ 24 시간을 반복합니다. 참고 : 주사를 반복하는 세포의 모르 폴리 노의 흡수 및 유지 보수를 보장합니다. </li></ol> 5. 주사의 분석 (그림 4) <ol><li> 그들은 터치 응답을 중지 할 때까지 20 ㎎ / L의 tricaine과 수족관 물 100 ㎖에 물고기를 마취. </li><li> 평면 젖은 1.5 %에 옆으로 유충을 배치 E3 매체로 덮여 (w / v) 아가로 오스 플레이트. </li><li> 시야 및 형광 이미징과 실체 현미경을 사용하여 이미지의 애벌레. 참고 : 유충이 투명으로, 플루 오레 태그 모르 폴리 노를 직접 주사 후 동물에 걸쳐 혈관에 형광 녹색으로 표시되어야합니다. 이 형광 추가하여 혈관 조직으로 분산됩니다15 분 (도 4A-4C). </li></ol> 재생 파생물의 6. 평가 <ol><li> 피지 이미지 J 무료 소프트웨어 (http://fiji.sc/Fiji)를 사용하여 촬영 한 이미지를 평가합니다. 재생을 조사하는, 제어 및 모르 폴리 주입 유충에 발생한 회생 성장의 양을 결정하기 위해 라인 추적 툴을 사용한다. </li><li> 이미지를 보정하기 위해, 끌어 주 피지 창에 파일을 드롭하여 피지에있는 원본 이미지 파일 중 하나를 엽니 다. </li><li> 다음의 모든 이미지의 배율을 설정하려면 주 메뉴에서 &quot;분석&quot;로 이동합니다. </li><li> &quot;설정 규모&quot;에 대한 메뉴를 클릭 드롭 다운. </li><li> 이 창에서 체크 박스를 클릭하여 &quot;글로벌&quot;옵션을 설정합니다. </li><li> 이제 드래그 앤 드롭 (단계 6.1 참조)에 의해 다시 회생 성장의 양을 측정하기 위해 화상을 연다. </li><li> 도구 모음에서 &quot;프리 핸드 선택&quot;도구를 선택합니다. </li><li> 측정 할 영역 (FI 둘러싸gures 4J-4L). </li><li> Ctrl 키를 누르면 + M. 이 정사각형 픽셀에 둘러싸인 영역의 값을 보여주는 새로운 &quot;결과&quot;창을 엽니 다. </li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

뇌 실내 주입은 배아 발생 동안 유전자 기능에 영향을주지 않고 전개 또는 신체 항상성의 나중 단계에서 유전자 기능을 테스트하기위한 신속하고 신뢰성있는 평가 방법을 제공한다. 이 기술의 성공을 보장하기 위해, 하나는 네 가지 중요한 점을 알고 있어야합니다 바늘의 중 1) 바늘 크기, 2) 건조, 3) 양을 최소화하고, 진정 솔루션 4) 최소한의 노출 시간. 너무 큰 바늘 심실 손상과 과다 출혈의 원?...

장기와 부속의 재생은 생존과 피트니스에 대한 근본적으로 중요하다 그러나, 사람 등 여러 가지 척추 동물은 재생 능력을 제한했다. 여러 동물 모델은 광범위한 재생 능력을 가지고 존재하지만, 기관 및 부속 기관 재생하는 동안 유전자 기능을 평가하기 위해 유전자 기술을 반전은 매우 제한적이거나 존재하지 않는 남아 있습니다. 따라서 새로운 접근 방식은 이러한 모델 생물에서 중생의 분자 생물학을 해부하는 데 필요합니다. 제브라 피쉬는 여러 유전자 ​​변형 물고기 라인이 세포를 추적하기 위해 존재하기 때문에 셀 때문에 중요한 여러 장기, 조직 및 부속을 다시 생성 할 수있는 능력뿐만 아니라,의뿐만 아니라 기관 및 부속 기관 재생 1, 분자 생물학을 이해하기위한 기초가 튼튼한 모델입니다 유전자를 과발현하는 것은 2, 3를 구성한다. 그러나, 유생 지브라 피쉬의 유전자 억제는 주로 overexpre에 한정누구의 유전자 제품 유전자의 내인성 활성을 반영하지 않습니다 이득의 기능 효과를 얻을 수있는 모든 관심의 유전자 또는 사용할 수없는 지배적 인 음성 구조의 (투약) 소지. 따라서, 구체적으로 녹아웃 또는 넉다운하여 유전자 발현을 제거하는 다른 방법은 이러한 문제를 극복하기 위해 필요하다. TALENS은 유전자 기능을 녹아웃 역방향 유전자 수단으로서 존재하여 표적 유전자 특이; 유전자의 초기 요구 사항이 배아 발달의 추가 진행을 방지하기 때문에,이 녹아웃 전략은 매우 자주 초기 배 발생 중에 기능 평가로 제한됩니다. 따라서, 이러한 TALENS를 사용하여 개발 한 후 재생 또는 기관의 항상성 등의 이상 현상을 연구하는 5 4를 배제한다. 따라서 대체 유전자 제거 전략은 완전히 형성 장기 및 구조 유전자 요건을 평가하는 초기 현상 후 유전자 기능을 대상으로하는 필요가있다. </P&gt; 모르 폴리 노를 주사 몇 성인 장기에 유전자를 대상으로하고, 성인이 핀 6-8의 재생에 효과를 볼되었습니다, 그러나이 방법은 전기 충격이 필요하고 많은 내부 장기로 인해 자신의 위치 나 때문에 전기에 대한 민감성에 하나 electroporate하기 어려운 중단. 직접 분사가 구조적 무결성을 방해 할 수 있기 때문에 또는 크기가 제한되어 있기 때문에 또한, 유충의 일부 조직에 직접 주사하기가 어렵습니다. finfold에 직접 분사 할 수 없기 때문에 유충의 꼬리 지느러미는 하나의 구조입니다. 따라서, 전기 천공 및 직접 분사에 대한 대안은 어느 주입 너무 작아서 또는 일렉트로 수없는 조직에서의 유전자를 표적으로 필요했다. 유생 꼬리 지느러미 재생시 특정 유전자의 기능을 대상으로 억제하기 위해, 우리는 모르 폴리 있도록 기존 기술을 수정 한늦은 무대 애벌레 꼬리 지느러미 재생하는 동안 유전자 기능의 ssessment. 이 방법은 함께 엔도 - 포터의 형질 전환 시약 (10)과 형광 태그가 morpholinos와의 심실 전달 9를 사용한다. 일단 심실에, 모르 폴리 노 - 엔도 - 포터 혼합물을 신속하게 혈관을 통해 유충에 걸쳐 퍼져 대상으로 이전에 불가능했을 조직을 입력합니다. 이 주입법은 특정 조직에서의 유전자를 표적으로하도록 변경 될 수 있으며, 아마도 현재의 유전자의 기능을 억제하는 역 유전 방법 부족한 다른 동물 모델에 적용 할 수있다. 따라서, 즉시 유충 단계에서 일반적으로 기관의 항상성 및 재생하는 동안 유전자의 기능을 연구하는 넓은 범위의 사용 가능성이있는 빠르고 쉬운 방법을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Morpholino with 3&amp;acute;fluorescein tag</td><td>Gene Tools Inc.</td><td>Customized</td><td>More information at www.gene-tools.com</td></tr><tr><td>Endo-Porter</td><td>Gene Tools Inc.</td><td></td><td>More information at www.gene-tools.com</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Serva</td><td>120623</td><td>For pouring plates to place the fish during injections and imaging</td></tr><tr><td>Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate)</td><td>Applichem</td><td></td><td>For anesthesia</td></tr><tr><td>E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; 0.33 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td></td><td></td><td>For larval husbandry</td></tr><tr><td>Petri Dishes</td><td>Sarstedt</td><td>821.472</td><td>For placing the fish during injections and imaging</td></tr><tr><td>Thin Wall Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-3</td><td>For preparing injection needles</td></tr><tr><td>Microloader pipette tips</td><td>Eppendorf</td><td>5,242,956,003</td><td>For loading the needle</td></tr><tr><td>Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml)</td><td>Brand</td><td>747760/ 74775</td><td>For transfering larva</td></tr><tr><td>Flaming/Brown needle puller</td><td>Sutter</td><td></td><td>More information at www.sutter.com</td></tr><tr><td>Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5)</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501985</td><td>To brake the needle before sharpening</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Olympus, Leica, Zeiss</td><td>Varies with the manufacturer</td><td>Part of the whole injection setup</td></tr><tr><td>Fluorescence camera</td><td>Olympus, Leica, Zeiss</td><td>Varies with the manufacturer</td><td>To image the fluorescence after injeciton</td></tr><tr><td>PicoNozzle kit (microinjector holder)</td><td>World Precision Instruments</td><td>5430-12</td><td>For microinjections</td></tr><tr><td>Pneumatic PicoPump (microinjector)</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td>For microinjections</td></tr></tbody></table>

reverse genetic morpholino approach using cardiac ventricular injection to transfect multiple difficult-to-target tissues in the zebrafish larva

제브라 피쉬는 세포와 기관 및 부속 기관 재생의 분자 생물학을 이해하는 중요한 모델입니다. 그러나, 역 유전학을 사용하는 분자 전략은 아직 충분히 제브라 피쉬 배아 후 유생 단계 동안 재생 또는 조직의 항상성의 유전자 기능을 평가하기 위해 개발되지 않은, 그리고 제브라 피쉬의 유충 내에서 여러 조직을 대상으로하기 어렵다. 유전자 특정 morpholinos와의 뇌 실내 주사는 유 전적으로 이러한 단계에서 일시적으로 통제 된 방식으로 zebrafish의 유전자를 표적으로하는 현재의 무능력에 대한 대체 방법을 제공합니다. 이 방법은 이전과 같은 유생의 꼬리 지느러미, 종종 비 침습적 조직 재생을 연구하는 데 사용되는 구조에서와 도달하기 불가능했던 구조 등 신체 전반에 걸쳐 다양한 조직에 완전 분산 모르 폴리 노의 연속 편입 할 수 있습니다. 애벌레 finfold 재생하는 동안 활성화 몇 가지 유전자는 프리젠됩니다성인 척추 조직의 재생에 t, 그래서 애벌레는 성인의 재생을 이해하는 데 유용한 모델입니다. 이 모르 폴리 노 분산 방법은 애벌레 조직의 재생뿐만 아니라 배아 후 조직의 항상성을 조절하는 다른 생리 현상에 필요한 유전자를 빠르고 쉽게 식별 할 수 있습니다. 따라서, 이러한 전달 방법은 배아 발생 후의 유전자 기능의 평가에 시간적 제어에 대한 현재 필요한 전략을 제공한다.

(그림 3A) 등쪽으로 접근하면 날카로운, 경 주사 바늘을 ​​쉽게 제브라 피쉬의 유충의 심장 심실에 배치됩니다. 마음은 바늘 (그림 3B 및 3C)의 존재에도 불구하고 펌핑을 계속하고 혈액의 흐름이 유지됩니다. 조심 주사는 심장 (그림 3E)에 모르 폴리 노의 분사에도 불구하고 심실 또는 심장 수축 (그림 3D)의 형태를 방해하지 않습니다....

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Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva

이러한 유전자의 특정 morpholinos와의 뇌 실내 주사를 사용하여 조직 재생 등의 개발 및 생리 학적 항상성 이후 단계에서 유전자 기능을 평가하는 제브라 피쉬에 대한 적응력이 역 유전 방법.

Zebrafish의 유충의 여러 어려운 대상 조직을 형질 심장 심실 사출을 사용하여 유전 모르 폴리 노의 접근을 반전

The zebrafish is an important model to understand the cell and molecular biology of organ and appendage regeneration. However, molecular strategies to ...

reverse-genetic-morpholino-approach-using-cardiac-ventricular

Research

JoVE Journal

Biology

10.5K 조회수.  Technische Universität Dresden.  이러한 유전자의 특정 morpholinos와의 뇌 실내 주사를 사용하여 조직 재생 등의 개발 및 생리 학적 항상성 이후 단계에서 유전자 기능을 평가하는 제브라 피쉬에 대한 적응력이 역 유전 방법. 

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Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

해부 현미경을 사용하여 시간 경과 영상과 Zebrafish의 신장 개발의 분석 광학 단면에 대한 장착

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

연구

발생학

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

키메라 Zebrafish의 태아의 개별 망막 전구 세포의 형질 전환 유전자 발현의 생체 내 이미징에서 세포 비 자립적 영향을 연구하기 위해

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

생물학

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

모르 올리고 뉴클레오티드의 Cerebroventricular 미세 주입을 사용하여 성인 Zebrafish의 두뇌에서 유전자 발현의 미세 조작

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

신경과학

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

Embryogenesis 동안 중복 기능을 테스트하기 위해 역방향 유전자 접근

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Design and Microinjection of Morpholino Antisense Oligonucleotides and mRNA into Zebrafish Embryos to Elucidate Specific Gene Function in Heart Development

The morpholino oligomer-based knockdown system has been used to identify the function of various gene products through loss or reduced expression. Morpholinos (MOs) have the advantage in biological stability over DNA oligos because they are not susceptible to enzymatic degradation. For optimal effectiveness, MOs are injected into 1-4 cell stage embryos. The temporal efficacy of knockdown is variable, but MOs are believed to lose their effects due to dilution eventually. Morpholino dilution and injection amount should be closely controlled to minimize the occurrence of off-target effects while maintaining on-target efficacy. Additional complementary tools, such as CRISPR/Cas9 should be performed against the target gene of interest to generate mutant lines and to confirm the morphant phenotype with these lines. This article will demonstrate how to design, prepare, and microinject a translation-blocking morpholino against hand2 into the yolk of 1-4 cell stage zebrafish embryos to knockdown hand2 function and rescue these "morphants" by co-injection of mRNA encoding the corresponding cDNA. Subsequently, the efficacy of the morpholino microinjections is assessed by first verifying the presence of morpholino in the yolk (co-injected with phenol red) and then by phenotypic analysis. Moreover, cardiac functional analysis to test for knockdown efficacy will be discussed. Finally, assessing the effect of morpholino-induced blockage of gene translation via western blotting will be explained.

The present protocol describes designing, preparing, and microinjecting a translational-blocking morpholino against a representative cardiac gene; Heart And Neural Crest Derivatives Expressed2 (hand2) into the yolk of newly fertilized zebrafish embryos to knock down gene function. It also shows a transient rescue of these "morphants" by co-injection of mRNA encoding this gene product.

The morpholino oligomer-based knockdown system has been used to identify the function of various gene products through loss or reduced expression.  ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

Morpholinos의 생체내의 Electroporation에서 성인 Zebrafish의 망막에

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

생성중 성인 Zebrafish 테일 핀으로 Morpholinos의 생체내 Electroporation에

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Gene Silencing with Morpholinos

Morpholino-mediated gene silencing is a common technique used to study roles of specific genes during development. Morpholinos inhibit gene expression by hybridizing to complementary mRNAs. Due to their unique chemistry, morpholinos are easy to produce and store, which makes them remarkably cost effective compared to other gene silencing methods.
This video reviews proper experimental design when using these oligonucleotides. Following that, an explanation of morpholino microinjection techniques in zebrafish and the analysis of resulting phenotypes will be discussed. Finally, we showcase examples of specific applications where morpholino technology is used to model developmental disorders or to study tissue regeneration.

Morpholino Technology: Gene Silencing in Zebrafish

Morpholinos를 사용한 유전자 침묵

Morpholino-mediated gene silencing is a common technique used to study roles of specific genes during development. Morpholinos inhibit gene expression by ...